Феномен фотоактивности синего флюоресцентного белка TagBFP и его использование в микроскопии сверхвысокого разрешения

Цель исследования — изучить способность синего флюоресцентного белка TagBFP к фотоактивации и возможность его применения в микроскопии сверхвысокого разрешения.

Материалы и методы. Фотоактивность TagBFP тестировали в белковом растворе in vitro и на живых клетках. Для микроскопии сверхвысокого разрешения использовали режим полного внутреннего отражения флюоресценции с последующим анализом данных методом SRRF (радиальные флюктуации со сверхвысоким разрешением) или посредством реконструкции локализаций одиночных молекул.

Результаты. Обнаружено, что при воздействии светом с длиной волны 405 нм можно наблюдать «мигание» флюоресценции белка TagBFP, т.е. обратимые переходы между его темновым и флюоресцентным состояниями. Кроме того, в условиях, обычно используемых для визуализации TagBFP, детектируется переход белка в красное флюоресцентное состояние. При этом спектральные свойства красной (фотоактивированной) формы TagBFP сходны с таковыми его близкого гомолога — TagRFP. Показано, что как «мигание» флюоресценции, так и фотоконверсия TagBFP могут применяться в микроскопии сверхвысокого разрешения. Важно подчеркнуть, что феномен фотоконверсии TagBFP в красное флюоресцентное состояние должен учитываться при планировании экспериментов по много­цветной микроскопии, в условиях интенсивного или длительного воздействия УФ-светом.

1. Mishin A.S., Belousov V.V., Solntsev K.M., Lukyanov K.A. Novel uses of fluorescent proteins. Curr Opin Chem Biol 2015; 27: 1–9, https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2015.05.002.
2. Mena M.A., Treynor T.P., Mayo S.L., Daugherty P.S. Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from a structurally targeted library. Nat Biotechnol 2006; 24(12): 1569–1571, https://doi.org/10.1038/nbt1264.
3. Ai H., Shaner N.C., Cheng Z., Tsien R.Y., Campbell R.E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. Biochemistry 2007; 46(20): 5904–5910, https://doi.org/10.1021/bi700199g.
4. Subach O.M., Gundorov I.S., Yoshimura M., Subach F.V., Zhang J., Grüenwald D., Souslova E.A., Chudakov D.M., Verkhusha V.V. Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol 2008; 15(10): 1116–1124, https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2008.08.006.
5. Klementieva N.V., Zagaynova E.V., Lukyanov K.A., Mishin A.S. The principles of super-resolution fluorescence microscopy (review). Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(2): 130–140, https://doi.org/10.17691/stm2016.8.2.17.
6. Wegel E., Göhler A., Lagerholm B.C., Wainman A., Uphoff S., Kaufmann R., Dobbie I.M. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and localisation microscopy: a practical comparison. Sci Rep 2016; 6: 27290, https://doi.org/10.1038/srep27290.
7. Klementieva N.V., Bozhanova N.G., Zagaynova E.V., Lukyanov K.A., Mishin A.S. Fluorophores for single-molecule localization microscopy. Russ J Bioorganic Chem 2017; 43(3): 227–234, https://doi.org/10.1134/s1068162017030074.
8. Klementieva N.V., Pavlikov A.I., Moiseev A.A., Bozhanova N.G., Mishina N.M., Lukyanov S.A., Zagaynova E.V., Lukyanov K.A., Mishin A.S. Intrinsic blinking of red fluorescent proteins for super-resolution microscopy. Chem Commun 2017; 53(5): 949–951, https://doi.org/10.1039/c6cc09200d.
9. Gustafsson N., Culley S., Ashdown G., Owen D.M., Pereira P.M., Henriques R. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nat Commun 2016; 7: 12471, https://doi.org/10.1038/ncomms12471.
10. Ovesný M., Křížek P., Borkovec J., Švindrych Z., Hagen G.M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics 2014; 30(16): 2389–2390, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu202.
11. Shcherbakova D.M., Verkhusha V.V. Chromophore chemistry of fluorescent proteins controlled by light. Curr Opin Chem Biol 2014; 20: 60–68, https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2014.04.010.
12. Subach O.M., Cranfill P.J., Davidson M.W., Verkhusha V.V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One 2011; 6(12): e28674, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028674.

Klementieva N.V., Lukyanov К.А., Gorbachev D.A., Chudakov D.M., Zagaynova E.V., Mishin A.S. A Surprising Photoactivity of Blue Fluorescent Protein TagBFP Allows for Super-Resolution Microscopy. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(1): 35, https://doi.org/10.17691/stm2018.10.1.04