Разработка ДНК-биочипа для параллельной детекции бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии

Цель исследования — разработка экспериментального варианта ДНК-биочипа для параллельной детекции бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии.

Материалы и методы. Исследовали образцы мазков слизистой оболочки глотки детей 1–15 лет с рентгенологически подтвержденным диагнозом «пневмония». Cелекцию ДНК-зондов для специфической детекции возбудителей внебольничной пневмонии (S. pneumoniae, H. influenzae, M. pneumoniae, C. pneumoniae и L. pneumophila) и разработку дизайна биочипа выполняли с помощью предложенной ранее программы disprose, нуклеотидные последовательности патогенов были получены из базы данных NCBI Nucleotide. В работе использованы биочипы ф. CustomArray (США). Для пулированного образца, содержащего ДНК S. pneumoniae и H. influenzae,проводили последовательный отбор наилучших сочетаний параметров гибридизации: размер фрагмента ДНК, количество ДНК, температура гибридизации. Критериями отбора служили процент эффективных зондов со стандартизированным сигналом гибридизации (ССГ) ≥3 Z и превышение уровней ССГ эффективных специфических зондов по сравнению с ССГ эффективных неспецифических зондов. Был проведен отбор зондов для детекции S. pneumoniae и H. influenzae, характеризующихся эффективным сигналом гибридизации в оптимальных условиях. Разработанный биочип в подобранных условиях протестирован на клинических образцах, содержащих ДНК S. pneumoniae или H. influenzae. С применением ROC-анализа установлены пороговые значения сигналов специфических зондов в точках оптимальной чувствительности и специфичности теста, превышение которых трактовали как свидетельство присутствия патогена в образце.

Результаты. Спроектирован дизайн биочипа, включающий 142 ДНК-зонда для детекции 5 основных видов возбудителей внебольничной пневмонии, которые были синтезированы на слайды.На примере клинических образцов, содержащих ДНК S. pneumoniae и/или H. influenzae, подобраны оптимальные параметры гибридизации ДНК на биочипы, позволяющие выявлять бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии с достаточной эффективностью, специфичностью и воспроизводимостью: количество гибридизуемой ДНК — 2 мкг, размер фрагмента ДНК — 300 н.о., температура гибридизации — 47°С. Отобран перечень зондов для специфической детекции S. pneumoniae и H. influenzae, характеризующихся эффективным сигналом гибридизации в выявленных условиях. Определены пороговые значения стандартизированных сигналов зондов для специфической детекции S. pneumoniae (4,5 Z) и H. influenzae (4,9 Z) в клинических образцах.

Заключение. Разработан и синтезирован ДНК-биочип для параллельной индикации бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии.Подобраны оптимальные параметры гибридизации ДНК на биочип для выявления бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии S. pneumoniae и H. influenzae, определены пороговые значения значимых сигналов зондов для их специфической детекции. Интерпретация результатов гибридизации биочипа соответствует результатам, полученным методом ПЦР. Данный биочип может использоваться для совершенствования лабораторной диагностики возбудителей внебольничной пневмонии.

1. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С., Авде­ев С.Н., Тюрин И.Е., Руднов В.А., Рачина С.А., Фе­сенко О.В. Клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике тяжелой внебольничной пневмонии у взрослых. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2015; 17(2): 84–126.
2. Ежлова Е.Б., Демина Ю.В., Ефимов Е.И., Брусни­гина Н.Ф., Малеев В.В., Тартаковский И.С., Биличеко Т.Н., Шкарин В.В., Ковалишена О.В., Чубукова О.А., Благонра­вова А.С. Внебольничные пневмонии: классификация, патогенез, этиология, эпидемиология, лабораторная диагностика на современном этапе. Аналитический обзор. М; 2013.
3. Rozenbaum M.H., Pechivanoglou P., van der Werf T.S., Lo-Ten-Foe J.R., Postma M.J., Hak E. The role of Streptococcus pneumonia in community-acquired pneumonia among adults in Europe: a meta-analysis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2013; 32(3): 305–316, https://doi.org/10.1007/s10096-012-1778-4.
4. World Health Organization. The top 10 causes of death. URL: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/ detail/the-top-10-causes-of-death.
5. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Государственный доклад «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2022 году». 2023. URL: https://www.rospotrebnadzor.ru/documents/ details.php?ELEMENT_ID=25076.
6. Зайцев А.А., Синопальников А.И. Практические рекомендации по ведению пациентов с нетяжелой внебольничной пневмонией. Русский медицинский журнал 2020; 4: 19–23.
7. Зырянов С.К., Ченкуров М.С., Ивжиц М.А., Ба­течко Ю.А., Иванова E.Б., Якунина М.А. Исследование структуры сопутствующих заболеваний и этиологии внебольничной пневмонии у пациентов пожилого и старческого возраста. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2020; 22(3): 242–248.
8. Зарипова А.З., Валиева Р.И., Баязитова Л.Т., Целищева М.В. Диагностика пневмококковых инфекций респираторного тракта. Практическая пульмонология 2018; 4: 74–80.
9. Bonten M.J.M., Huijts S.M., Bolkenbaas M., Webber C., Patterson S., Gault S., van Werkhoven C.H., van Deursen A.M.M., Sanders E.A.M., Verheij T.J.M., Patton M., McDonough A., Moradoghli-Haftvani A., Smith H., Mellelieu T., Pride M.W., Crowther G., Schmoele-Thoma B., Scott D.A., Jansen K.U., Lobatto R., Oosterman B., Visser N., Caspers E., Smorenburg A., Emini E.A., Gruber W.C., Grobbee D.E. Polysaccharide сonjugate vaccine against pneumococcal pneumonia in adults. The N Engl J Med 2015; 372: 1114–1125, https://doi.org/10.1056/nejmoa1408544.
10. Falkenhorst G., Remschmidt C., Harder T., Wichmann O., Glodny S., Hummers-Pradier E., Ledig T., Bogdan C. Background paper to the updated pneumococcal vaccination recommendation for older adults in Germany. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz 2016; 59(12): 1623–1657, https://doi.org/10.1007/s00103-016-2466-9.
11. Харитонов М.А., Журкин М.А., Иванов В.В. Клинико-диагностические особенности внебольничной вирусно-бак­те­риальной пневмонии. Практическая пульмонология 2016; 1: 30–35.
12. Афтаева Л.Н., Мельников В.Л., Кубрина О.Ю., Ореш­кина А.А. Особенности течения внебольничных пневмоний. Вестник Пензенского государственного университета 2019; 25(1): 68–73.
13. Чубукова О.А., Шкарин В.В. Особенности эпидемиологии внебольничных пневмоний с сочетанной этиологией. Медицинский альманах 2017; 49(4): 149–156.
14. Zimenkov D.V., Kulagina E.V., Antonova O.V., Zhuravlev V.Y., Gryadunov D.A. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray. J Antimicrob Chemother 2016; 71(6): 1520–1531, https://doi.org/10.1093/jac/dkw015.
15. Fesenko E.E., Kireyev D.E., Gryadunov D.A., Mikhailovich V.M., Grebennikova T.V., L’vov D.K., Zasedatelev A.S. Oligonucleotide microchip for subtyping of influenza A virus. Influenza Other Respir Viruses 2007; 1(3): 121–129, https://doi.org/10.1111/j.1750-2659.2007.00018.x.
16. Shaik A.H., Govindan V., Nagraj G., Ravikumar K.L. Development of a microarray-based method for simultaneous detection and serotyping of Streptococcus pneumoniae from culture negative serum samples. J Appl Biol Biotech 2019; 7(5): 15–24, https://doi.org/10.7324/jabb.2019.70503.
17. Leski T.A., Lin B., Malanoski A.P., Stenger D.A. Application of resequencing microarrays in microbial detection and characterization. Future Microbiol 2012; 7: 625–637, https://doi.org/10.2217/fmb.12.30.
18. Tokman H.B., Aslan M., Ortaköylü G., Algingil R.C., Yüksel P., Karakullukçu A., Kalayci F., Saribaş S., Cakan H., Demir T., Kocazeybek B.S. Microorganisms in respiratory tract of patients diagnosed with atypical pneumonia: results of a research based on the use of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) DNA microarray method and enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Lab 2014; 60(6): 1027–1034, https://doi.org/10.7754/clin.lab.2013.130731.
19. Ma X., Li Y., Liang Y., Liu Y., Yu L., Li C., Liu Q., Chen L. Development of a DNA microarray assay for rapid detection of fifteen bacterial pathogens in pneumonia. BMC Microbiol 2020; 20(1): 177, https://doi.org/10.1186/s12866-020-01842-3.
20. You Y.H., Wang P., Wang Y.H., Wang H.B., Yu D.Z., Hai R., Zhang J.Z. Assessment of comparative genomic hybridization experiment by an in situ synthesized Combi Matrix microarray with Yersinia pestis vaccine strain EV76 DNA. Biomed Environ Sci 2010; 23(5): 384–390, https://doi.org/10.1016/s0895-3988(10)60080-3.
21. Filatova E.N., Chaikina A.S., Brusnigina N.F., Makhova M.A., Utkin O.V. An algorithm for the selection of probes for specific detection of human disease pathogens using the DNA microarray technology. Sovremennye tehnologii v medicine 2022; 14(1): 6, https://doi.org/10.17691/stm2022.14.1.01.
22. National Center for Biotechnology Information. Nucleotide. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide.
23. Caruthers M.H. Gene synthesis machines: DNA chemistry and its uses. Science 1985; 230(4723): 281–285, https://doi.org/10.1126/science.3863253.
24. CustomArray Inc. URL: http://www.customarrayinc.com.
25. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. Vienna: R Foundation for Statistical Computing; 2014. URL: http://www.R-project.org/.
26. Liu R.H., Dill K., Fuji H.S., McShea A. Integrated microfluidic biochips for DNA microarray analysis. Expert Rev Mol Diagn 2006; 6(2): 253–261, https://doi.org/10.1586/14737159.6.2.253.
27. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K., Madden Th.L. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics 2009; 10: 421, https://doi.org/10.1186/1471-2105-10-421.
28. Raman T., O’Connor T.P., Hackett N.R., Wang W., Harvey B.G., Attiyeh M.A., Dang D.T., Teater M., Crystal R.G. Quality control in microarray assessment of gene expression in human airway epithelium. BMC Genomics 2009; 10: 493, https://doi.org/10.1186/1471-2164-10-493.
29. Kosikowska U., Biernasiuk A., Rybojad P., Łoś R., Malm A. Haemophilus parainfluenzae as a marker of the upper respiratory tract microbiota changes under the influence of preoperative prophylaxis with or without postoperative treatment in patients with lung cancer. BMC Microbiol 2016; 16: 62, https://doi.org/10.1186/s12866-016-0679-6.
30. Pickering J., Richmond P.C., Kirkham L.A. Molecular tools for differentiation of non-typeable Haemophilus influenzae from Haemophilus haemolyticus. Front Microbiol 2014; 5: 664, https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00664.
31. Lin B., Wang Z., Vora G.J., Thornton J.A., Schnur J.M., Thach D.C., Blaney K.M., Ligler A.G., Malanoski A.P., Santiago J., Walter E.A., Agan B.K., Metzgar D., Seto D., Daum L.T., Kruzelock R., Rowley R.K., Hanson E.H., Tibbetts C., Stenger D.A. Broad spectrum respiratory tract pathogen identification using resequencing DNA microarrays. Genome Res 2006; 16(4): 527–535, https://doi.org/10.1101/gr.4337206.
32. Spuesens E.B., Fraaij P.L., Visser E.G., Hoogenboezem T., Hop W.C., van Adrichem L.N., Weber F., Moll H.A., Broekman B., Berger M.Y., van Rijsoort-Vos T., van Belkum A., Schutten M., Pas S.D., Osterhaus A.D., Hartwig N.G., Vink C., van Rossum A.M. Carriage of Mycoplasma pneumoniae in the upper respiratory tract of symptomatic and asymptomatic children: an observational study. PLoS Med 2013; 10(5): e1001444, https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1001444.
33. Schmidt S.M., Müller C.E., Mahner B., Wiersbitzky S.K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. Pediatr Infect Dis J 2002; 21(8): 758–762, https://doi.org/10.1097/00006454-200208000-00012.
34. Miyashita N., Niki Y., Nakajima M., Fukano H., Matsushima T. Prevalence of asymptomatic infection with Chlamydia pneumoniae in subjectively healthy adults. Chest 2001; 119(5): 1416–1419, https://doi.org/10.1378/chest.119.5.1416.
35. Ramirez J.A., Ahkee S., Tolentino A., Miller R.D., Summersgill J.T. Diagnosis of Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, or Chlamydia pneumoniae lower respiratory infection using the polymerase chain reaction on a single throat swab specimen. Diagn Microbiol Infect Dis 1996; 24(1): 7–14, https://doi.org/10.1016/0732-8893(95)00254-5.
36. Ghindilis A.L., Smith M.W., Schwarzkopf K.R., Roth K.M., Peyvan K., Munro S.B., Lodes M.J., Stöver A.G., Bernards K., Dill K., McShea A. CombiMatrix oligonucleotide arrays: genotyping and gene expression assays employing electrochemical detection. Biosens Bioelectron 2007; 22(9–10): 1853–1860, https://doi.org/10.1016/j.bios.2006.06.024.

Sakharnov N.A., Filatova E.N., Popkova M.I., Slavin S.L., Utkin O.V. Development of DNA Microarray for Parallel Detection of Community-Acquired Pneumonia Bacterial Pathogens. Sovremennye tehnologii v medicine 2024; 16(2): 16, https://doi.org/10.17691/stm2024.16.2.02