Современные технологии диагностики грибкового кератита (обзор)

Введение

Грибковый кератит — это инфекционное заболевание, характеризующееся поражением роговицы патогенными грибами, тяжелым течением и высоким риском неблагоприятного исхода с потерей зрения или глаза как органа.

По выражению ряда микробиологов, медицинская микология долгое время играла роль Золушки в микробиологическом семействе [1, 2]. В последние годы на фоне широкого и зачастую нерационального применения антибиотиков, а также увеличения количества пациентов, получающих гормональную и иммуносупрессивную терапию, грибковые инфекции стали встречаться значительно чаще, а медико-социальный и медико-экономический ущерб от них вызывает большие опасения [3, 4]. Та же тенденция прослеживается и в отношении грибковых кератитов, доля которых среди общего числа инфекционных кератитов постепенно растет в течение последних десятилетий [5, 6]. Так, в 2017–2019 гг. заболеваемость микозами роговицы не падала ниже отметки в 1 млн случаев в год [7, 8]. Ежегодно патология роговицы приводит к потере зрения у 1,5–2 млн человек [9]. Наибольшее число случаев приходится на развивающиеся страны с жарким и влажным климатом, где значительная доля населения вовлечена в сельское хозяйство. Так, с 1990 по 2020 гг. лидирующими странами по заболеваемости грибковым кератитом были Парагвай, Эфиопия, Шри-Ланка, Бангладеш, Индия и Китай [10]. Кроме того, факторами риска являются офтальмологические операции и ношение мягких контактных линз (МКЛ). Если одно из этих событий приводит к инфицированию, запускается цепочка процессов, обусловливающих более глубокое повреждение роговицы. Патогенез грибкового кератита включает поражение роговицы непосредственно грибковым агентом и опосредованно — за счет бурно развивающейся воспалительной реакции.

Распространенность заболевания не всегда обеспечивает достоверность диагностики, особенно в регионах с низкой настороженностью врачей. Клиницисты из США установили, что американские офтальмологи правильно определили наличие инфекционного кератита в 73% случаев среди пациентов с положительным результатом посева, а грибковую этио­логию идентифицировали лишь в 38% случаев [11]. Стертая клиническая картина и отсутствие патогномоничных признаков ограничивают возможности раннего выявления и своевременного назначения специфического лечения.

Разнообразие грибковой инфекции, сложность диагностики, отсутствие официнальных офтальмологических препаратов, универсальных схем терапии и способов доставки препаратов объясняют как частую необходимость хирургического вмешательства, так и высокие риски снижения и потери зрения: ежегодно в связи с осложнениями грибкового кератита удаляют 84 143–115 697 глаз [8]. По данным литературы, перфорация роговицы в связи с грибковой инфекцией развивается в 6 раз чаще, чем при кератитах другой этиологии [12, 13], значительно чаще требуется кератопластика [14]. Чтобы избежать этих неблагоприятных последствий, постоянно ведутся поиски нового оптимального метода диагностики, поскольку посев грибковой культуры и прямая микроскопия окрашенных мазков, являющиеся «золотым стандартом», соответствуют не всем современным требованиям. Метод должен быть достаточно простым и независимым от опыта специалиста, доступным по стоимости, должен быстро и точно определять этиологический фактор. Подобный метод в сочетании с анализом на чувствительность к антибиотикам позволит выбрать дальнейшую тактику и улучшить прогноз.

Стратегия поиска литературы. Поиск работ проводился в базах PubMed (MEDLINE) и eLIBRARY.RU с использованием ключевых слов «микоз роговицы» («keratomycosis») или «грибковый кератит» («fungal keratitis»), «грибковые заболевания» («fungal diseases») и «глаз» («eye»). Тематические публикации выявляли при просмотре списков литературы соответствующих статей.

Этиология

Царство грибов включает в себя более 1,5 млн видов, и лишь некоторые из них известны как патогенные для человека. Классификация грибов, ранее основанная на морфологических признаках, в последние годы претерпела существенные изменения, связанные с тем, что в ее основу легли генотипические различия. В результате произошла значимая перегруппировка видов между известными типами грибов. Клиническое значение имеет разделение патогенных грибов по морфологии на нитчатые и дрожжевые, а также по месту их естественного обитания — на зоо­филь­ные, геофильные и антропофильные. Средой обитания последних является тело человека, и многие из них способны вызвать кератит. Следует выделить наиболее часто встречаемые, а соответственно, и более значимые для клиницистов патогенные грибы. При анализе клинических случаев грибкового кератита за последние 20 лет род Fusarium был обнаружен в 40% случаев, род Aspergillus — в 31%, Curvularia — в 6%, а дрожжевой гриб рода Candida стал причиной заболевания в 4,5% случаев (из них C. albicans составил 67,87%) [10]. Спектр и соотношение этиологических факторов меняются от региона к региону даже в пределах одной страны. В отдельных исследованиях встречаемость рода Fusarium достигала 61,9% [15], а Candida — 72,22% [16]. При этом пациенты предъявляют сходные жалобы: ощущение инородного тела, слезотечение, светобоязнь, покраснение глаза, затуманивание и снижение зрения [17]. Ни один из симптомов не является патогномоничным для грибкового кератита, и отличить его от инфекции другой этиологии часто не представляется возможным из-за схожей клинической картины [18]. Сложность определения этиологического фактора и широкое разнообразие возбудителей создают трудности в диагностике и подборе этиотропной терапии, в связи с этим врачам во многом приходится ориентироваться на данные тщательно собранного анамнеза и выявлять характерные факторы риска.

Факторы риска

Считается, что здоровая роговица устойчива к инфицированию грибковыми агентами, а значит, необходимы факторы, способствующие заражению и приводящие к развитию инфекции [19].

Факторы риска грибкового кератита:

травмы глаза — от 26% [20] до 39% [21] случаев;

оперативные вмешательства на роговице — 37,6% [22];

использование контактных линз — от 24,5% [23] до 42% [20];

заболевания роговицы — от 28% [23] до 51,3% [22];

системная и местная иммуносупрессия — 35,9% [22].

Как правило, грибковой инфекции предшествует механическое повреждение роговицы, поэтому наиболее распространенными факторами риска являются травмы и вмешательства с нарушением ее целостности. Наиболее опасны травмы предметами органической и неорганической природы (ветками, листьями, камнями, песком) с попаданием частиц почвы. Контактная коррекция нередко сопровождается микротравмами, особенно при несоблюдении правил использования МКЛ; постоянное ношение линз также вызывает локальные гипоксию и гиперкапнию, которые влияют на способность эпителия реагировать на повреждение [24]. Возрастает число зарегистрированных фузариозных кератитов у пациентов, использующих МКЛ [25, 26], а редкие случаи кератита, вызванные оппортунистом Arthrograthis kalrae, в абсолютном большинстве связаны с контактной коррекцией [27]. По результатам одного из исследований, применение МКЛ чаще ассоциировалось с кератитом, вызванным нитевидными грибами (50%), чем дрожжевыми (18,2%), а заболевания глазной поверхности были распространенным фактором риска при любой этиологии [22]. Из числа офтальмологических операций наибольшую опасность для возникновения грибкового кератита создает сквозная кератопластика [28], причем грибковый кератит может рецидивировать в трансплантате [29]. Интересно, что различные варианты послойной кератопластики имеют больший риск микотических осложнений (0,023% [30]) по сравнению со сквозной кератопластикой (от 0,012 [30] до 0,016% [31]). В ходе наблюдений замечено, что грибковый кератит осложняет восстановление после трансплантации эндотелия и десцеметовой мембраны не только в раннем постоперационном периоде (0,15% случаев [32]), но и спустя несколько лет после операции [32, 33]. Описаны случаи осложнений после имплантации бостонского кератопротеза 1-го типа (kpro) [34].

Стоит заметить, что и более щадящие вмешательства не гарантируют отсутствия осложнений. M. Soleimani и A.A. Haydar [35] столкнулись со случаем тяжелого одностороннего грибкового кератита через четыре дня после лазерной коррекции зрения по методике SMILE, известной своей малой инвазивностью. Сформировавшаяся язва не поддавалась медикаментозному лечению и требовала сквозной кератопластики в связи с перфорацией. Из-за интрастромального расположения лентикулы и, как следствие, быстрого распространения инфекции в глубокие слои роговицы лечение инфекционного кератита после SMILE оказалось наиболее сложным [35].

Серьезным фактором риска развития грибковых поражений роговицы считается применение местных антибиотиков и кортикостероидов [36]. Ингибируя воспалительный процесс, кортикостероиды усугубляют иммуносупрессивный эффект, оказываемый грибами. Вначале возможен промежуток мнимого улучшения от использования кортикостероидов, но вскоре наблюдается ухудшение: инфильтрация роговицы нарастает, количество секрета увеличивается, зрение снижается [37]. Кроме того, применение кортикостероидов после операции по поводу грибкового кератита в ряде случаев приводит к развитию реинфекции [35].

В зависимости от вида инфекционного агента и способа его попадания в толщу роговицы патогенез грибкового кератита может иметь некоторые особенности, однако во всех случаях это комплексный процесс, обусловленный множеством факторов.

Патогенез

Борьба между грибковым микроорганизмом и иммунной системой макроорганизма часто приобретает ожесточенный характер, поскольку факторы патогенности грибов разнообразны, а иммунный ответ не всегда соответствует им. Патогенность микроорганизма и биологическая нагрузка являются ведущими факторами, определяющими тяжесть течения кератита [38].

Грибы попадают в толщу роговицы через дефект эпителия и выделяют микотоксины, протеазы и лектины. Иммунные клетки идентифицируют чужеродный агент с помощью рецепторов опознавания паттерна, после чего нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки начинают активно секретировать хемокины (CXCL1 и CXCL2) и провоспалительные цитокины (IL-1b и TNF), которые привлекают все больше иммунных клеток в роговицу с целью элиминации патогена [39]. Избыточное число нейтрофилов и нарастающее воспаление обусловливают прогрессирование кератита, что ведет к поражению стромы и помутнению роговицы [40, 41], т.е. возникает порочный круг, где воспаление становится причиной дальнейшего повреждения тканей и потери зрения.

Факторы патогенности грибов. Микотоксины, выделяемые грибами, обладают антибактериальным, противовирусным, противоопухолевым и антифагоцитарным действием, угнетают местный иммунный ответ. Многие грибы секретируют протеазы: например, род Candida продуцирует кислые, нейтральные и карбоксильные протеазы, которые повышают способность гриба к инвазии [42]. Лектины в свою очередь угнетают рост клеток роговицы и разрушают клеточный каркас эпителия [43].

Гидрофобин — это нерастворимый протеиновый комплекс на поверхности спор, который наряду с микотоксинами затрудняет фагоцитоз, так как наличие гидрофобина предотвращает распознавание грибов клетками иммунитета [44].

Отдельно стоит отметить способность многих родов грибов к образованию биопленок [45], которые на сегодняшний день выделяют как отдельный патогенетический фактор [46]. Биопленки — это постоянно обновляющееся сообщество микроорганизмов, закрепленных на субстрате и окруженных полимерным матриксом, который защищает их от вредных воздействий [47–49]. Так, грибы рода Fusarium зачастую формируют биопленки на поверхности МКЛ [50], что и обусловливает распространенность фузариозных кератитов при использовании контактной коррекции. Подобная структура биопленок обеспечивает защиту от факторов окружающей среды, повышает устойчивость патогена к иммунной защите и противогрибковым средствам, облегчает адгезию, инвазию и распространение инфекции в тканях хозяина [46]. На примере C. albicans показано, что биопленочные формы подавляют высвобождение нейтрофильных внеклеточных ловушек и противостоят нейтрофильной атаке [51]. Исследования доказали, что биопленки обусловливают повышение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) противогрибковых препаратов (иногда МИК превышает таковые для планктонных форм в 100 и более раз) и играют роль в формировании резистентности [45, 52]. Антимикотиков, способных воздействовать на биопленки, немного, и все они индуцируют образование активных форм кислорода (АФК) [50].

Вероятно, именно способность грибов к угнетению иммунного ответа объясняет, почему в некоторых наблюдениях количество воспалительных клеток в роговице обратно пропорционально грибковой обсемененности, а в ходе разрастания гриба воспалительный процесс ослабевает [17, 53]. На фоне столь значимых особенностей патогенеза использование местных кортикостероидов приводит к затяжному течению и присоединению вторичной инфекции в случае хирургического лечения [35].

Факторы защиты макроорганизма. Повышен­ная экспрессия рецепторов распознавания паттерна в ответ на попадание чужеродного агента приводит к секреции интерлейкинов IL-1b, IL-6, IL-8, IL-17 и IL-23 нейтрофилами [54]. IL-1b способствует образованию АФК, замедляющих рост грибковых гиф. При этом АФК индуцируют продукцию IL-1b в еще большем количестве и могут повреждать окружающие ткани. Замечено, что некоторые грибы при оксидативном стрессе начинают синтезировать антиоксиданты и преодолевают этот защитный механизм [55]. Как следствие, нарастает уже имеющееся воспаление [56].

Доказано, что при инфицировании некоторыми грибами, в частности C. albicans и видами Aspergillus, запускается процесс аутофагии, представляющий собой деградацию органелл и белков в эукариотических клетках и являющийся регулятором внутриклеточного гомеостаза [57, 58]. Аутофагия уменьшает хемотаксис нейтрофилов и повреждающее действие патогена, способствует удалению внутриклеточных патогенов и ослабляет воспалительную реакцию в целом, в связи с чем этому процессу отводится ключевая роль в иммунном ответе [57].

Особенности патогенеза в зависимости от этиологии. Род Fusarium как представитель нитчатых грибов характеризуется «горизонтальным» ростом гиф параллельно коллагеновым волокнам, что приводит к поражению поверхностных слоев роговицы, тогда как для рода Aspergillus и дрожжей Candida более характерен «вертикальный» рост перпендикулярно коллагеновым волокнам, вследствие чего нарушается нормальное расположение волокон коллагена, а возбудитель проникает в глубокие слои стромы [59, 60]. Особенностью Candida считается продукция фосфолипазы А, облегчающей проникновение в ткани, и лизофосфолипазы, защищающей клетки дрожжей от действия других ферментов [61]. Нитчатые грибы размножаются в строме роговицы без высвобождения хемотаксических веществ, что опять же задерживает развитие иммунного ответа. При прогрессировании заболевания грибы проникают и сквозь ранее интактную десцеметову мембрану [42, 62]. Более того, грибковый кератит может возникать вторично по отношению к грибковому эндофтальмиту. В этом случае поражение начинается из заднего сегмента, патоген преодолевает десцеметову мембрану и поражает строму роговицы [63]. Таким образом, «горизонтальный» рост и защита от иммунного ответа при кератите, вызванном нитчатыми грибами, связаны с менее благоприятным исходом, в связи с чем чаще требуется хирургическое лечение [64]. В частности, исследования показывают, что однократное оперативное вмешательство может быть недостаточным при поражении нитчатыми грибами. Описаны случаи лечения язв роговицы, вызванных видами Aspergillus, когда сквозную кератопластику приходилось повторять до 4 раз по причине появления грибковых инфильтратов в кератотрансплантате или возникновения эндофтальмита [65].

Особенности патогенеза являются ключом для свое­временной диагностики и идентификации возбудителя, что в дальнейшем способствует назначению адекватной этиотропной терапии в достаточной дозировке.

Диагностика

Установление этиологии кератита является необходимым условием для определения тактики и прогноза лечения, в то время как видовая идентификация конкретного патогена имеет второстепенное значение. Построенное с подобных позиций исследование продемонстрировало, что практикующим офтальмологам удается безошибочно дифференцировать грибковый и бактериальный кератит по фотографиям только в 66% случаев [66]. К причинам поздней диагностики относят отсутствие патогномоничных симптомов, нередко — вялое течение и стертую клиническую картину, способность маскироваться под кератиты другой этиологии. Зачастую грибковый кератит может быть принят пациентом за конъюнктивит, за чем следует самостоятельное лечение с применением антибиотиков и противовоспалительных средств для быстрого купирования симптомов. Даже в странах Африки с лидирующим числом случаев микотических поражений роговицы поступление больных к специалисту откладывается в среднем на 14 дней, а при посещении нескольких медицинских учреждений задержка составляет в среднем 21 день [67]. Промедление снижает шансы на своевременную диагностику и лечение. Так, описан случай тяжелого торпидного течения болезни в Казахском научно-исследовательском институте глазных болезней, куда пациентка поступила через 4 мес после получения травмы хвостом коровы. Несмотря на комплексное лечение, в течение месяца сохранялась угроза перфорации, в исходе сформировалось тотальное помутнение роговицы [68]. Подобные примеры указывают на важность повышения осведомленности пациентов и укрепления их доверия врачам.

Ведущую роль в раннем выявлении грибкового кератита играют настороженность и опыт врача, а также оснащение клиники. На актуальность проблемы указывают работы по созданию и тестированию разнообразных методов диагностики. Острота проблемы в тропических странах привела к созданию экспресс-метода, основанного на использовании складного микроскопа на базе смартфона как альтернативы световому микроскопу в областях с ограниченными ресурсами [69].

Биомикроскопия. Выделяют несколько признаков, по которым можно заподозрить грибковое поражение роговицы при биомикроскопии [70–72]:

облаковидные или творожистые многоочаговые сероватые инфильтраты с перистыми или фестончатыми границами;

сателлитные инфильтраты, расположенные вблизи основного очага и отделенные от него прозрачным участком [42];

кольцевидные инфильтраты;

мицелий-подобные стромальные разрастания;

эндотелиальные бляшки (не визуализируются при выраженной инфильтрации роговицы) [73].

Помимо проявлений, характерных для большинства грибковых кератитов, следует отметить зазубренные или «перистые», нечеткие края у фузариозных язв и приподнятую поверхность очагов аспергиллезного кератита, который чаще сопровождается гипопионом [74]. В случае стромального кератита, вызванного дрожжеподобными грибами, можно увидеть небольшой проминирующий шаровидный инфильтрат [75].Ни один из признаков не является патогномоничным для грибкового кератита, к примеру, кольцевидные инфильтраты характерны и для акантамебного кератита [76–78]. На сегодняшний день ведущими методами диагностики остаются культуральный метод и прямая микроскопия соскоба роговицы с применением красителей.

Культуральный метод. Посев биологического материала производится на питательную среду с целью культивирования микроорганизмов и дальнейшей оценки полученной колонии. Материал для посева может быть взят при соскобе роговицы, биопсии или при сквозной кератопластике. Далее образец засевают на питательную среду, в частности на жидкую глюкозо-пептонную среду Сабуро или кровяной и шоколадный агары, агар с сердечно-мозговой вытяжкой [79]. По особенностям внешнего вида колоний (цвет, форма, консистенция, наличие спор, гиф и псевдогиф) определяют родовую и иногда — видовую принадлежность возбудителя. Метод считается «золотым стандартом» диагностики, достаточно прост и не требует больших затрат, но все же имеет некоторые ограничения: сложность видовой диагностики, поздние сроки получения результатов посева (около недели) [80, 81], зависимость от опыта исследователя, нетипичная морфология некоторых колоний, нехватка знаний о подходящих условиях культивирования, недоступность стромальных слоев при соскобе роговицы в случае глубокого проникновения грибов [82], ложноотрицательные результаты посева в случае недостаточного размера соскоба или прогрессирования деструкции роговицы, влияние на результаты посева предшествующей эмпирической терапии [83]. Так, в одном из исследований у 37% пациентов с грибковым кератитом были получены отрицательные результаты посева и неустановленные лабораторные диагнозы, причиной этому посчитали предшествующую антибиотикотерапию до поступления в больницу [84]. Стоит отметить, что при обнаружении положительной культуры идентифицировать возбудителя удается только в 40–60% случаев [17].

На данный момент рекомендуется проведение повторного посева через шесть дней от начала этио­тропной терапии для оценки эффективности лечения и уточнения прогноза [85]. Обнаружено, что при положительном повторном посеве повышается риск перфорации и возрастает необходимость в проведении сквозной кератопластики. Таким образом, посев через шесть дней от начала лечения может помочь скорректировать терапию, избежать критического снижения остроты зрения и оперативного лечения [86].

Прямая микроскопия с окрашиванием. Метод отличается простотой и быстротой. Используют различные способы окраски образца: окрашивание по Граму и по Гимзе, фиксация раствором гидроксида калия, окрашивание лактофенолом хлопковым голубым, реактивом Шиффа, окрашивание по Гомори (метенамином-серебром) [85, 87]. Материалом также могут быть соскоб роговицы, биоптат или фрагмент роговицы, взятый при сквозной кератопластике.

Благодаря окрашиванию при прямой микроскопии удается визуализировать гифы и их взаимное расположение, оценить вид мицелия [87]. Чувствительность метода колеблется в зависимости от способа окрашивания и в среднем достигает 90% [85, 88]. Будучи дешевой, простой и быстрой в исполнении, микроскопия позволяет незамедлительно назначить этиотропную терапию [85]. Как и культуральный метод, микроскопия является основополагающим этапом в диагностике, однако также имеет ряд недостатков. Успех применения данного метода зависит от глубины поражения роговицы, от количества и качества забранного материала, от опыта исследователя. Высока также вероятность неравномерного окрашивания препарата и обнаружения артефактов, кроме того, метод часто безуспешен в отношении рода Candida [85, 87].

Конфокальная микроскопия. Конфокальная микроскопия обеспечивает in vivo визуализацию дрожжевых и плесневых грибов в ткани роговицы. Данный метод имеет преимущества в связи с неинвазивностью и способностью преодолевать многие ограничения классических методик, а его чувствительность варьирует в пределах от 66,7 до 95,0% [89]. Убедительными критериями для подтверждения поражения роговицы мицелиальными грибами при конфокальной микроскопии считаются четко очерченные, ветвящиеся, сильно отражающие нити или гифы диаметром 3–10 мкм, обычно не наблюдаемые по отдельности. В случае дрожжевых грибов визуализируют псевдогифы, представляющие точечные структуры с разрывами или сужениями [89]. Конфокальная микроскопия также позволяет определять плотность гиф, а оценка в динамике помогает прогнозировать ответ на лечение, так как в ходе успешной терапии плотность гиф снижается [90]. Этот метод дает более быстрый, а в ряде исследований — и более точный результат, чем микроскопия мазка и посев. X. Jin с соавт. [73] установили, что диагностика грибкового кератита с помощью конфокальной микроскопии имеет успех в 92,9% случаев, при исследовании мазков — в 71,4%, а при помощи посева — в 42,9% случаев. Результаты конфокальной микроскопии подтверждены микроскопией окрашенной ткани роговицы. В некоторых случаях и посев, и полимеразная цепная реакция (ПЦР) уступают конфокальной микроскопии, и это свидетельствует, что метод может быть использован для ранней экспресс-диагностики [91]. В то же время Z. Ren с соавт. [83] обнаруживали грибковые патогены как с помощью конфокальной микроскопии, так и при исследовании мазка в 77,14% случаев, что указывает на наличие ограничений данного метода диагностики. К лимитирующим факторам относят невозможность видовой идентификации возбудителя, высокую стоимость, недостаточный опыт офтальмологов, проводящих исследование [92, 93], и малый размер образца [94]. Сильно затрудняют процедуру светобоязнь и блефароспазм [95].

Оптическая когерентная томография (ОКТ). С помощью этого метода можно обнаруживать характерные для микотического процесса изменения роговицы. По данным ОКТ, в области инфильтрата роговица утолщена, отмечается гиперрефлективность эпителия и эндотелия по сравнению со стромой. Строма диффузно утолщается, что свидетельствует об отеке, который в свою очередь приводит к изменению контура задней поверхности роговицы. При длительном течении развиваются рубцовые процессы, повышающие рефлективность стромы; пораженная роговица при этом может стать тоньше здоровых участков [20]. Специфическим ОКТ-признаком агрессивных форм грибкового кератита являются ограниченные, разного размера кистозные образования в строме, соответствующие некротизированным тканям [96].

С помощью ОКТ и конфокальной микроскопии более чем в 85% случаев можно визуализировать эндотелиальные бляшки, характерные для грибкового кератита [73] и трудно различимые при осмотре на щелевой лампе, особенно в условиях отека и инфильтрации роговицы [6]. Этот метод — быстрый, неинвазивный и более распространенный, чем конфокальная микроскопия. Признаки поражения роговицы являются только косвенным свидетельством присутствия грибкового патогена, вследствие чего судить о видовой принадлежности не представляется возможным, но стоит заметить, что ОКТ удобна для оценки состояния роговицы в динамике, позволяет отследить изменения по всей толщине роговицы.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР-диагностика относится к методам молекулярно-генетической диагностики и не уступает или даже превосходит микроскопию окрашенных препаратов и культуральные методы, обнаруживая фрагменты ДНК грибов даже в случаях с отрицательным посевом [81, 97].

Преимущества ПЦР неоспоримы: получить результаты возможно уже через 4 ч вместо 3–7 дней при культуральных исследованиях; метод обладает высокой чувствительностью, что позволяет обнаружить патоген даже в небольшом соскобе с язвы роговицы или в материале от больных, ранее получавших противо­грибковую терапию [81]. Как и другие молекулярно-генетические методы, ПЦР рассчитана на определение видовой принадлежности. Однако ее не рассматривают в качестве метода выбора в силу ограниченной доступности и высокой стоимости [98], более того, велика вероятность ложноположительного результата в связи с тем, что ПЦР обнаруживает и нежизнеспособные организмы [79].

Другие молекулярно-генетические методы. Еще более прогрессивным и точным методом является метагеномное исследование с преимущественной оценкой РНК и возможностью определения видового состава образца. C. Shigeyasu с соавт. [99] представили случай, когда образцы роговицы показывали отрицательные результаты при микробиологическом и гистологическом исследованиях, и лишь при помощи метагеномного анализа удалось обнаружить гены Fusarium solani. В другом исследовании микроскопия окрашенных препаратов показала чувствительность 70%, посев был положительным у 52% пациентов, а метагеномный анализ установил наличие патогена в 74% случаев, и это с учетом факта, что более половины больных уже получали лечение [100]. Данный метод превосходит классические даже при обильной контаминации образца [100].

К молекулярно-генетическим методам также относится масс-спектрометрия, основанная на анализе рибосомальных белков микроорганизма. Масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) позволяет идентифицировать возбудителя вплоть до вида в течение суток, что является неоспоримым преимуществом [21]. Для анализа используется слеза из пораженного и из здорового глаза для оценки ее белкового состава, так как при грибковых поражениях содержание белков изменяется специфическим образом [96]. Исследования чувствительности MALDI-TOF MS показывают противоречивые результаты, колеблясь в пределах от 51% [21] до 97% [87]. Малодоступность, дороговизна и необходимость постоянно пополнять банк данных протеомов микроорганизмов не позволяют сделать метод основным в диагностике грибкового кератита [101].

Ren с соавт. [83] представили первые результаты применения нового метода секвенирования внутренним транскрибируемым спейсером, или ITS-секвенирования. ITS — некодирующая последовательность ДНК, разделяющая повторяющиеся гены рРНК. Метод не ограничивается средой, временем, активностью грибов и размером образца, а также позволяет получать более полную информацию о микробиоме глаза. ITS-секвенирование показало результат, сравнимый с классическими методами и конфокальной микроскопией. Средние показатели эффективности в сочетании с рядом недостатков ITS-секвенирования, к которым относят зависимость от целостности базы данных, необходимость использования нескольких праймеров из-за их строгой специфичности для отдельных видов грибов, позволяют сделать вывод, что метод представляется необязательным дополнением для идентификации грибковых патогенов при диагностике грибкового кератита [83].

Несмотря на наличие широкого спектра известных диагностических технологий, ни один из методов не удовлетворяет всем требованиям клинической практики (см. таблицу), в связи с этим разработки новых подходов к выявлению грибкового кератита продолжаются [87]. В исследованиях in vivo на мышиной модели аспергиллезного кератита был протестирован неинвазивный зонд, состоящий из противогрибкового препарата в сочетании с флуорофорной меткой. Каспофунгин (CSF), антибиотик класса эхинокандинов, нацелен на специфичный для грибов фермент β-1,3-D-глюкансинтазу, отвечающий за биосинтез грибковой клеточной стенки. Препарат используется в субтерапевтических дозах для местного применения, что не дает измеримых системных концентраций. В качестве метки использовали 7-амино-9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он) — DDAO. Таким образом, связанные с зондом (L-CSF–DDAO) клетки флуоресцируют и могут быть визуализированы в ближней инфракрасной области. По результатам исследования in vitro L-CSF–DDAO легко выявлял элементы гиф Aspergillus spp., в то время как по отдельности CSF и DDAO не вызывали заметной флуоресценции. Анализ in vivo подтвердил способность зонда специфически связываться с грибковыми клетками в инфицированной роговице [102]. Каспофунгин доступен в форме раствора для инфузий и используется для лечения грибковых инфекций (в том числе кератитов), вызванных Candida spp. и Aspergillus spp., особенно резистентных к другим лекарственным средствам. Эффективность в отношении Fusarium spp. ограничена, а значит, возникает вопрос о возможности применения нового метода диагностики в случае фузариозных кератитов.

---

Основные характеристики методов диагностики

---

Анализ антимикробной чувствительности

Как бы быстро и точно ни был установлен возбудитель, при лечении грибкового кератита специалисту нередко приходится встречаться с препятствием для достижения благоприятного исхода — резистентностью грибов к антимикотикам. В превалирующем большинстве случаев формируется приобретенная резистентность, и в настоящее время она возрастает в связи с неконтролируемым использованием антибиотиков, назначением неадекватной эмпирической терапии. Грибы выработали множество приспособительных механизмов для сопротивления действию противогрибковых препаратов. В частности, они могут создать специальные транспортные системы в мембранах своих клеток для усиления выведения препарата из цитоплазмы или изменить конфигурацию мембраны, чтобы препарат не смог с ней связаться. Для противостояния действию антимикотиков группы полиенов, взаимодействующих с эргостеролом гриба, мицелий синтезирует клеточную стенку со сниженным содержанием эргостерола [104].

Подобные механизмы либо способствуют возникновению полной резистентности, либо приводят к увеличению МИК препаратов, в итоге использование ранее эффективного антимикотика не приводит к значительному улучшению, а микроорганизмы продолжают наращивать резистентность. Все это свидетельствует о необходимости проведения теста на чувствительность к противомикробным препаратам и определения МИК после выявления грибковой этиологии. Описан ряд клинических случаев, в которых подобный анализ имел ключевое значение, поскольку своевременная замена неэффективного антимикотика является залогом успешной профилактики перфорации роговицы [105]. Данные наблюдения напоминают о важности культуральных методов для лечения грибкового кератита и о рисках при назначении эмпирической терапии. Более того, факт нарастающей резистентности говорит о необходимости разработки немедикаментозных методов лечения как альтернативы фармакотерапии.

Заключение

Существующие методы диагностики грибкового кератита позволяют офтальмологам обнаружить то, что незаметно при рутинном осмотре. При этом культуральный метод и прямая микроскопия с окрашиванием как методы «золотого стандарта» зачастую оказываются недостаточными для своевременного обнаружения грибкового кератита, что связано с особенностями патогенеза в каждом отдельном случае. Растущая заболеваемость, медико-социальная и медико-экономическая значимость становятся стимулом для поиска новых методов диагностики. Формулировка требований к ним, выявление преимуществ и недостатков каждого подхода ведет исследователей к понимаю того, каким должен быть новый претендент на звание «золотого стандарта». В последние годы увеличивается частота применения методов ПЦР-диагностики, в некоторых областях медицины она успешно вошла в рутинную практику. На наш взгляд, ПЦР-диагностика является одним из наиболее перспективных методов выявления грибкового кератита, так как результаты можно получить уже через 4 ч, чувствительность метода достигает 94%, а также есть возможность определить вид патогенного гриба. Однако наряду с современными методами диагностики культуральный метод и прямая микроскопия не теряют своей актуальности в связи с их высокой доступностью и простотой.

Вклад авторов: А.В. Ситнова — сбор и анализ материала, написание текста, утверждение версии, подлежащей публикации; С.Н. Светозарский — концепция и дизайн работы, сбор и анализ материала, написание и редактирование текста, утверждение версии, подлежащей публикации.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Нижегородской области, в рамках конкурса на право получения гранта Нижегородской области в сфере науки, технологий и техники в 2022 г. (договор №316-06-16-16а/22 от 20.05.2022).

Конфликт интересов отсутствует.