Сегодня: 04.10.2023
RU / EN
Последнее обновление: 31.08.2023

Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов

М.С. Макаров, М.В. Сторожева, Н.В. Боровкова

Ключевые слова: тканевые трансплантаты; автофлюоресценция коллагена; адгезия клеток.

Цель исследования — определить возможность оценки биологических свойств тканевых трансплантатов разных типов с помощью анализа уровня автофлюоресценции их коллагеновых волокон.

Материалы и методы. Исследовали тканевые трансплантаты разных типов, приготовленные по известным методикам, часть этих трансплантатов подвергали дополнительным воздействиям, вызывающим структурные изменения коллагена. Анализ препаратов проводили с помощью световой, флюоресцентной и конфокальной микроскопии. Для оценки адгезии клеток человека на тканевых трансплантатах с разным значением автофлюоресценции коллагена использовали фибробласты человека линии М-22 и тромбоциты доноров крови.

Результаты. Автофлюоресценция коллагеновых волокон регистрируется как на нефиксированных, так и на фиксированных образцах тканевых трансплантатов, при этом уровень интенсивности свечения отдельных волокон отражает степень их компактизации. Повреждение исходной структуры коллагена приводит к появлению в составе трансплантатов пикринофильных волокон, которые обладают очень высоким уровнем автофлюоресценции и не выявляются в норме или при деконденсации коллагена в условиях гипотонии. Трансплантаты с интенсивностью автофлюоресценции коллагеновых волокон не более 30 фут-кандел являются высокоадгезивными для фибробластов человека линии М-22 и тромбоцитов доноров, тогда как при уровне 40 фут-кандел и выше их адгезивные свойства резко падают.

Заключение. Анализ автофлюоресценции коллагена дает важную информацию о топографии соединительной ткани, сохранности межклеточного матрикса, а также позволяет оценить его повреждение, в том числе — в нефиксированных тканях и трансплантатах.


При проведении восстановительных и реконструктивных операций все чаще используют аллогенные тканевые трансплантаты. Источником для них могут быть губчатая и кортикальная кость, серозные оболочки (перикард, брюшина, плевра), твердая мозговая оболочка, кожа, кровеносные сосуды [1–3]. В настоящее время аллогенные тканевые трансплантаты активно применяются в травматологии для замещения костных дефектов, в хирургии при герниопластике в качестве фиксирующих антиадгезивных имплантатов, в комбустиологии в виде раневых покрытий [2–5]. Перспективным направлением является использование тканей человека в качестве естественной матрицы при производстве комбинированных трансплантатов [6–8].

Учитывая широкий спектр применения тканевых трансплантатов, особое внимание следует уделять их качеству. Как правило, процедура изготовления тканевого трансплантата включает забор исходной ткани, ее модификацию, стерилизацию и хранение. При этом на каждом из указанных этапов возможно изменение или даже повреждение структуры коллагенового матрикса. Оценить структурную целостность трансплантата можно путем анализа его биомеханических свойств, таких как прочность, упругость, растяжимость [9, 10]. Однако в большинстве случаев оценку качества тканевых трансплантатов проводят с помощью световой микроскопии, используя стандартные гистологические, реже — гистохимические методики [2, 6, 11–13]. В ходе гистологического исследования трансплантата большую роль играет анализ организации компонентов межклеточного матрикса, в первую очередь — коллагеновых волокон, при этом почти не уделяется внимания такому явлению, как автофлюоресценция.

Способность к автофлюоресценции (свечению под действием возбуждающего света в отсутствие специальных флюорохромных красителей) является замечательным свойством коллагена [14, 15], которое определяется его специфическим аминокислотным составом, трехмерной организацией целых молекул, а также комплексов из них (готовых коллагеновых фибрилл или волокон). Поэтому справедливо предположить, что оценка автофлюоресценции коллагена позволит проанализировать внутреннюю топографию тканевых трансплантатов как на стандартных гистологических препаратах, так и при исследовании нефиксированных трансплантатов.

Цель исследования — определить возможность оценки биологических свойств тканевых трансплантатов разных типов с помощью анализа уровня авто­флюоресценции их коллагеновых волокон.

Материалы и методы. Анализ автофлюоресценции коллагена проводили как на гистологических срезах, так и на цельных фрагментах трансплантатов. Исследовали тканевые трансплантаты на основе дермального матрикса (15 разных образцов), перикарда (5 образцов), брюшины (4 образца), твердой мозговой оболочки (4 образца), кортикальной кости (4 образца), которые были изготовлены по известным методикам [3, 4, 16, 17], а также образцы кожи и аорты доноров тканей (по 5 образцов), жидкий коллаген 1-го типа из сухожилий человека и коллагеновые повязки на его основе (10 образцов). Кроме того, исследовали автофлюоресценцию коллагеновых волокон в составе трансплантатов, подвергавшихся дополнительным воздействиям, вызывающим структурные изменения коллагена. Для этого анализировали гистологические препараты следующих типов: нативная кожа доноров тканей (контроль), кожа доноров тканей после 4 ч инкубации в дистиллированной воде (сильная гипотония), кожа доноров тканей после 14 сут хранения в питательной среде для клеток DMEM при 37°C, дермальный матрикс [16], дермальный матрикс, подшитый подкожно лабораторным мышам, через 28 сут эксперимента. Все трансплантаты произведены в отделении консервирования тканей НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. Гистологические препараты исследовали с помощью световой и флюоресцентной микроскопии, цельные фрагменты трансплантатов — с помощью флюоресцентной и конфокальной микроскопии. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону.

Для оценки адгезии клеток человека на тканевых трансплантатах с разным значением средней интенсивности свечения коллагена (mean fluorescence activiti, MFIкол) использовали фибробласты человека линии М-22 и тромбоциты доноров крови. Фибробласты линии М-22 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США) на 6-луночных планшетах Costar (Corning, США), содержавших образцы трансплантатов, при 37°С и концентрации CO2 5% в течение 3–5 сут. В качестве источника тромбоцитов использовали тромбоцитные концентраты, полученные у доноров крови путем автоматического афереза и содержавшие не менее 50% тромбоцитов с гранулами (структурно и функционально полноценные тромбоциты) от их общего числа в пробе. Оценку содержания тромбоцитов с гранулами проводили с помощью оригинального метода, основанного на витальном окрашивании тромбоцитов [17]. Для определения адгезии тромбоцитов на трансплантатах чашки Петри с 2 мл тромбоцитного концентрата и фрагментами тканевых трансплантатов помещали в термостат при 37°С и выдерживали в течение 0,5–1 ч. Для выявления адгезировавших фибробластов М-22 и тромбоцитов применяли разработанные нами методы, основанные на окрашивании клеток витальными флюо­рохромными красителями [17, 18] с дальнейшим их анализом на флюоресцентном микроскопе.

В работе использовали конфокальный микроскоп Nikon Eclipse 80i, совмещенный с флюоресцентной лампой Nikon Intesilight C-HGFi (Nicon Corporation, Япония).

Регистрацию автофлюоресценции коллагена в нефиксированных тканях проводили при синем светофильтре (λ возбуждения — 380–420 нм, λ эмиссии — от 450 нм, время экспозиции — 1 с), в гистологических препаратах — при красном светофильтре (λ возбуждения — 510–560 нм, λ эмиссии — от 575 нм, время экспозиции — 1 с).

Для количественной характеристики автофлюоресценции коллагеновых волокон использовали показатель MFIкол, который определяли тем же методом, что и при анализе свечения витально окрашенных клеток [18]. Полученные цифровые фотографии переносили в программу Adobe Photoshop 8, выделяли отдельные изображения коллагеновых волокон и определяли интенсивность их флюоресценции в фут-канделах.

Полученные статистические данные обрабатывали с помощью методов вариационной статистики с использованием пакета программ Microsoft Excel 2000. Вычисляли средние арифметические значения (M) и среднеквадратичные отклонения (σ).

Результаты и обсуждение

Анализ автофлюоресценции готовых коллагеновых трансплантатов. Автофлюоресценцию коллагена регистрировали как на цельных фрагментах обследованных трансплантатов, так и на гистологических препаратах, что позволяло видеть контуры коллагеновых волокон, их толщину и ориентацию. На примере геля коллагена 1-го типа, выделенного из сухожилий трупного донора, наблюдали отдельные фибриллы и волокна разного диаметра (рис. 1), при этом более толстые пучки коллагеновых фибрилл имели более высокий уровень автофлюоресценции. Значение MFIкол отдельных фибрилл варьировало от 8 до 15 фут-кандел, целых коллагеновых волокон — от 20 до 25 фут-кандел, фибриллы почти не контактировали друг с другом. В составе коллагеновых повязок почти весь коллаген был уже собран в волокна, чей уровень MFIкол также составлял 20–25 фут-кандел, т.е. можно говорить, что в процессе лиофилизации коллагеновых повязок наблюдалась компактизация коллагена. В тканевых трансплантатах значение MFIкол чаще всего было выше 25 фут-кандел (см. таблицу), достигая наибольшего уровня в трансплантатах твердой мозговой оболочки и кортикальной кости, содержавших очень плотные и толстые волокна. Таким образом, параметр MFIкол предоставляет возможность оценивать степень компактизации коллагеновых волокон в составе трансплантатов разных типов.


makarov-ris-1.jpg Рис. 1. Автофлюоресценция выделенных волокон коллагена 1-го типа из сухожилий доноров тканей; ×400

makarov-tablitsa.jpg Адгезивные характеристики тканевых трансплантатов в зависимости от интенсивности автофлюоресценции коллагеновых волокон

С другой стороны, уровень ком­пактизации коллагена исходной тка­ни может быть изменен при после­дующих воздействиях, в хо­де процедур изготовления тран­сплан­тата. Ис­поль­зование ткане­вых транс­план­татов как в клини­ческой практике, так и при клеточно-тканевом ин­жиниринге часто под­разумевает контакт транс­плантата с факто­ра­ми, способными влиять на струк­туру и топографию колла­геновых волокон в его составе. В насто­я­­щее время очень часто при­ме­няется проце­дура девитали­за­ции транс­план­та­тов (удаление клеточ­ных элементов из их состава) [3–6]. Производство де­витализи­рованных коллагеновых мат­рик­сов основано на исполь­зовании детергентов, растворов с высокой ионной силой и других химически активных веществ, по­тенциально способных нарушить исходную структуру кол­лагена и его топографию.

В настоящей работе влияние девитализации ис­сле­довали на гис­то­логических препаратах дер­мального матрикса, используя в качестве контроля препараты исходной (нативной) кожи доно­ров тканей. Установлено, что в исходной коже химическая фикса­ция трансплантатов значимо не влияла на уровень MFIкол — на гистологических препаратах кожи доноров тканей можно отчетливо наблюдать автофлюоресценцию коллагена по всей площади среза (рис. 2), при этом наиболее интенсивное свечение отмечено у самых крупных волокон (35–40 фут-кандел). Параллельно регистрировали слабое остаточное свечение цитоплазмы клеток, что может быть обусловлено действием фиксатора формалина, который способен усиливать флюоресценцию. На препаратах дермального матрикса отмечено снижение автофлюо­рес­це­нции основной части волокон (до 28 фут-кандел), хотя в проходящем свете видимые изменения коллагеновых структур не выявлялись (рис. 3, а). Наряду с этим можно было обнаружить фрагменты очень ярких волокон с уровнем MFIкол свыше 60 фут-кандел (рис. 3, б, г), хотя при окрашивании гематоксилином и эозином такие волокна имели стандартную окраску, т.е. интенсивность автофлюоресценции здесь не была связана с компактизацией волокон. При окраске по Ван-Гизону волокна с MFIкол 60 фут-кандел имели не характерный красный, а бледно-желтый или бледно-оранжевый цвет (рис. 3, в), т.е. были пикринофильными (адсорбирующими пикрин, желтый компонент красителя), чего никогда не наблюдалось в препаратах нативной кожи (см. рис. 2).


makarov-ris-2.jpg

Рис. 2. Нативная кожа доноров тканей:

а, в — окраска гематоксилином и эозином; б, г — автофлюоресценция коллагеновых волокон; ×100 (верхний ряд) и ×400 (нижний ряд)

makarov-ris-3.jpg Рис. 3. Дермальный матрикс, полученный из кожи доноров тканей:

а, в — окраска по Ван-Гизону; б, г — автофлюоресценция коллагеновых волокон; ×100 (верхний ряд) и ×400 (нижний ряд); стрелками указаны пикринофильные волокна


В клеточной биологии пикринофилия волокон рассматривается как явный признак деградации коллагена, нарушения его исходной структуры [19], т.е. в ходе процедуры получения дермального матрикса происходит необратимое разрушение части коллагеновых волокон. Примечательно, что во флюо­рес­центном микроскопе при стимуляции авто­флюо­ресценции коллагена пикринофильные волокна различимы гораздо лучше, чем в проходящем свете, даже при использовании окраски по Ван-Гизону. Это показывает, что на основе анализа авто­флюоресценции появляется возможность выявления сильно поврежденных волокон в составе трансплантатов, чей уровень MFIкол в норме не превышает 60 фут-кандел. Отметим, что пикринофильные волокна практически всегда присутствовали в образцах дермального матрикса, однако их количество на единицу объема значительно варьировало. Можно заключить, что использованная в нашей работе технология девитализации кожи не нарушает общей топографии коллагена в ее составе, однако способна вызвать деградацию отдельных волокон, а также их частичную деконденсацию.

Влияние дополнительных воздействий на уро­­вень автофлюоресценции коллагеновых транс­­плантатов. На примере геля коллагена 1-го типа было установлено, что выделенные коллагеновые фибриллы не содержат структур с MFIкол 60 фут-кандел. Дальнейшие исследования показали, что инкубация цельных трансплантатов в условиях сильной гипотонии также не приводит к образованию в них пикринофильных волокон. Так, после инкубации образцов кожи тканевых доноров в дистиллированной воде волокна с MFIкол 60 фут-кандел не выявлялись, напротив, наблюдалось снижение интенсивности автофлюоресценции до 15 фут-кандел (рис. 4, а), т.е. в данном случае происходила деконденсация коллагеновых пучков без химической деградации коллагена. С другой стороны, после длительного хранения лоскутов кожи при 37°C волокна с MFIкол 60 фут-кандел выявлялись по всему объему дермы (рис. 4, б), что свидетельствует о полном химическом разрушении коллагена дермы. Оно могло быть обусловлено действием многих протеолитических ферментов, выделяемых разрушающимися клетками в процессе хранения.


makarov-ris-4.jpg

Рис. 4. Образцы кожи доноров тканей в условиях гипотонии (а) и после длительного хранении при 37°C (б); автофлюоресценция коллагеновых волокон; ×400


Лизис коллагеновых волокон особенно отчетливо виден при исследовании фрагментов дермального матрикса, подкожно подшитых мышам. Через 28 сут исследования у большинства животных отмечена интенсивная инфильтрация дермального матрикса клетками воспаления по всему объему трансплантата (рис. 5, а), при этом все волокна в его составе имели MFIкол от 60 до 90 фут-кандел (рис. 5, б), что говорит о тотальной деградации коллагена. Однако подобная картина наблюдалась не всегда — у некоторых мышей степень инфильтрации дермального матрикса клетками воспаления была низкой (рис. 5, в) и, соответственно, число волокон с MFIкол 60 фут-кандел было значительно меньше, а в отдельных случаях не превышало их исходного уровня в трансплантате (рис. 5, г). Это говорит о том, что потенциально существует возможность приживления аллогенного и ксеногенного дермального матриксов. При этом остается невыясненным, влияет ли уровень пикринофильных волокон в исходном трансплантате на его конечную приживаемость in vivo. Данный вопрос требует дальнейшего исследования.


makarov-ris-5.jpg Рис. 5. Дермальный матрикс, подшитый подкожно лабораторным мышам, через 28 сут эксперимента с высокой (а, б) и низкой (в, г) степенью инфильтрации клетками воспаления: слева — окраска по Ван-Гизону, справа — автофлюоресценция коллагеновых волокон; ×100

Адгезивная активность клеток на коллагеновых трансплантатах с разным уровнем автофлюоресценции. Незави­си­мо от того, ставится или нет задача полного приживления тканевого трансплантата, большое значение имеет оценка его биосовместимости с нормальными клетками и тканями. В первую очередь это подразумевает отсутствие токсического действия на культивируемые диплоидные клетки человека [6, 10–11, 20]. Кроме того, важным свойством тканевых трансплантатов являются их адгезивные характеристики. В зависимости от поставленных целей требования к адгезивности трансплантатов могут варьировать. Так, при клеточно-тканевом инжиниринге, производстве комбинированных биотрансплантатов используемая в их основе коллагеновая матрица должна быть высокоадгезивной для клеток. Напротив, при ряде хирургических вмешательств, таких как герниопластика, тканевые трансплантаты должны обладать антиадгезивными свойствами. На примере использования линии диплоидных клеток человека (фибробласты М-22) и тромбоцитов человека нами выявлено, что адгезивность коллагеновых матриксов зависит в том числе и от плотности упаковки коллагена в их составе (см. таблицу). Максимально выражены адгезивные свойства у трансплантатов с MFIкол 30 фут-кандел, т.е. именно такие коллагеновые трансплантаты наиболее пригодны для использования в качестве матрицы при создании клеточно-тканевых конструкций. Адгезивность трансплантатов резко падает при MFIкол, равном 40 фут-кандел и выше, — на таких трансплантатах слабо адгезировали фибробласты и совсем не адгезировали тромбоциты. Клетки обоих указанных типов полностью отсутствовали in vitro на образцах трансплантатов твердой мозговой оболочки, которые в настоящее время считают весьма перспективными при лапароскопической герниопластике, пластике передней брюшной стенки при лечении вентральных грыж [1]. Вместе с тем есть данные, что трансплантаты на основе твердой мозговой оболочки могут быть in vitro заселены хондробластами человека [5], т.е. по отношению к хондробластам твердая мозговая оболочка не обладает антиадгезивными свойствами. Таким образом, при оценке биосовместимости тканевых трансплантатов с помощью клеточных культур необходимо в том числе учитывать тип используемых клеток.

Заключение. Анализ автофлюоресценции позволяет не только выявить коллагеновые волокна в составе соединительных тканей, но также оценить их структурную целостность и компактность. В отсутствие специального окрашивания флюорохромами регистрация автофлюоресценции коллагена может дать важную информацию о топографии соединительной ткани, сохранности межклеточного матрикса, а также позволит оценить его повреждение, в том числе — в нефиксированных тканях и трансплантатах. Это создает возможность динамического анализа коллагеновых структур при работе с клеточными культурами invitro, при разработке и изготовлении новых типов комбинированных биотрансплантатов.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.


Литература

  1. Ермолов А.С., Македонская Т.П., Радыгина М.В., Яр­цев П.А., Титова Г.П., Петухова М.Н., Папанинов А.С., Кис­лицына О.С., Андреев Ю.В. Оценка возможности ис­­пользования тканевых трансплантатов в абдоми­наль­ной хирургии. Хирург 2015; 2: 47–60.
  2. Кармадонов А.В., Подолужный В.И., Зайков И.Н. Применение модифицированного ксеноперикарда при «ненатяжных» пластиках грыж передней брюшной стенки. Сибирский медицинский журнал (Томск) 2008; 23(2): 28–32.
  3. Александров В.Н., Хубулава Г.Г., Леванович В.В. Тканеинженерные сосудистые трансплантаты. Педиатр 2015; 6(1): 87–95.
  4. Хватов В.Б., Свищев А.В., Ваза А.Ю., Боров­ко­ва Н.В., Миронов А.С., Похитонов Д.Ю., Андреев Ю.В. Способ изготовления лиофилизированного аллотранс­плантата кости. Трансплантология 2016; 1: 13–18.
  5. Schug-Pass C., Sommerer F., Tannapfel A., Lippert H., Köckerling F. The use of composite meshes in laparoscopic repair of abdominal wall hernias: are there differences in biocompatibily? Surg Endosc 2008; 23(3): 487–495, https://doi.org/10.1007/s00464-008-0085-8.
  6. Bobrova M.M., Safonova L.А., Agapova О.I., Krasheninnikov M.E., Shagidulin M.Yu., Agapov I.I. Liver tissue decellularization as a promising porous scaffold processing technology for tissue engineering and regenerative medicine. Sovremennye tehnologii v medicine 2015; 7(4): 6–13, https://doi.org/10.17691/stm2015.7.4.01.
  7. Pokhitonov D.Y., Borovkova N.V., Filippov O.P., Klyukvin I.Y., Khvatov V.B., Ponomaryov I.N., Shugai S.V., Andreev Y.V., Smirnov S.V., Zhirkova E.A. Experimental substantiation and clinical use of a combination of dermal matrix with allogenic or autologous cells for the treatment of extensive traumatic wounds. Bull Exp Biol Med 2014; 157(5): 705–710, https://doi.org/10.1007/s10517-014-2647-1.
  8. Monteiro G.A., Rodriguez N.L., Delossantos A.I., Wagner C.T. Short-term in vivo biological and mechanical remodeling of porcine acellular dermal matrices. J Tissue Eng 2013; 4: 204173141349018, https://doi.org/10.1177/2041731413490182.
  9. Lamme E.N., de Vries H.J., van Veen H., Gabbiani G., Westerhof W., Middelkoop E. Extracellular matrix characterization during healing of full-thickness wounds treated with a collagen/elastin dermal substitute shows improved skin regeneration in pigs. J Histochem Cytochem 1996; 44(11): 1311–1322, https://doi.org/10.1177/44.11.8918906.
  10. Ahlfors J.-E.W., Billiar K.L. Biomechanical and biochemical characteristics of a human fibroblast-produced and remodeled matrix. Biomaterials 2007; 28(13): 2183–2191, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2006.12.030.
  11. Jiang H., Rhee S., Ho C.-H., Grinnell F. Distinguishing fibroblast promigratory and procontractile growth factor environments in 3-D collagen matrices. FASEB J 2008; 22(7): 2151–2160, https://doi.org/10.1096/fj.07-097014.
  12. Pedersen J.A., Boschetti F., Swartz M.A. Effects of extracellular fiber architecture on cell membrane shear stress in a 3D fibrous matrix. J Biomech 2007; 40(7): 1484–1492, https://doi.org/10.1016/j.jbiomech.2006.06.023.
  13. Richards-Kortum R., Sevick-Muraca E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem 1996; 47(1): 555–606, https://doi.org/10.1146/annurev.physchem.47.1.555.
  14. Monici M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnol Annu Rev 2005; 227–256, https://doi.org/10.1016/s1387-2656(05)11007-2.
  15. Baschong W., Suetterlin R., Laeng R.H. Control of autofluorescence of archival formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue in confocal laser scanning microscopy (CLSM). J Histochem Cytochem 2001; 49(12): 1565–1571, https://doi.org/10.1177/002215540104901210.
  16. Хубутия М.Ш., Андреев Ю.В., Боровкова Н.В., Хватов В.Б., Миронов А.С., Жиркова Е.А., Пономарев И.Н., Волков К.С., Шугай С.В., Конюшко О.И., Макаров М.С. Способ изготовления дермального матрикса. Патент РФ 2524619. 2014.
  17. Макаров М.С., Хватов В.Б., Ко­нюш­ко О.И., Боров­кова Н.В., Сторожева М.В., Пономарев И.Н. Метод мор­фо­­функциональной оценки клеточного компонента био­транс­плантатов. Патент РФ 2484472. 2013.
  18. Makarov M.S., Kobzeva E.N., Vysochin I.V., Borovkova N.V., Khvatov V.T. Morphofunctional analysis of human platelets by vital staining. Bull Exp Biol Med 2014; 156(3): 409–412, https://doi.org/10.1007/s10517-014-2360-0.
  19. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М: Советская наука, 1957. 470 с.
  20. Makarov M.S., Storozheva M.V., Konyushko O.I., Borovkova N.V., Khvatov V.B. Effect of concentration of platelet-derived growth factor on proliferative activity of human fibroblasts. Bull Exp Biol Med 2013; 155(4): 576–580, https://doi.org/10.1007/s10517-013-2199-9.


Журнал базах данных

pubmed_logo.jpg

web_of_science.jpg

scopus.jpg

crossref.jpg

doaj.jpg

ebsco.jpg

embase.jpg

ulrich.jpg

cyberleninka.jpg

e-library.jpg

lan.jpg

ajd.jpg

vak.jpg