Синтез цитокинов лимфоцитами in vitro у детей в ремиссии ювенильного идиопатического артрита на фоне терапии генно-инженерными биологическими препаратами

Вопрос о том, насколько существенно угнетаются функциональные возможности иммунной системы при проведении длительной иммуносупрессивной терапии, важен для выработки оптимальной тактики ведения больных со многими аутоиммунными заболеваниями, в частности для пациентов с ювенильным идиопатическим артритом (ЮИА). ЮИА — заболевание мультифакториальной природы, протекающее с генерализованным поражением опорно-двигательного аппарата, прогрессирующей костно-хрящевой деструкцией суставов, развитием функциональной недостаточности. Наиболее тяжелая системная форма заболевания сопровождается вовлечением в иммунопатологический процесс внутренних органов с развитием кардита, серозита, интерстициальных поражений легких. В формировании патологических изменений при ЮИА принимают участие многие клеточные популяции, включая В-клетки, Т-клетки, дендритные клетки, макрофаги, моноциты и фибробласты [1, 2]. Таким образом, данное заболевание является следствием нарушения многоуровневого межклеточного взаимодействия. В настоящее время для лечения ЮИА разработаны и широко применяются современные препараты, направленно блокирующие тот или иной этап патологического иммунного ответа — генно-инженерные биологические препараты (ГИБП): ингибиторы TNF-α, анти-В-клеточные препараты, антагонисты рецептора IL-6. Проведенные исследования подтверждают высокую эффективность ГИБП при ревматоидном артрите у взрослых пациентов и детей с ЮИА. Их широкое применение значительно улучшило прогноз и течение ЮИА [3].

В перечне побочного действия многих ранее используемых традиционных схем иммуносупрессивного лечения системного ЮИА с длительным применением гормональной терапии и базовым назначением метотрексата или комбинации метотрексата и циклоспорина одно из первых мест занимали инфекционные осложнения [4–8]. Терапия ГИБП не только более эффективна, но и характеризуется меньшей частотой развития тяжелых нежелательных последствий [9, 10]. Учитывая необходимость длительного (в течение нескольких лет) применения ГИБП, актуальным является изучение способности иммунной системы адекватно осуществлять противоинфекционную защиту в условиях длительной иммуносупрессии.

Все перечисленное определяет важность оценки функционального состояния различных звеньев иммунной системы у детей с ЮИА при проведении длительной иммуносупрессивной терапии современными биологическими препаратами.

Цель исследования — оценить способность лимфоцитов к спонтанному и стимулированному синтезу цитокинов in vitro у детей, находящихся в ремиссии ювенильного идиопатического артрита, на фоне терапии генно-инженерными биологическими препаратами в сочетании с иммуносупрессантами.

Материалы и методы. В исследование были включены 18 пациентов (8 девочек и 10 мальчиков) в возрасте от 2 до 12 лет с различными вариантами ЮИА, получающих иммуносупрессивную терапию по протоколам, принятым в детской ревматологической практике [1, 11]. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия)) и одобрено Этическим комитетом Научного центра здоровья детей Минздрава РФ. От родителей пациентов получено информированное согласие.

В лечении всех детей использовались различные ГИБП: ингибиторы TNF-α (инфликсимаб, адалимумаб, этанерцепт), антитела к рецептору CD20 (ритуксимаб) и антагонисты рецептора IL-6 (тоцилизумаб) в комбинации с метотрексатом. Средняя длительность терапии биологическими агентами составляла 3,8 года. На момент включения в исследование все пациенты находились в состоянии ремиссии болезни в соответствии с критериями Wallace (2011) [12]. У всех на момент исследования не отмечено никаких клинических признаков вторичного иммунодефицита, к которым относятся частые длительно текущие, трудно поддающиеся адекватному этиотропному лечению инфекционно-воспалительные заболевания, в том числе вызванные условно-патогенными микроорганизмами, а также плохое заживление ран, хроническая диарея и мальабсорбция [13].

Контрольную группу составили 12 детей без хронических заболеваний, которые не получали никаких лекарственных препаратов и были обследованы при проведении вакцинопрофилактики. Обе группы были сопоставимы по возрасту и полу.

По дизайну исследование являлось ретроспективным, обсервационным, когортным с группой конт­роля.

Методика исследования. Исследовалась культура цельной крови пациентов с ЮИА и детей контрольной группы по стандартной методике, применяемой для проведения квантиферонового теста (исследование было назначено по клиническим показаниям). У каждого пациента методом стандартной венопункции собирали по 1 мл крови непосредственно в две специальные пробирки. Тестовая пробирка (положительный контроль) содержала сорбированный на стенках фитогемагглютинин (ФГА); пробирка, служившая отрицательным контролем, стимуляторов не содержала. Пробирки инкубировали при температуре 37°С в течение 24 ч, затем центрифугировали 15 мин при 2000 g. После окончания процедуры отбирали плазму в количестве 100 мкл и хранили при температуре –70°С для дальнейшего определения уровня цитокинов.

Концентрацию цитокинов определяли методом проточной флюориметрии с использованием в качестве твердой фазы флюоресцентных меченых микрочастиц на платформе двулучевого лазерного анализатора Bio-Plex 200 (Bio-Rad, США), оснащенного программой Bio-Plex Manager, версия 5.0, с использованием готовых мультиплексных тест-систем того же производителя (панели Bio-Plex Pro Human Cytokine).

Оценивались следующие показатели:

спонтанная и ФГА-индуцированная выработка цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, G-CSF, IFN-γ, TNF-α;

индекс стимуляции (ИС) — отношение уровня продукции цитокинов после стимуляции ФГА к уровню их выработки в культуре нестимулированных клеток.

Обработка данных. Анализ результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). В тексте результаты представлены в виде медианы и 25-го и 75-го квартилей (Q). Статистическую значимость различий независимых переменных определяли с использованием критерия Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при p≤0,05. Направление и силу связи переменных оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена (r). Полученные результаты считали статистически значимыми при p≤0,05.

Результаты. Среди пациентов с ЮИА не отмечено детей со значительной лейкопенией или лимфопенией. Абсолютное число лейкоцитов в момент обследования у всех пациентов находилось в пределах возрастных норм и составляло (6–15)·10⁹/л. Абсолютное количество лимфоцитов составляло (1,5–3,6)·10⁹/л, и только у двух детей было отмечено их умеренное снижение — (1,0–1,4)·10⁹/л.

Уровень спонтанного синтеза IL-2 не имел статистически значимых различий у пациентов с ЮИА и детей группы сравнения (см. таблицу); продукция IL-2 после стимуляции у детей с артритом значимо превышала аналогичные показатели группы сравнения и составила 132,2 (104,8; 266,8) пг/мл. ИС для IL-2 оказался значимо выше у детей с ЮИА.

---

Уровни спонтанной и стимулированной фитогемагглютинином продукции цитокинов у детей с ювенильным идиопатическим артритом и здоровых

---

Уровень спонтанного синтеза IL-4 у пациентов с ЮИА был относительно низким и составил 1,0 (0,4; 1,65) пг/мл при показателях группы сравнения 2,5 (2,1; 2,8) пг/мл (p=0,0006). Стимулированная продукция IL-4 отличалась в обеих группах незначимо, за счет чего ИС для IL-4 у больных детей существенно превысил показатели группы сравнения: 21,3 (6,0; 31,5) и 4,6 (3,8; 5,2) соответственно (p=0,006) (см. таблицу).

Спонтанный синтез IL-6 и IL-8 у детей с ЮИА также был ниже, чем в группе сравнения. При стимулированном синтезе статистически значимых различий между показателями не обнаружено. ИС для IL-6 и IL-8 у детей обеих групп также не имели значимых различий (см. таблицу).

Уровень спонтанного синтеза IL-10 у пациентов с ЮИА и детей контрольной группы значимо не отличался, а уровень стимулированной продукции и ИС оказались статистически значимо ниже показателей группы сравнения.

Спонтанная продукция G-CSF и IFN-γ у пациентов с ЮИА была ниже, чем в контрольной группе. Стимулированный синтез G-CSF и его ИС не имели значимых различий в обеих группах. Стимулированный синтез IFN-γ показал отчетливую тенденцию к повышению в группе пациентов с ЮИА, при этом медиана ИС данного цитокина у них оказалась значимо выше, чем в группе сравнения (39,1 против 8,7 пг/мл; p=0,002).

Медиана спонтанной продукции TNF-α у пациентов с ЮИА была ниже, чем в контрольной группе (33,0 против 111,0 пг/мл; p=0,01), однако значимых различий в стимулированной выработке данного цитокина не выявлено, так же как и различий в ИС.

Для оценки зависимости продукции цитокинов от количества лимфоцитов в пробе был проведен корреляционный анализ, при котором установлена положительная связь между абсолютным числом лимфоцитов в пробе и стимулированной продукцией IL-4 (r=0,5; p=0,02) и IL-6 (r=0,5; p=0,04), а также ИС IL-2 (r=0,6; p=0,003), IL-4 (r=0,5; p=0,04), IL-6 (r=0,7; p=0,003), IL-10 (r=0,5; p=0,04), G-CSF (r=0,7; p=0,001), INF-γ (r=0,5; p=0,02), TNF-α (r=0,6; p=0,004). Статистически значимых корреляций между уровнями продуцируемых цитокинов и уровнем моноцитов крови не обнаружено.

Обсуждение. Патогенетические механизмы системного ЮИА затрагивают многие звенья иммунной системы, связаны с нарушением толерантности к собственным антигенам, результатом которого является активация T- и B-лимфоцитов, а также макрофагов. Эта активация приводит к изменениям продукции многих цитокинов и в свою очередь усиливает патологические клеточные реакции [1, 2].

У 18 обследованных детей наблюдались различные варианты ЮИА, лечение ГИБП проводилось в течение длительного времени. Исследование концентрации цитокинов в культуре цельной крови показало в целом сохраненную способность иммунокомпетентных клеток этих пациентов адекватно реагировать на неспецифическую стимуляцию ФГА. Это особенно наглядно продемонстрировала высокая ФГА-индуцированная продукция IL-2, IL-4, IL-6.

При сопоставлении активности спонтанной и стимулированной продукции цитокинов у детей, получавших длительную терапию ЮИА по современным протоколам с применением ГИБП [1, 11], с аналогичными показателями детей без хронических заболеваний выявлено значимое снижение уровня спонтанного синтеза IL-4, IL-6, IL-8, G-CSF, IFN-γ, TNF-α и отсутствие статистически значимых различий спонтанной продукции IL-2, IL-10. При исследовании культур, стимулированных ФГА, у детей с ЮИА отмечена более высокая продукция IL-2, IL-4, IL-6, сниженная — IL-10 и отсутствие статистически значимых различий в продукции IL-8, G-CSF, IFN-γ, TNF-α. В результате этого вычисленные ИС у детей с ЮИА не отличались от показателей группы сравнения для G-CSF и TNF-α, были статистически значимо выше дляIL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ и снижены для L-10.Отсутствие статистически значимых различий уровней стимулированной продукции IL-8, G-CSF, IFN-γ, TNF-α у больных ЮИА и у детей группы сравнения в сочетании с повышением стимулированного синтеза IL-2, IL-4, IL-6 свидетельствует о сохраненной реактивности организма в условиях длительной иммуносупрессивной терапии без применения глюкокортикоидов.

Поскольку исследовалась культура цельной крови, в выработке цитокинов вместе с лимфоцитами принимали участие и моноциты. Однако статистически значимых корреляций между уровнями продуцируемых цитокинов и уровнем моноцитов в крови не получено. Это позволяет предположить, что вклад моноцитов в активацию синтеза исследованных цитокинов при использовании данной методики оценки был минимальным.

При исследовании цельной крови нельзя исключить колебаний уровня синтеза цитокинов в зависимости от содержания лимфоцитов в каждой конкретной пробе, при этом низкая суммарная продукция может быть связана с лекарственно-индуцированной лимфопенией. В нашем исследовании число лейкоцитов в момент обследования у всех пациентов соответствовало установленным возрастным нормам — (6–15)·10⁹/л; абсолютное количество лимфоцитов у всех пациентов находилось в пределах (1,5–3,6)·10⁹/л, только у двух детей отмечены умеренно сниженные показатели — (1,0–1,5)·10⁹/л. Если предположить, что основной причиной умеренного снижения спонтанной продукции IL-4, IL-6, IL-8, G-CSF, IFN-γ, TNF-α может являться относительно невысокое абсолютное число лимфоцитов в исследованных образцах крови, то стимулированная продукция, не отличающаяся от показателей группы сравнения, и высокие индексы стимуляции говорят не только о сохраненных возможностях, но, по всей видимости, и о повышенной способности лимфоцитов обследованных больных реагировать на антигенную стимуляцию. Это может быть расценено двояко: и как признак отсутствия медикаментозного угнетения функции лимфоцитов, и как возможность активации иммунных реакций (в том числе и обострения основного заболевания) в условиях значительной антигенной стимуляции.

Данные о сохраненной пролиферативной реактивности лимфоцитов в ответ на влияние митогена позволяют говорить о возможности проведения вакцинопрофилактики у больных с ЮИА, находящихся в состоянии клинико-лабораторной ремиссии. В клинических исследованиях [14, 15] было показано, что вакцинация пациентов с ревматоидным артритом против гриппа, дифтерии, столбняка и менингококковой инфекции не приводила к ухудшению клинической ситуации. В то же время было установлено, что одновременное применение поддерживающей иммуносупрессивной терапии в средних возрастных дозах не ингибировало выработку защитных антител при вакцинации против дифтерии [15, 16], коклюша [15, 17], гепатита В [15, 18], гриппа [15, 19]. При вакцинации против менингококковой инфекции дети с ЮИА также продемонстрировали способность к синтезу достаточного уровня защитных антител, хотя иммунный ответ у них был менее напряженным, чем у здоровых сверстников. При этом у детей, получавших анти-TNF-α-терапию в комбинации с метотрексатом, отмечалось более выраженное угнетение иммунного ответа, чем при использовании одного метотрексата [15, 20].

Таким образом, полученный в нашем исследовании сохраненный клеточный ответ на митогенную стимуляцию у пациентов с ЮИА позволяет надеяться, что при проведении их иммунизации в период клинико-лабораторной ремиссии заболевания на фоне длительной терапии ГИБП в комбинации с метотрексатом может быть получен адекватный вакцинальный ответ.

Заключение. Результаты исследования стимулированного синтеза цитокинов лимфоцитами крови in vitro у детей, находящихся в ремиссии ювенильного идиопатического артрита, позволяют сделать вывод о сохраненной способности иммунной системы отвечать на антигенную стимуляцию на фоне длительного лечения генно-инженерными биологическими препаратами. Это является дополнительным преимуществом данного вида терапии и, с нашей точки зрения, может учитываться при принятии решения о тактике ведения детей с ювенильным идиопатическим артритом.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.