Новая технология модифицирования RGD-пептидами поверхности биодеградируемых сосудистых протезов: влияние на структуру поверхности и физико-механические свойства

Л.В. Антонова, В.Н. Сильников, Т.В. Глушкова, Л.С. Королева, И.Ю. Серпокрылова, В.В. Севостьянова, Е.О. Кривкина, Е.А. Сенокосова, А.В. Миронов, Ю.А. Кудрявцева, Л.С. Барбараш

Ключевые слова: биодеградируемые сосудистые протезы; модифицирование поверхности сосудов; RGD-пептиды; электроспиннинг; аргинин-глицин-аспарагиновая кислота.

Цель исследования — оценить эффективность новой технологии модифицирования RGD-пептидами биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра из полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) и ее влияние на структуру поверхности и физико-механические характеристики этих протезов.

Материалы и методы. Трубчатые полимерные протезы (матриксы, графты) диаметром 1,5 мм изготавливали методом электроспиннинга из композиции полимеров PHBV и PCL. Для модифицирования поверхности полимерных каркасов использовали гексаметилендиамин, глутаровый альдегид, нингидрин аскорбиновую кислоту, аргинин-глицин-аспарагиновую кислоту (RGD). Качество проведенной модификации оценивали с помощью нингидринового теста и посредством определения аргининсодержащего пептида. Структуру поверхности протезов до и после модифицирования изучали методом сканирующей электронной микроскопии. Оценку механических свойств проводили в условиях одноосного растяжения с определением предела прочности, относительного удлинения и модуля Юнга. В качестве контроля этих параметров использовали характеристики внутренней грудной артерии человека (a. мammaria), в качестве группы сравнения — сосудистый синтетический протез на основе линейного политетрафторэтилена (ePTFE).

Результаты. Присутствие RGD-пептидов на полимерной поверхности подтверждено с помощью теста Сакагучи на наличие аргинина. Использованный режим модифицирования не менял структуру поверхности полимерных графтов, однако привел к снижению их жесткости в 1,6 раза, прочности — в 3,9 раза, а относительного удлинения — в 1,7 раза. При этом физико-механические свойства графтов PHBV/PCL+RGD приблизились к свойствам a. мammaria.

Заключение. Разработанная технология модифицирования RGD-пептидами поверхности сосудистых графтов на основе PHBV/PCL позволила приблизить физико-механические свойства протезов PHBV/PCL+RGD к свойствам нативных сосудов без изменения структуры поверхности.

Введение

В настоящее время известно уже большое количество методов физической, химической и биологической модификации поверхности тканеинженерных конструкций, основной целью которой является повышение биосовместимости материала, выбранного для их изготовления. К изделиям, разрабатываемым для нужд сердечно-сосудистой хирургии, предъявляется целый спектр дополнительных требований, в конечном итоге гарантирующих состоятельность данных изделий после имплантации в сосудистое русло. В частности, тромборезистентность внутренней поверхности сосудистых протезов, которая в нативных сосудах обусловлена функционированием сохраненного эндотелиального слоя, — залог долгосрочной проходимости в условиях организма. В физиологических условиях эндотелий сосудов обладает высокой тромборезистентностью, продуцируя большое количество биологически активных факторов, которые связаны с гомеостазом, фибринолизом, нарушением сосудистого тонуса, проницаемостью сосудов, синтезом факторов роста [1]. Одним из решающих факторов надежности сосудистого трансплантата малого диаметра является скорейшее образование эндотелиальной выстилки на его внутренней поверхности, что может обеспечить атромбогенный эффект и полноценный просвет будущего новообразованного сосуда. Формирование эндотелиального слоя in situ после имплантации протеза (матрикса, графта) в кровоток возможно благодаря привлечению или захвату эндотелиальных прогениторных клеток из кровотока, которые после адгезии на пористой поверхности протеза способны пролиферировать и полностью заполнять поверхность, дифференцируясь далее в зрелые эндотелиальные клетки [2].

В последние годы был разработан ряд стратегий для улучшения возможностей придания полимерным поверхностям способности селективно адгезировать эндотелиальные клетки с целью ускорения эндотелизации. Большинство из них заключаются в иммобилизации или фиксации на поверхности специфических белков клеточной адгезии и биоактивных пептидов [3].

Аргинин-глицин-аспарагин (RGD) представляет собой сайт клеточной адгезии, присутствующий на многих белках внеклеточного матрикса [4]. Данная последовательность является одним из ключевых лигандов для интегринов — рецепторов, которые ответственны за клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и выживание [5]. RGD-пептид можно считать общим интегринсвязывающим мотивом. В сравнении с белками биоактивные RGD-содержащие пептиды обладают более простой структурой и более высокой химической стабильностью. Благодаря искусственному синтезу можно получать разнообразные конфигурации RGD-пептидов, обладающие низкой иммуногенностью и разным потенциалом взаимодействия с клетками.

Различные виды синтетических материалов, модифицированных с помощью различных форм RGD, были протестированы на эффективность адгезии зрелых и прогениторных эндотелиальных клеток [6–9]. Доказано, что RGD-трипептид ускоряет эндотелизацию поверхности полимерных материалов [10–12]. Тропность к эндотелиальным клеткам делает RGD-пептиды и их конфигурации идеальными агентами для модифицирования медицинских изделий, контактирующих с кровью и требующих скорейшей эндотелизации поверхности материала.

Установлено, что на эффективность клеточной адгезии влияет не только конфигурация RGD, но и длина линкерных групп, связывающих RGD-пептид с поверхностью модифицируемой конструкции. Лучшие результаты были получены при использовании наиболее протяженных линкерных групп [13].

По данным наших предыдущих исследований, степень первичной модификации поверхности возрастала с увеличением времени обработки гексаметилендиамином. Максимальная плотность модифицирования поверхности графтов составила 8,9 нМ/см² при продолжительности модифицирования в течение 60 мин [14]. Однако при этом значимо ухудшились физико-механические характеристики протезов [15].

Известно, что основное требование к любым модифицирующим процессам — они не должны менять структуру и негативно сказываться на физико-механических характеристиках конечного изделия. Запас прочности для изделий, функционирующих в условиях пульсирующего потока крови, необходим для предотвращения образования аневризм до момента формирования новообразованной ткани in situ. Упруго-деформативные свойства должны быть приближены к свойствам нативного сосуда с целью сохранения комплайнса между сосудом и имплантируемым протезом. Вышеперечисленные требования являются особенно критичными для изделий, разрабатываемых для нужд сердечно-сосудистой хирургии.

Цель исследования — оценить эффективность новой технологии модифицирования RGD-пептидами биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра из полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона и ее влияние на структуру поверхности и физико-механические характеристики протезов.

Материалы и методы

Изготовление трубчатых каркасов PHBV/PCL. Трубчатые полимерные матриксы диаметром 1,5 мм изготовлены методом электроспиннинга на приборе Nanon-01A (MECC Co. Ltd, Япония) из композиции полимеров полигидроксибутирата/валерата (PHBV) с 10% содержанием валерата (Sigma-Aldrich, США) и поликапролактона (PCL) c молекулярной массой 80 000 кДа (Sigma-Aldrich, США). В качестве растворителя использовали неполярный органический растворитель хлороформ ХЧ («Вектон», Россия). Соотношение полимеров в растворе — 1:2.

Модифицирование матриксов PHBV/PCL RGD-пептидами. Для модифицирования поверхности полимерных трубчатых каркасов PHBV/PCL диаметром 1,5 мм использовали гексаметилендиамин, глутаровый альдегид, нингидрин, аскорбиновую кислоту (Sigma-Aldrich, США) и RGD («НаноТех-С», Россия). Сначала каркасы обрабатывали 10% раствором гексаметилендиамина в смеси изопропанола и воды (соотношение 1:1) при 37^оС в течение 30 мин, что сокращало в 2 раза время проведения модификации [14, 15]. При этом, как и при дальнейших обработках, каждый графт находился в отдельном реакторе объемом 15 мл в горизонтальном положении при постоянном покачивании.

Далее трубчатые каркасы PHBV/PCL последовательно промывали трехкратным объемом следующих реакторов:

1) смесью изопропанола и воды 1:1;

2) бидистиллированной водой;

3) 0,1% раствором Тритон Х-100;

4) бидистиллированной водой.

После последней промывки трубчатые каркасы PHBV/PCL обрабатывали 2% раствором глутарового альдегида в воде в течение 3 ч при 24^оС, промывали трехкратным объемом бидистиллированной воды, затем помещали в раствор 0,2 мг/мл пептида в 50 мМ карбонатном буфере (рН=8,5), содержащем 2,5 мМ цианоборгидрида натрия, и выдерживали в течение 4 ч при 24^оС.

После присоединения RGD-пептида графты промывали трехкратным объемом реактора:

1) 0,1% раствором Тритон Х-100;

2) бидистиллированной водой.

Определение наличия аргинин-содержащего пептида [16, 17]. К 1 см² образца графта добавляли раствор 0,5 мл α-нафтола (0,01% раствор в 95% этиловом спирте с 5% мочевины). После равномерного смачивания образцов в раствор вносили 50 мкл 2 н. раствора NaOH в спирте. Через 5 мин в реакционные смеси добавляли по 0,5 мл раствора брома (2% раствор в 8% водном растворе NaOH). Образец инкубировали 12 ч при комнатной температуре. Окрашивание его в оранжево-красный цвет свидетельствовало о наличии гуанидиновой группы аргинина.

Сканирующая электронная микроскопия поверхности матриксов. Структура внутренней поверхности и толщина стенки нетканых трубчатых каркасов PHBV/PCL размером 0,5×0,5 мм, немодифицированных и модифицированных RGD-пептидами (n=5 в каждой группе), была изучена на сканирующем электронном микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония) в условиях высокого вакуума. Для исследования образцы напыляли золотом и палладием на вакуумной установке SC-7640 (Quorum Technologies, Англия).

Физико-механические испытания биодеградируемых сосудистых протезов. Оценку механических свойств проводили в условиях одноосного растяжения в соответствии с ГОСТ 270-75. Вырубку образцов осуществляли в продольном направлении сосудистого сегмента. Для контроля использовали параметры внутренней грудной артерии человека (a. mammaria) в качестве «золотого стандарта». Сегменты a. mammaria забирали при проведении операции аортокоронарного шунтирования у пациентов, подписавших Договор информированного согласия на забор материала. В качестве сравнительной группы исследовали сосудистый синтетический протез на основе политетрафторэтилена (ePTFE), широко используемый в сердечно-сосудистой хирургии.

Испытания проведены на универсальной испытательной машине Zwick/Roell (Zwick GmbH, Германия) с использованием датчика с номинальной силой 50 Н при скорости перемещения траверсы 10 мм/мин. Предел прочности материала оценивали как максимальное напряжение при растяжении (МПа) до начала разрушения, а упруго-деформативные свойства — по относительному удлинению до начала разрушения образца (%) и модулю Юнга (МПа), который определяли в диапазоне физиологического давления (80–120 мм рт. ст.).

Статистика. Обработку полученных данных проводили общепринятыми методами статистики при помощи пакета прикладных программ для обработки медицинской и биологической информации Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США). Характер распределения в выборках оценивали при помощи критерия Колмогорова–Смирнова. При распределении, отличном от нормального, данные представлены как медиана (Ме) и квартили (25% и 75%). При нормальном распределении данные представлены как средняя (М) и ошибка средней (σ). Статистическую значимость различий между двумя независимыми группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни или t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Плотность модифицирования поверхности протезов RGD-пептидами при продолжительности модифицирования в течение 30 мин составила 6,3 нМ/см². Наличие пептидов на полимерной поверхности подтверждено с использованием теста Сакагучи на наличие аргинина [16, 17]. Окраска образца не исчезала после промывки, что свидетельствовало о ковалентной пришивке пептида. Контрольный образец, не содержащий RGD-пептида, окрашивался в светло-желтый цвет, окраска его исчезала при промывках. Таким образом, была подтверждена эффективность модифицирования RGD-пептидами поверхности трубчатых каркасов PHBV/PCL с продолжительностью времени модификации 30 мин, что значительно укорачивает время проведения процедуры модифицирования.

Модифицированные и немодифицированные RGD-пептидами графты PHBV/PCL обладали высокопористой структурой с толщиной стенки 170–250 мкм и гомогенными волокнами (рис. 1).

Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия графтов PHBV/PCL, немодифицированных и модифицированных RGD-пептидами:

а — поперечный срез стенки немодифицированного PHBV/PCL, ×200; б — внутренняя поверхность немодифицированного PHBV/PCL, ×1000; в — поперечный срез стенки PHBV/PCL + RGD, ×150; г — внутренняя поверхность PHBV/PCL + RGD, ×1000

Средний диаметр волокон и средняя площадь пор в графтах составили соответственно 2,63±1,14 мкм и 47,13±23,00 мкм² при пористости около 50,0%. Модификация RGD-пептидами статистически значимо не влияла на данные показатели. В отличие от немодифицированных образцов полимерные графты, конъюгированные с RGD-пептидами, имели выпуклости на нитях полимера. Данные неровности предположительно представляют собой иммобилизованные на поверхности RGD-биомолекулы.

Сосудистый протез на основе ePTFE по упруго-деформативным свойствам достоверно не отличался, а по прочностным характеристикам — в 3,9 раза превосходил a. mammaria, p<0,05 (см. таблицу).

Механические свойства графтов в сравнении с нативными сосудами и синтетическими сосудистыми протезами (Me [25%; 75%]

Обнаружено, что механические свойства немодифицированных сосудистых протезов на основе PHBV/PCL не соответствовали таковым у нативных сосудов и синтетических сосудистых протезов на основе ePTFE, характеризуясь высокой жесткостью, прочностью и относительным удлинением. Значения модуля Юнга графтов PHBV/PCL в 10 раз превысили значения данного показателя у a. mammaria (p<0,05). Прочность немодифицированных графтов PHBV/PCL была выше в 2,8 раза, а относительное удлинение — в 14,5 раза относительно a. mammaria (p<0,05). При этом прочность не отличалась от таковой у синтетического сосудистого протеза на основе ePTFE (p<0,05).

Особенно критичным показателем для осуществления последующего комплайнса с сосудом, в который планируется имплантировать протез, является жесткость. Значимые несовпадения данных показателей протезируемого сосуда и сосудистого протеза могут в последующем провоцировать гипертрофию неоинтимы или тромбоз. Поэтому устранение жесткости являлось основной задачей при модификации RGD-пептидами сосудистых графтов на основе PHBV/PCL.

Модифицирование RGD-пептидами графтов PHBV/PCL привело к изменению физико-механических характеристик образцов (см. таблицу): отмечено снижение относительного удлинения в 1,7 раза на фоне снижения жесткости в 1,6 раза относительно немодифицированных аналогов (р<0,05).

После проведенной модификации RGD-пептидами предел прочности сосудистых графтов PHBV/PCL стал в 3,9 раза ниже (р>0,05), чем до модификации, что привело к нивелированию разницы в данных показателях с a. mammaria. При этом графты PHBV/PCL+RGD имели статистически значимо бóльшую способность к удлинению (в 8,4 и 6,4 раза соответственно) и высокую жесткость (в 7,6 и 7,7 раза соответственно) относительно данных показателей a. mammaria и синтетических протезов из ePTFE (р>0,05).

Ответная реакция материалов на механическую нагрузку при повышенном сопротивлении проявляется ростом напряжения в материале при незначительных удлинениях, что мы и наблюдаем для графтов вне зависимости от модификации в диапазоне физиологических нагрузок. Несмотря на достоверное снижение жесткости и относительного удлинения графтов PHBV/PCL при модифицировании RGD-пептидами (р≤0,05), графики, отражающие соотношения напряжение/деформация, демонстрируют механическое поведение модифицированных графтов, отличное от a. mammaria и ePTFE (рис. 2).

Рис. 2. Механические свойства полимерных графтов:

соотношение напряжение–деформация до начала разрушения; напряжение–деформация в условиях физиологического давления

Данный факт указывает на необходимость дальнейших исследований, направленных на оптимизацию упруго-деформативных свойств полимерных графтов.

Заключение

Использованный в данной работе режим модифицирования полимерных биодеградируемых трубчатых каркасов из PHBV/PCL RGD-пептидами продолжительностью 30 мин не привел к статистически значимому изменению структуры их поверхности. При этом после проведенного модифицирования снизилась жесткость графтов и их способность к удлинению, что приблизило физико-механические свойства сосудистых протезов PHBV/PCL + RGD к свойствам нативных сосудов.

В дальнейших экспериментах по проведению модифицирования биодеградируемых трубчатых каркасов необходим более тщательный подбор оптимальных значений времени и режимов воздействия модифицирующих агентов на полимер. Это необходимо как для достижения максимального качества модификации, так и для предупреждения пагубного воздействия на полимерную поверхность используемых в методике модифицирования пептидами поверхностно-активных веществ.

Финансирование исследования. Исследование выполнено в Научно-исследовательском институте комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний и в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН за счет средств интеграционного проекта «Биодеградируемый сосудистый графт малого диаметра, модифицированный функционально активными пептидами» комплексной программы фундаментальных научных исследований Сибирского отделения РАН II.1 (№0546-2018-0001). Блок работ Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний — «Разработка научных основ изготовления и модификации биодеградируемого сосудистого графта и его тестирования in vitro». Блок работ Института химической биологии и фундаментальной медицины — «Модификация полимерного каркаса функционально активными пептидами и оценка качества проведенной модификации».

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.

Литература

Fadini G.P., Rattazzi M., Matsumoto T., Asahara T., Khosla S. Emerging role of circulating calcifying cells in the bone-vascular axis. Circulation 2012; 125(22): 2772–2781, https://doi.org/10.1161/circulationaha.112.090860.
Lee K.-W., Johnson N.R., Gao J., Wang Y. Human progenitor cell recruitment via SDF-1α coacervate-laden PGS vascular grafts. Biomaterials 2013; 34(38): 9877–9885, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.08.082.
Ren X., Feng Y., Guo J., Wang H., Li Q., Yang J., Hao X., Lv J., Ma N., Li W. Surface modification and endothelialization of biomaterials as potential scaffolds for vascular tissue engineering applications. Chem Soc Rev 2015; 44(15): 5680–5742, https://doi.org/10.1039/c4cs00483c.
Wang F., Li Y., Shen Y., Wang A., Wang S., Xie T. The functions and applications of RGD in tumor therapy and tissue engineering. Int J Mol Sci 2013; 14(7): 13447–13462, https://doi.org/10.3390/ijms140713447.
Harburger D.S., Calderwood D.A. Integrin signalling at a glance. J Cell Sci 2008; 122(2): 159–163, https://doi.org/10.1242/jcs.018093.
Tiwari A., Kidane A., Salacinski H., Punshon G., Hamilton G., Seifalian A.M. Improving endothelial cell retention for single stage seeding of prosthetic grafts: use of polymer sequences of arginine-glycine-aspartate. Eur J Vasc Endovasc Surg 2003; 25(4): 325–329, https://doi.org/10.1053/ejvs.2002.1854.
Kidane A.G., Punshon G., Salacinski H.J., Ramesh B., Dooley A., Olbrich M., Heitz J., Hamilton G., Seifalian A.M. Incorporation of a lauric acid-conjugated GRGDS peptide directly into the matrix of a poly(carbonate-urea)urethane polymer for use in cardiovascular bypass graft applications. J Biomed Mater Res A 2006; 79(3): 606–617, https://doi.org/10.1002/jbm.a.30817.
Alobaid N., Salacinski H.J., Sales K.M., Ramesh B., Kannan R.Y., Hamilton G., Seifalian A.M. Nanocomposite containing bioactive peptides promote endothelialisation by circulating progenitor cells: an in vitro evaluation. Eur J Vasc Endovasc Surg 2006; 32(1): 76–83, https://doi.org/10.1016/j.ejvs.2005.11.034.
Salacinski H.J., Hamilton G., Seifalian A.M. Surface functionalization and grafting of heparin and/or RGD by an aqueous-based process to a poly(carbonate-urea)urethane cardiovascular graft for cellular engineering applications. J Biomed Mater Res A 2003; 66(3): 688–697, https://doi.org/10.1002/jbm.a.10020.
Gabriel M., van Nieuw Amerongen G.P., van Hinsbergh V.W.M., van Nieuw Amerongen A.V., Zentner A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J Biomater Sci Polym Ed 2006; 17(5): 567–577, https://doi.org/10.1163/156856206776986288.
Chung T.-W., Yang M.-G., Liu D.-Z., Chen W.-P., Pan C.-I., Wang S.-S. Enhancing growth human endothelial cells on Arg-Gly-Asp (RGD) embedded poly(epsilon-caprolactone) (PCL) surface with nanometer scale of surface disturbance. J Biomed Mater Res A 2004; 72(2): 213–219, https://doi.org/10.1002/jbm.a.30225.
Zheng W., Guan D., Teng Y., Wang Z., Zhang S., Wang L., Kong D., Zhang J. Functionalization of PCL fibrous membrane with RGD peptide by a naturally occurring condensation reaction. Chinese Science Bulletin 2014; 59(22): 2776–2784, https://doi.org/10.1007/s11434-014-0336-0.
Gabriel M., Nazmi K., Dahm M., Zentner A., Vahl C.-F., Strand D. Covalent RGD modification of the inner pore surface of polycaprolactone scaffolds. J Biomater Sci Polym Ed 2012; 23(7): 941–953, https://doi.org/10.1163/092050611x566793.
Антонова Л.В., Сильников В.Н., Ханова М.Ю., Королева Л.С., Серпокрылова И.Ю., Великанова Е.А., Матвеева В.Г., Сенокосова Е.А., Миронов А.В., Кривкина Е.О., Кудрявцева Ю.А., Барбараш Л.С. Оценка адгезии, пролиферации и жизнеспособности эндотелиальных клеток пупочной вены человека, культивируемых на поверхности биодеградируемых нетканых матриксов, модифицированных RGD-пептидами. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2019; 21(1): 142–152, https://doi.org/10.15825/1995-1191-2019-1-142-152.
Antonova L.V., Silnikov V.N., Sevostyanova V.V., Yuzhalin A.E., Koroleva L.S., Velikanova E.A., Mironov A.V., Godovikova T.S., Kutikhin A.G., Glushkova T.V., Serpokrylova I.Yu., Senokosova E.A., Matveeva V.G., Khanova M.Yu., Akentyeva T.N., Krivkina E.O., Kudryavtseva Yu.A., Barbarash L.S. Biocompatibility of small-diameter vascular grafts in different modes of RGD modification. Polymers 2019; 11(1): 174, https://doi.org/10.3390/polym11010174.
Lin H.B., Sun W., Mosher D.F., García-Echeverría C., Schaufelberger K., Lelkes P.I., Cooper S.L. Synthesis, surface, and cell-adhesion properties of polyurethanes containing covalently grafted RGD-peptides. J Biomed Mater Res 1994; 28(3): 329–342, https://doi.org/10.1002/jbm.820280307.
Parniak M.A., Lange G., Viswanatha T. Quantitative determination of monosubstituted guanidines: a comparative study of different procedures. J Biochem Biophys Methods 1983; 7(4): 267–276, https://doi.org/10.1016/0165-022x(83)90051-9.