Цитокиновый профиль CCR6⁺ T-хелперов, выделенных из крови пациентов с язвенной болезнью, ассоциированной с H. pylori-инфекцией

Введение

В данной работе исследовали CCR6⁺ Т-хелперы, содержание которых в крови увеличивается при язвенной болезни, ассоциированной с H. pylori-инфекцией [1]. H. pylori способен длительно персистировать в желудке и на участках желудочной метаплазии в двенадцатиперстной кишке человека, вызывая различные формы инфекции — от бессимптомного инфицирования до гастрита типа В и язвенной болезни, а также провоцируя развитие аденокарциномы желудка и MALT-лимфомы [2–4]. Иммунный ответ на инфицирование H. pylori развивается быстро [5, 6], однако этой реакции оказывается недостаточно для эффективной борьбы с микроорганизмом, заселяющим весьма специфические ниши [7, 8], малодоступные для эффекторов иммунитета. В частности, слабость трансэпителиального транспорта IgA в желудке [9] не позволяет создать концентрацию секреторного IgA, достаточную для устранения H. pylori из защитного слоя слизи желудка и с поверхности эпителия [10–12]. Клеточный иммунный ответ на H. pylori также обладает ограниченным защитным эффектом. Более того, эксперименты на животных позволяют предположить, что клеточный иммунный ответ, а именно активность провоспалительных Т-хелперов, вносит важный вклад в развитие симптомов гастрита [12], наряду с прямым действием токсинов H. pylori. Так, при отсутствии полноценно функционирующих Т-хелперов H. pylori вызывает массивную, но бессимптомную инфекцию у мышей, тогда как восстановление иммунитета этих мышей за счет введения им нормальных Т-хелперов ведет к уменьшению бактериальной нагрузки и одновременно к развитию выраженного воспалительного поражения слизистой оболочки желудка [13, 14]. Основными цитокинами, индуцирующими воспаление в моделях H. pylori-ассоциированного гастрита, являются ключевой цитокин Тх1 интерферон-γ (IFN-γ) и цитокин Тх17 интерлейкин-17А (IL-17А) [13], причем созревание Тх17 и продукция ими IL-17А служит обязательным условием роста продукции IFN-γ [15, 16]. Вклад иммунных механизмов в формирование язвенной болезни исследован недостаточно.

Ранее [1] мы обнаружили, что при H. pylori-ассоциированной язвенной болезни в крови в 2 раза повышается содержание зрелых Т-хелперов, экспрессирующих хемокиновый рецептор CCR6, тогда как при гастродуодените количество этих клеток увеличивается незначительно. CCR6 направляет миграцию Т-лимфоцитов из кровотока в кожу, пейеровы бляшки, а также в воспаленную слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта [17, 18]. Экспрессия CCR6 характерна для Тх17, хотя количество CCR6⁺ Т-хелперов значительно превышает количество зрелых Тх17 [19]. По нашему мнению, рост содержания зрелых CCR6⁺ Т-хелперов происходит за счет клеток, вовлеченных в иммунный ответ на H. pylori-инфекцию. Покинув после созревания вторичные лимфоидные органы и оказавшись в кровотоке, эти клетки могут направленно мигрировать в воспаленную слизистую оболочку, где будут продуцировать цитокины в соответствии с типом цитокинопродукции, приобретенным в ходе созревания. Для оценки возможной патогенетической роли CCR6⁺ Т-хелперов следует определить содержание среди этих клеток зрелых Тх1, Тх17, а также клеток со смешанными свойствами Тх1 и Тх17 в норме и при изуча­емой патологии.

Цель исследования — оценить изменения содержания в крови провоспалительных типов зрелых CCR6⁺ Т-хелперов при H. pylori-ассоциированной язвенной болезни.

Материалы и методы

Исследование проведено в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) и одобрено локальным этическим комитетом Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. Все пациенты и доноры дали информированное согласие на участие в исследовании. Обследовали взрослых больных (n=7) с язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H. pylori-инфекцией, при поступлении в стационар в связи с обострением основного заболевания. Наличие H. pylori подтверждали с помощью быстрого уреазного теста и обнаружения ДНК H. pylori с использованием полимеразой цепной реакции [20]. Взрослые практически здоровые доноры были привлечены для отработки методов (n=4) и формирования группы сравнения (n=15).

Активация неразделенных мононуклеарных клеток периферической крови. Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли из гепаринизированной венозной крови традиционным способом с помощью центрифугирования над слоем Hystopaque-1077 (Sigma, США). Затем их засевали в 24-луночные планшеты (Costar, США) по 2·10⁶ клеток на лунку в 1 мл среды RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) c 10% эмбриональной телячьей сыворотки — ЭТС (PAA Laboratories, Австрия) и активаторами: 25 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата — ФМА (Serva, Германия) и 1 мкг/мл иономицина (Sigma). Клетки культивировали 4 или 22 ч при +37°С и 5% СО₂, причем в обоих случаях — с добавлением 5 мкг/мл брифелдина А (BioLegend, США) на последние 4 ч культивирования. Затем клетки окрашивали флуоресцентными конъюгатами антител к молекулам CD4 («Сорбент», Россия), CD45RO, CCR6 (BioLegend) и CCR7 (eBioscience, США), фиксировали 4% параформальдегидом, пермеабилизировали мембраны 0,1% сапонином и окрашивали цитокины конъюгатами антител к IFN-γ и IL-17А (eBioscience), как это описано ранее [21]. Пробы анализировали на проточном цитофлуориметре FacsCanto II (BD Biosciences, США), оценивая количество продуцентов IFN-γ и IL-17А в CD4⁺, CD4⁺CD45RO⁺ и CD4⁺CD45RO⁺CСR6⁺CCR7^– клетках.

Иммуномагнитная сепарация CCR6⁺ Т-хел­пе­ров. На первом этапе сепарации из МНПК выделяли CD4⁺ Т-хелперы путем негативной селекции, используя набор EasySep Human CD4⁺ T Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies, Канада) согласно инструкции производителя. На втором этапе из состава Т-хелперов выделяли клетки CCR6⁺ позитивной селекцией, используя отдельные реагенты STEMCELL Technologies. Для этого Т-хелперы, выделенные из 18 мл крови, помещали в круглодонную полистироловую пробирку диаметром 12 мм и высотой 75 мм, однократно отмывали и ресуспендировали в 350 мкл среды для магнитных бус следующего состава: забуференный фосфатами физиологический раствор с 2% ЭТС и 1 мM этилендиаминтетрауксусной кислоты. Затем в пробирку добавляли 9 мкл реагента EasySep Human CCR6⁺ Positive Selection Cocktail II (STEMCELL Technologies), связывающего CCR6 с поверхностью бус. После 5 мин инкубации при комнатной температуре и плавном перемешивании добавляли 70 мкл суспензии магнитных бус EasySep Releasable RapidSpheres 50201 и инкубировали еще 5 мин. Доводили объем средой для бус до 2,5 мл, перемешивали и помещали в магнит EasySep. Через 5 мин сливали жидкость из пробирки, не вынимая ее из магнита. Затем пробирку извлекали из магнита, оставшиеся на стенках бусы с клетками ресуспендировали в 2,5 мл среды для бус. Пробирку вновь помещали в магнит и через 5 мин сливали жидкость, не вынимая пробирку из магнита. Затем ее доставали, добавляли 175 мкл среды для бус, обмывая стенки, добавляли 35 мкл буфера для снятия бус (EasySep Release Buffer) и инкубировали 5 мин. Далее пробирку ставили в магнит и через 5 мин сливали в стерильную пробирку жидкость, содержащую CCR6⁺ Т-хелперы. Чистоту конечного продукта сепарации и проб, отобранных на этапах очистки, определяли с помощью проточной цитометрии клеток, окрашенных конъюгатами антител к CD4, CD45RO и CCR6.

Активация очищенных Т-хелперов. Очищенные клетки отмывали и засевали в лунки круглодонных 96-луночных планшетов (Costar) по 2,5·10⁴ клеток в 100 мкл среды RPMI-1640 c 10% ЭТС. Клетки культивировали от 22 до 118 ч при +37°С и 5% СО₂. Активацию проводили, добавляя 25 нг/мл ФМА и 1 мкг/мл ионо­мицина на последние 4 или 22 ч культивирования. Брифелдин А (5 мкг/мл) добавляли на последние 4 ч культивирования. После культивирования клетки собирали, окрашивали внутриклеточные цитокины, как это описано выше, и анализировали на цитофлуориметре.

Статистическая обработка данных. Результаты цитометрии обрабатывали программой Diva (BD Biosciences). Статистический анализ проводили с использованием t-теста Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Исходно мы планировали активировать нераз­де­ленные МНПК, а затем оценить содержание продуцентов IFN-γ и IL-17А в исследуемой группе CD4⁺CD45RO⁺CСR6⁺CCR7^– Т-хелперов, выделенных в гейт при анализе результатов цитометрии. Однако мы были вынуждены отказаться от этого подхода в связи с существенным изменением фенотипа клеток при активации. Так, при 4-часовой активации МНПК наблюдалось снижение экспрессии CD4 и CD45RO и заметный рост экспрессии CCR6 (рис. 1, а). При 22-часовой активации экспрессия CCR6 увеличивалась многократно, в результате чего эту молекулу несли практически все Т-хелперы. Эти сильные изменения фенотипа не позволили выделить объект нашего исследования, а именно содержащуюся в исходных образцах крови малочисленную группу зрелых CСR6⁺ Т-хелперов. Вместо этого мы выделяли в гейт большое количество Т-хелперов, исходно лишенных молекулы CCR6 и экспрессирующих ее в процессе активации. По продукции IFN-γ и IL-17А эти клетки не отличались от общей группы зрелых CD4⁺CD45RO⁺ Т-хелперов: большинство продуцентов являлись Тх1, синтезирующими IFN-γ, тогда как количество продуцентов IL-17А было ничтожным (рис. 1, б).

Рис. 1. Изменение фенотипа CD4+ Т-хелперов в зависимости от условий активации неразделенных МНПК: а — МНПК культивировали без активации или активировали ФМА и иономицином в течение 4 или 22 ч. При цитометрическом анализе выделяли в гейт CD4+ Т-лимфоциты, а затем, из их состава — CD45RO+ Т-хел­перы (гейт Р3) и CCR6+ Т-хел­перы (гейт Р4). Количество этих клеток указано над гейтами как процент от всех Т-хелперов. Справа показана экспрессия IFN-γ и IL-17А CD45RO+ Т-хелперами в тех же условиях активации. Доля IFN-γ+IL-17А– клеток (%) указана в квадрантах Q1, IFN-γ+IL-17А+ — в Q2, IFN-γ–IL-17А+ — в Q4; б — экспрессия IFN-γ и IL-17А при 4-часовой активации МНПК и последующем выделении в гейты Т-хелперов с различным фенотипом (указан над графиками)

В результате мы отказались от этого метода и приняли решение выделять целевую группу клеток из состава МНПК с помощью магнитной сепарации и лишь затем подвергать очищенные клетки активации. Поскольку коммерческих наборов для выделения зрелых CCR6⁺ Т-хелперов не существует, нам пришлось модифицировать метод очистки, используя набор для выделения CD4⁺ Т-хелперов и отдельные реагенты из набора для обогащения Тх17.

Использованная нами схема очистки была следующей. На первом этапе сепарации из МНПК выделяли CD4⁺ Т-хелперы негативной селекцией. При этом все клетки, отличные от Т-хелперов, с помощью антител к линейным маркерам связывали с магнитными бусами и отделяли на магните, а свободные от бус Т-хелперы собирали для следующего этапа разделения. На втором этапе из состава Т-хелперов выделяли CCR6⁺-клетки, связывая их с бусами при помощи соответствующих антител. Меченные бусами клетки выделяли на магните, снимали с них бусы и получали конечный продукт — CCR6⁺ Т-хелперы. Фенотипический анализ показал, что данный способ эффективно позволяет выделять группу Т-хелперов с высоким уровнем экспрессии CCR6, тогда как слив содержит CCR6^– Т-хелперы и остаточное количество Т-хелперов с низким уровнем экспрессии CCR6 (рис. 2). Поскольку выраженной экспрессией CCR6 обладают исключительно зрелые Т-клетки [1], конечный продукт сепарации содержал практически чистую группу зрелых клеток с фенотипом CD4⁺CD45RO⁺CСR6⁺. Чистота выделения CD4⁺ клеток уже после первого этапа сепарации превышала 99%, чистота CD4⁺CD45RO⁺CСR6⁺ клеток после второго этапа сепарации превышала 90% (см. рис. 2). Таким образом, клетки, выделенные с помощью данного метода, соответствуют объекту исследования — зрелым циркулирующим CСR6⁺ Т-хелперам.

Рис. 2. Схема сепарации CCR6+ Т-хелперов: а — фенотип клеток, полученных на этапах очистки; фенотип конечного продукта очистки — зрелых CCR6+ Т-хелперов — выделен в рамку; б — контроль окрашивания МНПК и конечного продукта очистки (в рамке). Клетки последовательно гейтированы: лимфоциты — в гейт R1, затем CD4+ лимфоциты — в гейт R2, затем CD4+CD45RO+CCR6+ лимфоциты — в гейт R3. Над гейтами указана доля клеток с соответствующим фенотипом в процентах от общего числа лимфоцитов

Для отработки метода оценки функциональных свойств очищенные CСR6⁺ Т-хелперы здоровых доноров активировали смесью ФМА и иономицина в течение 4 или 22 ч. Контролем служили клетки без активаторов. Для накопления продуцируемых цитокинов внутри клеток во все культуры добавляли ингибитор внутриклеточного транспорта брифелдин А на последние 4 ч культивирования. Окрашивание IFN-γ и IL-17А показало, что зрелые циркулирующие CСR6⁺ Т-хелперы не продуцируют эти цитокины без активации (рис. 3, а). Краткосрочная активация вызывала накопление IFN-γ и IL-17А в двух различных группах клеток — Тх1 и Тх17 соответственно. Также обнаружилось небольшое количество клеток со смешанными свойствами — Тх1/Тх17. При активации клеток в течение 22 ч с добавлением брифелдина А на последние 4 ч культивирования количество выявляемых Тх1 существенно не изменялось, тогда как Тх17 практически переставали обнаруживаться. Следует предположить, что Тх17, входящие в состав зрелых CСR6⁺ Т-хелперов крови, после активации быстро начинают продуцировать IL-17А, но полностью заканчивают продукцию к 18 ч, тогда как Тх1 сохраняют продукцию IFN-γ в течение всего срока культивирования.

Рис. 3. Экспрессия IFN-γ и IL-17А очищенными зрелыми CCR6+ Т-хелперами доноров в зависимости от условий активации: а — слева направо: контроль окрашивания; клетки, культивированные 4 ч без активации; активация в течение 4 ч; активация в течение 22 ч; б — доля клеток, продуцирующих IFN-γ, IL-17А и оба цитокина одновременно, в культурах зрелых CCR6+ Т-хелперов (CCR6+ Тх) и неразделенных Т-хелперов (все Тх), активированных в течение 4 ч после 18 или 114 ч преинкубации; в — репрезентативный результат экспрессии IFN-γ и IL-17А в клетках культур зрелых CCR6+ Т-хелперов (левая пара графиков) и неразделенных Т-хелперов (правая пара графиков). Верхний ряд графиков — контроль окрашивания

Неактивированные очищенные клетки оказались способны переносить длительное культивирование без утраты своих функциональных свойств. Мы культивировали эти клетки в среде без активаторов ночь (18 ч) или 114 ч, а затем активировали их в течение 4 ч в присутствии брифелдина А. При 18-часовой преинкубации в культурах было обнаружено сходное количество Тх1 и Тх17 и незначительное количество Тх1/Тх17 (рис. 3, б). При 114-часовой преинкубации количество клеток, демонстрирующих свойства Тх1, Тх17 и Тх1/Тх17, не снижалось и даже имело тенденцию к росту. Т-хелперы, не разделенные по наличию и отсутствию CCR6 (клетки, полученные на первом этапе очистки), в аналогичных условиях активации преимущественно демонстрировали свойства Тх1 (см. рис. 3, б, рис. 3, в).

Для сравнения CСR6⁺ Т-хелперов крови в норме и при язвенной болезни эти клетки выделяли магнитной сепарацией, преинкубировали в течение 18 ч и активировали ФМА и иономицином в присутствии брифелдина А в течение 4 ч. Выход очищенных зрелых CСR6⁺ Т-хелперов у здоровых доноров составляет 0,13±0,02% от исходного количества МНПК, а у больных язвенной болезнью — 1,04±0,31% (р=0,02). Количество зрелых CCR6⁺ Т-хелперов, выделяемое из 1 мл крови пациентов с язвенной болезнью, было в 9 раз больше, чем у здоровых доноров (рис. 4, а). Выделенные у больных CСR6⁺ Т-хелперы содержали в своем составе достоверно бóльшие доли Тх1, Тх17 и Тх1/Тх17 по сравнению с аналогичными клетками здоровых доноров (рис. 4, б). Расчет выхода провоспалительных типов Т-хелперов из крови показал, что из 1 мл крови больных выделяется в 18,1 раза больше CСR6⁺ Тх1 (р=0,02), в 19,4 раза больше CСR6⁺ Тх17 (р=0,03) и в 21,1 раза больше CСR6⁺ Тх1/Тх17 (р=0,03) по сравнению с кровью здоровых доноров (рис. 4, в).

Рис. 4. Выход зрелых CCR6+ Т-хелперов из крови здоровых доноров (n=15) и больных язвенной болезнью (n=7) и продукция цитокинов этими клетками: а — выход зрелых CCR6+ Т-хелперов из 1 мл крови; б — доля продуцентов цитокинов в культурах зрелых CCR6+ Т-хелперов; в — выход зрелых CCR6+ Т-хелперов, продуцирующих цитокины, из 1 мл крови. Комбинация цитокинов — под гистограммами; * — статистически значимые отличия от доноров в t-тесте (р<0,05)

Заключение

С использованием иммуномагнитной сепарации получены пробы функционально активных зрелых CСR6⁺ Т-хелперов крови с чистотой более 90%. Выход этих клеток из крови пациентов с H. pylori-ассоциированной язвенной болезнью в 9 раз превышает их выход из крови здоровых доноров. Активация очищенных CСR6⁺ Т-хелперов ex vivo выявляет повышенное содержание Тх1, Тх17 и Тх1/Тх17 в этой группе клеток при язвенной болезни. Рост содержания зрелых CСR6⁺ Т-хелперов крови и их повышенная провоспалительная активность согласуются с предположением о патогенетическом значении этой группы клеток при H. pylori-ассоциированной язвенной болезни.

Финансирование исследования. Работа выполнена за счет средств проекта Российского фонда фундаментальных исследований №18-015-00028-а (в части модификации метода сепарации CCR6⁺ Т-хелперов), отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (в части исследования H. pylori-инфекции).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.