Сорбция интерлейкинов 12 и 23 с помощью разработанного магнитоуправляемого сорбента на основе Устекинумаба

Введение

Известно, что в патогенезе многих ревматических аутоиммунных заболеваний, включая и псориатический артрит, ведущую роль играют белковые регуляторы, которые являются медиаторами роста и участвуют в дифференцировке лимфоидных и мезенхимальных клеток и клеток иммунного воспаления. Именно клетки иммунной системы, такие как фибробласты, тромбоциты, моноциты, макрофаги, синтезируют цитокины, интерлейкины, интерфероны и другие факторы иммунного воспаления [1–3].

При псориатическом артрите и других иммунных заболеваниях наблюдается патологический синтез интерлейкинов 12 и 23 (IL-12 и IL-23). Повышенное содержание IL-12 синхронизировано с количеством IL-1, IL-2, IL-10, интерфероном-α (IFN-α) и фактором некроза опухоли-α (TNF-α). Их повышенный уровень обнаружен в синовиальной ткани.

Указанные интерлейкины являются гетеродимерными цитокинами, содержат две субъединицы гликозилированных протеинов, соединенные дисульфидными связями и имеющие общую субъединицу р40. При взаимодействии ее с субъединицей р35 образуется IL-12, а с субъединицей р19 — IL-23. Эти цитокины синтезируются преимущественно макрофагами, дендритными клетками. Они реализуют свое биологическое действие, фиксируясь на двухцепочечных гетеродимерных рецепторных комплексах, которые находятся на поверхности СD4⁺ Т-лимфоцитов и естественных киллеров (NК-клеток). IL-23 стимулирует Тh17-лимфоциты, которые начинают продуцировать провоспалительные факторы, включая IL-17, а те по принципу обратной связи вызывают синтез других провоспалительных агентов [4–7].

В последние годы с помощью методов биотехнологии созданы принципиально новые противовоспалительные средства — генно-инженерные биологические препараты, применение которых позволило существенно повысить эффективность фармакотерапии ревматических заболеваний. К ним относятся моноклональные антитела к определенным детерминантам иммунокомпетентных клеток, или провоспалительным цитокинам, и гибридные белковые молекулы, ингибирующие активность цитокинов или взаимодействие Т- и В-лимфоцитов. Основным преимуществом этих препаратов является их высокая специфичность, которая обеспечивает селективное воздействие на определенные звенья патогенеза иммуновоспалительных заболеваний, в минимальной степени затрагивая нормальные механизмы функционирования иммунной системы [8].

В настоящее время для лечения псориатического артрита широко используется парентеральное введение ингибитора IL-12 и IL-23 — генно-инженерного биологического препарата Устекинумаба (Cilag AG, Швейцария) на основе моноклональных антител к IL-12 и IL-23 [8, 9]. Этот коммерческий препарат — ингибитор интерлейкина, представляющий собой человеческие моноклональные антитела класса IgG1k, продуцируемые рекомбинантной клеточной линией и проходящие многоступенчатую очистку, включая ин­активацию и удаление вирусных частиц. Высокое био­логическое сродство и специфичность препарата к субъединице p40 интерлейкинов человека IL-12 и IL-23 обеспечивает блокирующий эффект, предот­вращая их активное взаимодействие с рецептором IL-12Rβ1 и с субъединицей р40, одновременно нейтрализуя обе молекулы. Данный препарат быстро снижает активность заболевания, замедляет деструкцию пораженных суставов. Однако побочные эффекты — частые аллергические и инфузионные реакции — и высокая стоимость ограничивают его применение для одного и того же больного. Удобным патогенетическим инструментом подавления активности изучаемых интерлейкинов при аутоиммунных заболеваниях служит элиминация их из кровотока с помощью магнито­управляемых сорбентов. Известен метод удаления цитокинов с помощью углеродного сорбента с поверхностью, локально модифицированной аминокапроновой кислотой [10]. В этом случае сорбция цитокинов из сыворотки крови осуществляется через твердофазный носитель — модифицированную поверхность углеродного адсорбента аминокапроновой кислотой с последующей ее поликонденсацией. Авторами для снижения концентрации провоспалительных цитокинов IL-12 и IL-23 предложено пропускание крови больных псориатическим артритом через предварительно полученные методом эмульсионной полимеризации гранулы [11]. Источником антител к интерлейкинам явился коммерческий препарат Устекинумаб [12].

Цель исследования — оценка сорбционной возможности препарата на основе интерлейкинов 12 и 23 Устекинумаба при использовании его с магнитоуправляемым сорбентом.

Материалы и методы

Обработке in vitro подвергалась гепаринизированная кровь 10 больных псориатическим артритом различной степени активности, которым в течение 12 мес не проводилось парентерального введения ингибиторов цитокинов. Для контроля использовали кровь 10 здоровых доноров, процедура перфузии была аналогичной.

В качестве источника антител к IL-12 и IL-23, которые были иммобилизованы на гранулы сферической формы с размером частиц 10–100 мкм, использован Устекинумаб с концентрацией моноклональных антител 0,2 мг в 1 мл физиологического раствора. После завершения полимеризации гранулы отмывали.

Определение удельной сорбционной емкости магнитоуправляемых полиакриламидных гранул (МПГ) проводилось следующим образом. Через мини-колонку с объемом рабочей камеры 0,2 мл, заполненную МПГ, пропускали 1 мл смеси растворов IL-12 и IL-23 с возрастающими концентрациями. После перфузии каждого варианта раствора МПГ заменяли, контур промывали 1 М глицин-HCI буфером, pH-2,2 и стандартным фосфатно-солевым буферным раствором. Концентрацию IL-12 и IL-23 в десорбированных растворах определяли методом ИФА с использованием коммерческих наборов (Bender MedSystems, США — для IL-12, Bender MedSystems, Австрия — для IL-23). При изучении получающихся растворов IL-12 и IL-23 с исходными концентрациями 5, 10, 50, 100, 500, 1500 пг/мл после их перфузии через МПГ интерлейкины практически не определялись.

Статистическая обработка данных проводилась с применением пакетов программ Statistica 6.0, Excel 5.0, Statgraphics 3.0, SPSS 12.0. Выборочные характеристики выражались как среднее значение (М) и стандартное отклонение (σ). Для оценки количественных различий в разных группах применяли t-критерий Стьюдента. Полученные результаты оценивались с помощью величины р (p-value) — вероятность того, что получаемый в исследовании эффект носит случайный характер. Значение р<0,05 было принято условием статистической значимости различий значений.

Результаты и обсуждение

Динамика плазменной концентрации интерлейкинов у доноров и больных псориатическим артритом приведена в табл. 1. Показано, что при перфузии через магнитоуправляемый сорбент достигается статистически значимое снижение содержания IL-12 и IL-23 от исходного как у больных, так и у здоровых лиц. При этом максимально возможное снижение уровня цитокинов имеет большое практическое значение, так как они играют ведущую роль в патогенезе псориатического артрита. При использовании описанного в литературе [10] углеродного сорбента их концентрация уменьшается на 92,6% от исходного.

---

Таблица 1. Изменение концентраций IL-12 и IL-23 в результате перфузии через магнитоуправляемые полиакриламидные гранулы с иммобилизованными к ним антителами, % (M±σ)

---

Перфузия крови через сорбент осуществлялась в аппарате, содержащем колонку объемом 10 мл, оборудованную электромагнитом, в которую вносили МПГ с иммобилизованными антителами к IL-12 и IL-23. Через колонку перфузировали 20 мл нативной гепаринизированной крови со скоростью 10 мл/ч. После окончания перфузии МПГ отмывали от несвязавшихся белков забуференным физиологическим раствором (pH=7,4) и проводили регенерацию 1 М глицин-HCI буфером pH=2,2 по 10 мин. После первой регенерации потеря сорбционной емкости составила 15%. При последующих повторных регенерациях (9 раз) статистически значимых изменений удельной сорбционной емкости не происходило.

Концентрацию цитокинов IL-12 и IL-23 плазмы крови определяли методом ИФА с использованием коммерческих наборов Bender MedSystems, так же оценивали содержание форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов). Значения всех исследуемых показателей для каждого образца измеряли двукратно — до и после перфузии.

При удалении цитокинов содержание форменных элементов крови статистически значимо не меняется, что является дополнительным преимуществом предложенного способа перфузии (табл. 2).

---

Таблица 2. Изменение концентрации форменных элементов крови в результате перфузии через маг­нитоуправляемые полиакриламидные гранулы с иммобилизованными антителами к IL-12 и IL-23 (M±σ)

---

Заключение

Результаты сорбции IL-12 и IL-23 с использованием синтезированного нами магнитоуправляемого сорбента на основе полиакриламидного геля и Устекинумаба говорят о высоком и эффективном удалении патогенетических цитокинов. Этот сорбент обладает малой травматичностью по отношению к форменным элементам крови и низкой неспецифической сорбцией. Экстракорпоральное удаление цитокинов из кровотока может быть перспективным подготовительным этапом при лечении генно-модифицированными препаратами больных с ревматическими заболеваниями. Подобные действия при использовании антительных коммерческих препаратов на основе специфических моноклональных иммуноглобулинов и при возможном «цитокиновом штурме» в патогенезе аутоиммунных болезней можно применять в терапии и других ревматических заболеваний.

Финансирование исследования. Работа не имела спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.