Лантаноидное контрастирование как ускоренная технология пробоподготовки микробиологических препаратов для сканирующей электронной микроскопии
Цель исследования — продемонстрировать достоинства лантаноидного контрастирования в качестве новой, сверхбыстрой технологии пробоподготовки микробиологических препаратов для сканирующей электронной микроскопии и обосновать возможности применения этой технологии в практической микробиологии.
Материалы и методы. Микробные клетки (бактерии Acinetobacter baumannii, Corynebacterium diphtheriae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и грибы Candida albicans) и бактериальные биопленки на основе Staphylococcus aureus были контрастированы препаратом на основе хлорида неодима и визуализированы при помощи сканирующей электронной микроскопии. Наблюдения вели в режиме низкого вакуума, изображения захватывали в режиме детекции обратнорассеянных электронов с применением короткого рабочего отрезка 4,5–3,0 мм. В качестве препаратов сравнения использовали необработанные микроорганизмы либо микробные препараты, полученные при помощи традиционной пробоподготовки с обезвоживанием и напылением слоя золота-платины.
Результаты. Технология лантаноидного контрастирования позволила визуализировать и оценить диагностически значимые морфологические структуры микробных клеток A. baumannii, C. diphtheriae, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus, S. pneumoniae, C. albicans, включая их взаиморасположение, форму, размеры, наличие капсулы и жгутиков, внутриклеточные структуры (полифосфатные включения, перегородку), а также внеклеточный матрикс бактерий. Полученные изображения характеризовались высокой контрастностью. Это можно объяснить тем, что лантаноиды способны обеспечивать высокую плотность обратного рассеяния электронов под воздействием электронного пучка микроскопа, что приводит к высокой яркости на сканограммах локусов биологических объектов, насыщенных этими элементами.
Заключение. Лантаноидное контрастирование является перспективным методом пробоподготовки микроорганизмов для проведения сканирующей электронной микроскопии, что открывает возможности практического применения этого способа в диагностических технологиях клинической микробиологии.
- Чеботарь И.В., Гурьев Е.Л. Лабораторная диагностика клинически значимых биопленочных процессов. Вопросы диагностики в педиатрии 2012; 4(4): 15–20.
- Priester J.H., Horst A.M., Van De Werfhorst L.C., Saleta J.L., Mertes L.A.K., Holden P.A. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J Microbiol Methods 2007; 68(3): 577–558, https://doi.org/10.1016/j.mimet.2006.10.018.
- Ensikat H.-J., Weigend M. Creating internal conductivity in dry biological SEM samples by a simple vapour treatment. J Microsc 2014; 256(3): 226–230, https://doi.org/10.1111/jmi.12177.
- Новиков И.А., Суббот А.М., Федоров А.М., Грибоедова И.Г., Антонов Е.Н., Вахрушев И.В. Суправитальное контрастирование лантаноидами для визуализации структуры биологических образцов на сканирующем электронном микроскопе. Гены и клетки 2015; 10(2): 90–96.
- Nakakoshi M., Nishioka H., Katayama E. New versatile staining reagents for biological transmission electron microscopy that substitute for uranyl acetate. J Electron Microsc (Tokyo) 2011; 60(6): 401–407, https://doi.org/10.1093/jmicro/dfr084.
- Pogorelov A.G., Chebotar I.V., Pogorelova V.N. Scanning electron microscopy of biofilms adherent to the inner catheter surface. Bull Exp Biol Med 2014; 157(5): 711–714, https://doi.org/10.1007/s10517-014-2648-0.
- Novikov I.A., Subbot A.M., Kiryushchenkova N.P., Nesterova T.V., Gabashvili A.N., Sitnikov A.V., Bursov A.I. Fast and easy method of lanthanoid staining for visualization of cellular ultrastructure and spatial arrangement. AIP Conference Proceedings 2016; 1748(1): 020009, https://doi.org/10.1063/1.4954343.
- Doggenweiler C.F., Frenk S. Staining properties of lanthanum on cell membranes. Proc Natl Acad Sci USA 1965; 53(2): 425–430, https://doi.org/10.1073/pnas.53.2.425.
- Shaklai M., Tavassoli M. Lanthanum as an electron microscopic stain. J Histochem Cytochem 1982; 30(12): 1325–1330, https://doi.org/10.1177/30.12.6185564.
- Evans C.H. Biochemistry of the lanthanides. New York: Springer Science & Business Media; 2013; 453 p.
- Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Маянский Н.А. Матрикс микробных биопленок. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2016; 18(1): 9–19.
- Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. СПб: ИИЦ ВМА; 2008; 112 с.
- Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002; 15(2): 167–193, https://doi.org/10.1128/cmr.15.2.167-193.2002.
