Том 18, номер 3 (2026)

Регенерация дефекта кости при помощи мезенхимных стволовых клеток из жирового комка Биша

С.В. Остапец, О.С. Косарева, М.Н. Дровосеков, Е.В. Никитенко, М.А. Суровцева, И.И. Ким, О.В. Повещенко

---

2026, Том 18, номер 3, стр. 39 Назад

Введение

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем современной стоматологии является восстановление дефектов костной ткани верхней и нижней челюсти, а также функциональных и эстетических параметров зубочелюстной системы при помощи дентальных имплантатов в случае потери зубов. Установка внутрикостных имплантатов позволяет изготовить несъемные зубные протезы вне зависимости от числа отсутствующих зубов. Ежегодно в мире устанавливается свыше 9 млн имплантатов [1].

Эффективность протезирования с опорой на имплантаты в значительной степени зависит от объема и качества костной ткани в области планируемой имплантации, поскольку хирурги нередко сталкиваются с проблемой дефицита костной ткани [2–5]. Восстановление костной ткани при помощи аутотрансплантатов в стоматологии является золотым стандартом. Аутогенная кость на сегодняшний день может считаться оптимальным материалом для трансплантации, так как обладает одновременно остеокондуктивными, остеоиндуктивными и остео­генными свойствами. К ее важным преимуществам относятся также отсутствие иммунологических реакций и полная трансформация аутогенного трансплантата в окружающую костную ткань [6]. При этом необходимо отметить, что восстановление дефектов альвеолярного отростка верхней челюсти и альвеолярной части нижней челюсти аутогенным костным материалом имеет ряд недостатков. К ним относятся увеличение времени оперативного вмешательства; дополнительная травматизация в связи с забором трансплантата с донорской зоны, которая в ряде случаев может сопровождаться образованием гематом и их инфицированием, а также повреждением сосудисто-нервного пучка; несоответствие возможности забора аутотрансплантата размеру дефекта реципиентной зоны [7, 8].

В последние годы появились данные об эффективности мезенхимных стволовых клеток (МСК) в восстановлении костной ткани. МСК способны дифференцироваться в различных направлениях и обладают высоким остеогенным потенциалом [9, 10]. К настоящему времени получены и охарактеризованы МСК из различных источников [11, 12], при этом МСК, выделенные из жировой ткани, являются наиболее распространенными клетками, применяемыми в регенеративной медицине [12]. В отличие от костного мозга жировая ткань имеет ряд преимуществ, заключающихся в более простом способе забора ткани и в большем количестве клеток, выделяемых из единицы объема забранного материала [13]. Жировая ткань ротовой полости (буккальные жировые подушки, или подушки Биша) может служить доступным источником МСК в стоматологии и костно-лицевой хирургии. Ранее мы показали, что МСК, выделенные из буккальных жировых подушек, обладают более высокой пролиферативной активностью и способностью к остеогенной дифференцировке по сравнению с МСК из костного мозга и висцерального жира [14].

Цель работы — оценка эффективности регенерации костного дефекта нижней челюсти при введении МСК, полученных из жирового комка Биша, а также дифференцированных из них остеобластов, по данным морфологического исследования.

Материалы и методы

Из жировой ткани комка Биша (Б-МСК), полученной при хирургическом вмешательстве в стоматологической клинике RecomenDent (Новосибирск), выделяли МСК. Все пациенты (n=6) подписали информированное согласие на проведение операции, забор тканей и использование их в научных исследованиях. Исследование одобрено этическим комитетом Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии (Новосибирск) (протокол №7 от 10.10.2007 г.). Забранную жировую ткань дважды промывали в забуференном физиологическом растворе, после чего измельчали скальпелем и обрабатывали 0,05% раствором коллагеназы (Clostridium histolyticum, тип I; Sigma-Aldrich, США) с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS; HyClone США) при 37°С в течение 18–20 ч. Выделенные клетки культивировали в полной ростовой среде, состоящей из DMEM («БиолоТ», Россия) c добавлением 10% FВS (HyClone, США), 2 мM
L-глютамина («БиолоТ», Россия), 40 мкг/мл гентамицина («Дальхимфарм», Россия), при 37ºC и 5% CO₂, обновляя среду каждые 3–4 дня. Снятие клеток при пересеве осуществляли с использованием раствора трипсина-версена (1:1) («БиолоТ», Россия).

Направленную остеогенную дифференцировку Б-МСК 3–5-го пассажа проводили в остеоиндукционной среде, состоящей из среды DMEM с добавлением 10% FBS, 40 мкг/мл гентамицина, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, США), 5·10^–7 М дексаметазона (Shreya Life Sciences, Индия) и 10 мМ глицерофосфата натрия (Sigma-Aldrich, США) в течение 21 дня [15]. Смену среды проводили каждые 3–4 дня. Отложение солей кальция подтверждали окраской ализариновым красным (Sigma-Aldrich, США). Клетки снимали раствором трипсина-версена (1:1) («БиолоТ», Россия), подсчитывали и вводили животным из расчета 1·10⁶ кл. на животное. Морфологию клеток изучали при помощи микроскопа Axio Observer (ZEISS, Германия).

Экспериментальное исследование выполнено на 120 крысах-самцах линии Wistar возрастом 2 мес, массой тела 250–300 г. Все манипуляции с животными одобрены этическим комитетом Новосибирского государственного медицинского университет (протокол №163 от 18.12.2024 г.) и проведены в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.). Под общей анестезией (внутримышечно 0,1 мл Телазола; Zoetis Inc, США) производили разрез левой подчелюстной области, обнажали жевательную мышцу, отсекали сухожилие жевательной мышцы от угла нижней челюсти и скелетировали угол нижней челюсти. При помощи шаровидного бора под водяным охлаждением выполняли сквозную трепанацию нижней челюсти. Диаметр трепанационного отверстия составлял 1 мм.

Животные были разделены на 3 группы (по 40 крыс в каждой): введение Б-МСК; введение остеобластов; травма (без лечения, контроль). Сформированный дефект в кости заполняли клетками (Б-МСК или остеобласты) в количестве 1·10⁶ кл. на животное. Клетки были предварительно адсорбированы на коллагеновую губку (Лужский завод «БЕЛКОЗИН», Россия) для предотвращения их растекания. В группе контроля сформированный дефект не заполнялся, заживление происходило под кровяным сгустком. Во всех экспериментальных группах рану послойно ушивали. Для оценки результатов лечения животных выводили из эксперимента через 14, 30 и 90 сут после формирования дефекта.

Для гистологических исследований забирали фрагменты нижней челюсти площадью примерно 0,5 см², содержащие костный дефект. Исследуемые образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 48 ч. Костные фрагменты выделяли и освобождали от мягких тканей, подвергали декальцинации в декальцинирующем растворе «Софтидек» (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) на основе ЭДТА. Тканевые образцы проводили через спирты возрастающих концентраций и заливали в парафин. Из парафинированных блоков изготавливали продольные и поперечные срезы регенерата. Срезы толщиной 5–6 мкм готовили на ротационном микротоме Leica RM 2555 (Leica Biosystems/Microsystems, Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение гистопрепаратов и микрофотосъемку проводили в оптической цифровой системе AxioPlan 2 Imaging (ZEISS, Германия).

Результаты

Ранее нами были получены и охарактеризованы МСК из буккальных жировых подушек. Было показано, что Б-МСК имели фенотип CD90⁺/CD73⁺/CD105⁺/CD34^–/CD45^–, обладали способностью дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлениях [14, 16]. Морфология клеток, используемых в эксперименте, представлена на рис. 1. Б-МСК имели веретеновидную форму (рис. 1, а). Полученные в результате дифференцировки остеобласты представляли собой крупные клетки кубовидной или полигональной формы с базофильной цитоплазмой. Остеобласты продуцировали матрикс, содержащий соли кальция, которые выявлялись при помощи специфического красителя — ализаринового красного (рис. 1, б).

Рис. 1. Мезенхимные стволовые клетки, полученные из жирового комка Биша, до остеодифференцировки (а) и через 21 сут культивирования в остеогенной среде (б). Окраска ализариновым красным; ув. 100; бар — 100 мкм

При гистологическом исследовании на 14-е сутки после формирования травмы в препаратах контрольной группы область дефекта кости была заполнена грануляционной тканью с выраженной диффузной полиморфно-клеточной воспалительной инфильтрацией (рис. 2, а). Выявлено наличие редких паретически расширенных капилляров с набухшими эндотелиальными клетками.

Рис. 2. Область дефекта нижней челюсти через 14 сут после формирования: а — контрольная группа (без заполнения дефекта); б — заполнение дефекта мезенхимными стволовыми клетками, выделенными из жировой ткани комка Биша; в — заполнение дефекта остеобластами. Окрашивание гематоксилином и эозином; ув. 400

На сроке 14 сут после формирования травмы и введения Б-МСК (рис. 2, б) область дефекта кости была заполнена грануляционной тканью с диффузной полиморфно-клеточной воспалительной инфильтрацией. На части срезов вокруг дефекта была сформирована капсула, представляющая собой рыхлую волокнистую соединительную ткань с мелкими оксифильными участками некротизированной костной ткани и фокусами резорбции (рассасыванием) костных балок, с незначительной инфильтрацией нейтрофилами. По-видимому, это являлось реакцией на прямую механическую травму кости при создании дефекта, а также было обусловлено особенностями кровотока в костной ткани, что определяет опосредованную гибель ишемизированной кости, прилежащей к месту повреждения. В прилегающей костной ткани, окружающей дефект, значительно выражена пролиферация мезенхимных клеточных элементов.

В группе замещения дефекта остеобластами, дифференцированными из Б-МСК, на 14-е сутки после травмы (рис. 2, в) область моделированного дефекта кости была заполнена грануляционной тканью с диффузной полиморфноклеточной воспалительной инфильтрацией, в которой определялись мелкие фрагменты частично резорбированных костных балок. В периостальной области выявлены слабовыраженная лимфогистиоцитарная инфильтрация с примесью незначительного количества нейтрофилов и множество капилляров с набухшими эндотелиальными клетками.

На 30-е сутки после травмы область дефекта кости в группе контроля была заполнена остеогенной ретикулярной тканью со слабовыраженной остеобластической реакцией, полями «нежного» остеоида (рис. 3, а). В фиброретикулярной ткани встречались редкие мелкие сосуды капиллярного типа. Отмечена активная остеокластическая резорбция в области перестраивающихся структур. Необходимо отметить, что воспаление имело продуктивный характер с преобладанием в составе инфильтрата макрофагов, лимфоцитов и плазматических клеток. Нейтрофилы присутствовали в инфильтрате в незначительном количестве.

Рис. 3. Область дефекта нижней челюсти через 30 сут после формирования: а — контрольная группа (без заполнения дефекта); б — заполнение дефекта мезенхимными стволовыми клетками, выделенными из жировой ткани комка Биша; в — заполнение дефекта остеобластами. Окрашивание гематоксилином и эозином; ув. 200

Область моделированного дефекта кости, заполненная Б-МСК, была представлена остеогенной фиброретикулярной тканью с формирующимися костными балками, «облепленными» остеобластами (рис. 3, б). В окружающей фиброретикулярной ткани отмечены обилие капилляров и очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация.

Через 30 сут после формирования дефекта кости и его замещения остеобластами он был заполнен остеогенной фиброретикулярной тканью с полями «нежного» остеоида и единичными примитивными костными балками. Костные балки нерегулярного строения располагались беспорядочно. Вокруг костных балок выражена остеобластическая реакция. В окружающей фиброретикулярной ткани обнаружены многочисленные капилляры (рис. 3, в).

В контрольной группе на 90-е сутки в зоне бывшего дефекта сформировалась незрелая губчатая костная ткань, хотя в центральных отделах все еще были видны участки перестраивающихся костных балок со следами их рассасывания остеокластами (рис. 4, а).

Рис. 4. Область дефекта нижней челюсти через 90 сут после травмы: а — контрольная группа (без заполнения дефекта); б — заполнение дефекта мезенхимными стволовыми клетками, выделенными из жировой ткани комка Биша; в — заполнение дефекта остеобластами. Окрашивание гематоксилином и эозином; ув. 200

На сроке 90 сут после травмы и введения Б-МСК в зоне смоделированного дефекта сформировалась ткань, состоящая из губчатой зрелой костной ткани, типичной для этой области. В межбалочных пространствах располагалась зрелая фиброретикулярная ткань с единичными остеокластами. Миелоидный костный мозг в межбалочных промежутках отсутствовал (рис. 4, б).

К концу 90 сут эксперимента в зоне дефекта, замещенного остеобластами, сформировалась ткань, состоящая из губчатой зрелой костной ткани. В центральных отделах определялись участки с перестраивающимися слабо обызвествленными костными балками. В межбалочных пространствах располагался миелоидный костный мозг (рис. 4, в).

Обсуждение

Эффективность МСК в остеоиндукции и остеогенезе была показана в исследованиях in vitro и in vivo [17–19]. Известно, что под воздействием специфических растворимых факторов микросреды МСК могут дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты [12, 20]. МСК обеспечивают паракринные эффекты посредством секреции факторов роста и цитокинов. Они обладают мощными иммуномодулирующими свойствами. МСК вырабатывают противовоспалительные факторы, такие как оксид азота, индоламин 2,3-диоксигеназа, а также противовоспалительные цитокины (IL-10 и IL-12p40) и хемокины; подавляют выработку воспалительных цитокинов IL-6, TNF-α и IFN-γ [21].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что на 14-е сутки после травмы кости выявлена схожая гистологическая картина во всех экспериментальных группах, связанная с инфильтрацией места дефекта воспалительными клетками (см. рис. 2). Однако в группах с введением клеток (Б-МСК или остеобластов) отмечено наличие резорбции костных балок и большого количества капилляров (группа с введением остеобластов), что свидетельствует об ускорении регенерации кости на данном сроке наблюдения (см. рис. 2, б, в). Повреждение кости сопровождается локальным и системным высвобождением провоспалительных цитокинов. Это привлекает к месту повреждения иммунные клетки, секретирующие воспалительные медиаторы. Эти медиаторы (например, TNF-α), а также TGF-β1, высвобождаемый костным матриксом, и хемокины, такие как SDF-1 (stromal cell-derived factor-1), продуцируемые клетками поврежденной кости, вызывают эндогенное привлечение МСК в очаг повреждения [20]. Эндогенная или экзогенная миграция МСК к месту повреждения кости является первым шагом в регенерации костей [22].

На 30-е сутки после травмы во всех препаратах в месте костного дефекта была выявлена активация остеогенеза с формированием полей «нежного» остеоида и единичными примитивными беспорядочно расположенными костными балками (см. рис. 3). Следует отметить, что в контрольной группе (без введения клеток) еще продолжается активная остеокластическая резорбция кости и умеренно выраженная воспалительная реакция в очаге повреждения (см. рис. 3, а). Для групп с введением клеток было характерно наличие большого количества капилляров (см. рис. 3, б, в), а в группе с введением остеобластов — появление примитивных костных балок с находящимися на них остеобластами (см. рис. 3, в). Показано, что трансплантированные МСК могут способствовать регенерации костей также посредством стимуляции ангиогенеза. Находясь в гипоксических периваскулярных нишах, МСК экспрессировали HIF-1α в ответ на гипоксическое состояние в месте дефекта и индуцировали экспрессию ангиогенных факторов, таких как VEGF, TGF-β, SDF-1, способствующих прорастанию сосудов [19].

На 90-е сутки после травмы в контрольной группе регенерация костного дефекта еще не была завершена, о чем свидетельствует наличие незрелой губчатой костной ткани и участков рассасывания остеокластами (см. рис. 4, а). В отличие от группы контроля в группах с введением клеток на 90-е сутки после травмы костный дефект был заполнен зрелой губчатой костной тканью, а в группе с введением остеобластов были выявлены поля слабо минерализованного органического костного матрикса вокруг остеобластов и миелоидный костный мозг в межбалочных пространствах (см. рис. 4, б, в). Известно, что во время ремоделирования кости МСК дифференцируются в остеобласты, обеспечивая формирование кости [23]. Основной терапевтический эффект МСК связан не только с их встраиванием в ткани хозяина и способностью к остеодифференцировке, но и с паракринным влиянием на эндогенные МСК посредством секреции факторов роста и цитокинов (VEGF, TGF-β, IL-1β, IL-6, IL-8), что в конечном итоге ведет к ускорению сроков регенерации кости. Показано, что дифференцировка MСК в остеобласты регулируется сигнальным путем Wnt/β-катенин. β-катенин участвует в поддержании дифференцировки предшественников MСК в зрелые остеобласты, повышая регуляцию остеогенных регуляторов Runx2, Dlx5 и Osterix [24]. МСК могут экспрессировать BMP-2 в месте дефекта, что вызывает дифференцировку этих клеток в остеобласты за счет аутокринной активации Smad и MAPK (путь митоген-активируемой протеинкиназы) путей. BMP-2 играет важную роль в заживлении костей за счет участия в формировании новой костной ткани, повышения функции остеобластов и поддержания динамического баланса новообразованной костной ткани [25].

Результаты нашего исследования демонстрируют уменьшение срока регенерации кости при заполнении костного дефекта остеобластами. Показано, что процесс минерализации идет в два этапа: первый связан с образованием везикул в цитоплазме остеобластов, содержащих гидроксиапатиты, костные белки и ферменты; второй происходит в матриксе при участии везикул, отшнурованных от мембран остео­бластов, коллагена I типа и других компонентов, синтезируемых остеобластами [26]. Поэтому наблюдаемое в нашем исследовании уменьшение срока регенерации кости при введении в костный дефект остеобластов может быть связано с предварительным проведением in vitro процесса дифференцировки МСК в остеобласты и, соответственно, с первым этапом минерализации, протекающим в цитоплазме остеобластов.

Заключение

На основании проведенных экспериментальных исследований показано формирование зрелой губчатой костной ткани в области дефекта нижней челюсти крыс через 90 сут после введения Б-МСК и остео­бластов, дифференцированных из них, в отличие от группы контроля (без введения клеток). Это позволяет судить о высоком регенерационном потенциале используемых клеток при замещении дефектов кости и значительном сокращении сроков регенерации.

Источники финансирования. Работа с клетками проведена в рамках государственного задания НИИКЭЛ — филиал ФГБНУ ФИЦ ИЦиГ СО РАН по теме FWNR-2025-0016.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.