Исследование фенотипа астроцитов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от здорового индивида и от пациента с болезнью Паркинсона, с использованием метода просвечивающей электронной микроскопии

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) — это второе по распространенности (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративное заболевание, характеризующееся нарастающей двигательной дисфункцией (гипокинезия, мышечная ригидность, тремор покоя), морфологическим субстратом которой является дегенерация черной субстанции среднего мозга с преимущественной гибелью дофаминергических нейронов. Большинство случаев БП — спорадические, однако около 10% пациентов имеют моногенные формы заболевания, наследуемые по аутосомно-­доминантному или аутосомно-­рецессивному типам [1]. Среди наиболее значимых генов, ассоциированных с развитием БП, можно назвать гены LRRK2, SNCA, PARK2, DJ-1, PINK1, GBA, VPS35 и ATP13A2 [2]. Так, мутации в гене LRRK2, кодирующем белок дардарин, вызывают одну из семейных форм БП с поздним началом, клинические и патологические проявления которой схожи с проявлениями более распространенной спорадической формы БП [3, 4]. При патогенной мутации G2019S в гене LRRK2 увеличивается киназная активность дардарина [5]. Морфологическими проявлениями мутаций в гене LRRK2 на уровне нейронов являются укорочение отростков, упрощение дендритного древа [6], а также внутриклеточные изменения, связанные с нарушением макроаутофагии [7–11].

В настоящее время все большее внимание привлекает проблема БП-ассоциированных нарушений нейроглии и нейроглиальных взаимодействий. Так, было выяснено, что мутации в гене LRRK2 связаны не только с нарушением внутриклеточной утилизации белка альфа-­синуклеина в нейронах, но и со снижением способности астроцитов поглощать путем эндоцитоза внеклеточный альфа-­синуклеин, попадающий в межклеточное пространство в результате гибели нейронов [12]. Кроме того, известно, что активированные астроциты в головном мозге участвуют в запуске процессов нейровоспаления, ассоциированного с нейродегенерацией [13]. Технология получения из ИПСК глиальных клеток значительно расширила возможности исследования их роли в нейрогенезе и в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, в том числе БП [14, 15]. В работе [16] на культурах полученных из ИПСК астроцитов с мутацией G2019S в гене LRRK2 методами иммунофлуоресценции и электронной микроскопии показано нарушение биогенеза экзосом. A. di Domenico и соавт. [17] выявили в астроцитах с данной мутацией нарушения шаперон-­опосредованной митофагии, макроаутофагии и накопление альфа-­синуклеина.

Таким образом, в настоящее время особую актуальность представляет выявление возможной роли астроцитов в патогенезе БП с помощью комплексного изучения их морфофункциональных изменений, в том числе на ультраструктурном уровне.

Цель настоящей работы — провести сравнительную характеристику астроцитов, полученных из ИПСК от здорового донора и от донора с наследственной LRRK2-ассоциированной формой БП, с помощью комплекса методов — полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, иммуноцитохимического окрашивания и просвечивающей электронной микроскопии.

Материалы и методы

Клеточные линии. В работе были использованы монослойные культуры астроцитов, дифференцированных из ИПСК от условно здорового донора и от пациента с БП, имеющего мутацию G2019S в гене LRRK2 [18]. Работа была выполнена после одобрения этическим комитетом Российского центра неврологии и нейронаук и проведена в соответствии с этическими принципами, утвержденными Хельсинкской декларацией (2024). От каждого донора клеточного материала получено письменное информированное согласие.

Направленная дифференцировка нейрональных предшественников в глиальные клетки. Протокол основан на методических рекомендациях, описанных в статье [19]. Нейрональные предшественники, полученные из ИПСК, рассевали на чашки Петри диаметр 35 мм, покрытые матриксом Матригель (BD Biosciences, США), из расчета 250–400 тыс. клеток на 1 см² и культивировали в СO₂-инкубаторе при 37ºС в течение 24 ч в среде для нейрональных предшественников. Среда состояла из Neurobasal Medium (Gibco, США), 2% SR (Gibco, США), 1% N2 добавки (Gibco, США), 1% В-27 добавки («ПанЭко», Россия), 2 мМ глутамина (ICN Biomedicals, США), 1% смеси аминокислот («ПанЭко», Россия), 50 ед./мл пенициллина–стрептомицина («ПанЭко», Россия), 80 нг/мл Noggin (PeproTech, США), 10 мкМ SB431542 (Stemgent, Inc, США). На следующий день нейрональную среду заменяли на среду для культивирования глиальных клеток (DMEM/F12 (Gibco, США), 1% незаменимые аминокислоты (Hyclone, Logan, UT, США), глутамин 2 мМ («ПанЭко», Россия), добавки N2 и B-27, FGF2 8 нг/мл, Heregulin 10 нг/мл, IGF1 200 нг/мл, Activin A 10 нг/мл (Stem Cell Technologies, Канада), пенициллин–стрептомицин 50 мкг/мл («ПанЭко», Россия)). По мере нарастания до полного монослоя клетки пересевали в пропорции 1:3 на новые чашки с помощью 0,05% раствора трипсина. Смену среды осуществляли через день.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. ПЦР-амплификацию осуществляли с помощью 5Х готовой реакционной смеси («Евроген», Россия), в состав которой входят следующие компоненты: Taq ДНК-полимераза, смесь нуклеотидтрифосфатов, Mg²⁺ и реакционный буфер. Для ПЦР в режиме реального времени применяли интеркалирующий краситель (SYBR Green). Реакцию проводили в амплификаторе LightCycler® 96 (Roche, Германия) согласно инструкциям производителя. Для ПЦР-амплификации продуктов реакции обратной транскрипции использовали 0,04 части реакционной смеси (комплементарной ДНК) — 1 мкл; 5Х реакционную смесь qPCRmix-HS («Евроген», Россия) — 5 мкл; праймеры (см. таблицу) («Евроген», Россия) — по 1 мкл; деионизированную воду (mQ) — до конечного объема 25 мкл.

---

Праймеры, использованные в работе

---

Фиксация клеток параформальдегидом и иммуноцитохимический анализ. Клетки промывали однократно раствором PBS (ICN Biomedicals, США) и фиксировали в 4% параформальдегиде (Sigma, США) в течение 20 мин при комнатной температуре. После трехкратной отмывки раствором PBS клетки инкубировали в растворе PBS с добавлением 0,1% Triton Х-100 и 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 15 мин для пермеабилизации и уменьшения неспецифической сорбции антител. Затем клетки инкубировали в растворе PBS с добавлением 0,1% Triton Х-100 и 5% ЭТС, который содержал специфические первичные антитела, в концентрациях, рекомендованных производителем, в течение ночи при 4^oС. После трехкратных отмывок по 10 мин раствором PBS с 0,1% Tween 20 клетки инкубировали в растворе PBS с 0,1% Triton Х-100 и 5% ЭТС, который содержал вторичные антитела, меченные флюоресцентным красителем, в концентрациях, указанных производителем, в течение 1,5 ч при комнатной температуре. После трехкратных отмывок по 10 мин раствором PBS с 0,1% Tween 20 к клеткам добавляли раствор ядерного красителя DAPI (Sigma, США) в концентрации 0,1 мкг/мл, инкубировали 20 мин и затем отмывали трехкратно раствором PBS с 0,1% Tween 20. Визуализацию препаратов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Imager Z1 (Zeiss, Германия). Изображения анализировали с использованием программного пакета ImageJ 1.49p (NCBI, США).

Первичные антитела, использованные в работе:

мышиные Anti-­VGLUT (MAB5502; Sigma-­Aldrich, США), 1:30;

кроличьи Anti-­SLC1A3 (EAAT1) (MBS136184; My Bio Source, США), 1:100;

кроличьи Anti-­NG2 (ab 83178; Abcam, Великобритания), 1:50;

кроличьи Anti-­CD44 (GTX102111; GeneTex, США), 1:300;

кроличьи Anti-­S100 (IR50461–2; Dako, Дания), 1:2.

Вторичные антитела, использованные в работе:

козьи анти-мышиные Alexa Fluor 488 (А11001; Invitrogen, США), 1/2000;

козьи анти-кроличьи Alexa Fluor 546 (А11010; Invitrogen, США), 1/2000.

Просвечивающая электронная микроскопия. Для электронно-­микроскопического исследования использовали клеточные культуры, полученные от здорового донора и культивированные в течение 25 дней in vitro (25 DIV), а также соответствующие по сроку культивирования (26 DIV) клетки от донора с БП с мутацией в гене LRRK2. Дополнительно исследовали клетки от донора с БП той же линии, но на меньшем сроке дифференцировки (10 DIV). Клетки фиксировали 2,5% глутаральдегидом на 0,1 М фосфатном буфере (pH=7,4) в течение 2 ч, постфиксировали в 1% растворе OsO₄ в течение 2 ч, дегидратировали в этаноле восходящей концентрации и заключали в смолу Epon (Fluka, Швейцария). Ультратонкие срезы получали на ультратоме 8800 Ultratome III (LKB Bromma, Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония), оснащенном камерой ES500W Model 782 (Gatan Erlangshen, Китай). Морфометрию проводили в программе ImageJ на цифровых фотографиях срезов, полученных при одинаковом увеличении. Измеряли площади профильных полей клеток, ядер, митохондрий; оценивали показатель округлости митохондрий (circularity) и площадь, занимаемую митохондриями, относительно площади цитоплазмы клетки. В морфометрическое исследование включали митохондрии при наличии в них хотя бы одной различимой кристы.

Статистическая обработка результатов. Обработку и статистический анализ данных выполняли с помощью программ GraphPad Prism 8 и Statistica 8. Для оценки характера распределения данных использовали критерий асимметрии и эксцесса. Статистический анализ данных ПЦР проводили с помощью непарного двустороннего t-критерия. Различия признавали статистически значимыми при p<0,05. При морфометрическом электронно-­микроскопическом исследовании различия между изучаемыми выборками выявляли при помощи непараметрического критерия Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Полимеразная цепная реакция и иммуноцитохимия. Полученные глиальные культуры были охарактеризованы с помощью ПЦР в режиме реального времени и иммуноцитохимического окрашивания.

Обе клеточные линии экспрессировали необходимый паттерн глияспецифичных генов и синтезировали видоспецифические белки (рис. 1). При этом часть глияспецифичных генов (AQP4, EAAT1) в культурах с мутацией в гене LRRK2 экспрессировалась на пониженном уровне, по сравнению с контролем.

---

Рис. 1. Результаты полимеразной цепной реакции и иммуноцитохимического окрашивания культур астроглии, полученных от здорового донора (ЗД) и от донора с мутацией в гене LRRK2 (БП): а — экспрессия глияспецифичных генов в клетках; результаты представлены в виде «среднее значение ± стандарт­ная ошибка среднего»; статистический анализ проводили с помощью непарного двустороннего t-критерия; * статистически значимые различия между группами, p<0,05; б — иммуноцитохимическое окрашивание глиальных клеток антителами против EAAT1, VGLUT, S100, NG2, CD44 и ядерным красителем DAPI; бар для EATT1 и VGLUT — 100 мкм, для остальных — 200 мкм

---

Ультраструктура астроцитов, дифференцированных из ИПСК от условно здорового донора. Культуры контрольных астроцитов имели однородные клетки с умеренно электронно-­прозрачной цитоплазмой и светлыми ядрами. Присутствовали делящиеся клетки, гибнущие клетки практически не встречались (рис. 2, а). Ядра клеток были преимущественноумеренно электронно-­светлые с равномерно распределенным хроматином и с хорошо выраженным ядрышком, расположенным эксцентрично. Внутри ядра наблюдались равномерно распределенные небольшие глыбки гетерохроматина. В ядрах отдельных клеток присутствовали неглубокие инвагинации (рис. 2, б). Цитоплазма была бедна органеллами и в основном заполнена тонкой сетью промежуточных филаментов и полисомами (см. рис. 2, б; рис. 2, в). Гиалоплазма характеризовалась электронной прозрачностью, что характерно и для нормальных астроцитов головного мозга человека. Цитоскелет составлял основной элемент ультраструктуры клеток и представлял собой сеть тонких нитей, образующих промежуточные филаменты. В одних клетках цитоскелет был распределен равномерно, в других наблюдались зоны с более плотными и редкими скоплениями филаментов. В теле клеток отмечалась хаотичная ориентация филаментов, в отростках же они располагались параллельно друг другу. Встречались клетки, в которых одна часть цитоплазмы была заполнена густой сетью филаментов с небольшим количеством полисом между ними, а в другой части, наоборот, преобладали полисомы и содержалось мало элементов цитоскелета (см. рис. 2, в). Возможно, участки цитоплазмы с большим количеством полисом — это зоны, в которых только начиналась активная наработка белков для построения цитоскелета. Митохондрии преимущественно имели удлиненную форму, с электронно-­плотным матриксом и регулярными кристами. В отдельных митохондриях были заметны локусы просветления и набухания, расположенные либо в центре, либо на конце органеллы (рис. 2, г). Встречались измененные митохондрии с деструкцией крист. Митохондрии были немногочисленны, разбросаны поодиночке либо агрегировались возле ядра или в местах расхождения отростков (рис. 2, д). Выявлялись отдельные контакты митохондрий друг с другом и с ядром. Белоксинтезирующий аппаратбыл представлен преимущественно свободными рибосомами и полисомами. Отдельные короткие цистерны гранулярной эндоплазматической сети (ЭПС) встречались редко (рис. 2, е). Комплекс Гольджи был слабо развит, присутствовали единичные диктиосомы.

---

Рис. 2. Электронная микроскопия культуры астроцитов на 25 DIV, полученных из клеточного материала от здорового донора: а — общий вид культуры; присутствуют делящиеся клетки (желтая стрелка); б — типичное ядро клетки с эксцентрично расположенным ядрышком (желтая стрелка) и неглубокими инвагинациями (красная стрелка); в — различное соотношение элементов цитоскелета и органелл в клетке: зона с меньшим количеством промежуточных филаментов и большим количеством полисом и митохондрий(желтая звезда)и зона с большим количеством промежуточных филаментов и меньшим количеством органелл (красная звезда); г — митохондрии с регулярными кристами и участками просветления и набухания (желтые стрелки); д — мелкие округлые митохондрии, агрегирующиеся в перинуклеарной зоне цитоплазмы; М — митохондрии, Я — ядро; е — белоксинтезирующий аппарат представлен полисомами (желтая стрелка) и отдельными короткими цистернами гранулярной эндоплазматической сети (красная стрелка)

---

Отростки клеток разных калибров содержали элементы цитоскелета, полисомы, отдельные мелкие цистерны ЭПС и удлиненные митохондрии с темным матриксом. В части отростков цитоплазма была более электронно-­плотной и содержала значительное количество различных органелл. В других же отростках наблюдалось запустевание цитоплазмы, органелл почти не было, присутствовал лишь фибриллярный материал элементов цитоскелета. Вероятно, эти различия связаны с перестройкой отростков, образованием новых и дегенерацией старых.

Вакуоли были единичны, вероятно митохондриального генеза, поскольку рядом с ними встречались митохондрии с просветлениями на разных стадиях превращения в вакуоли.

Ультраструктура астроцитов, дифференцированных из ИПСК от донора с БП. Культуры клеток с мутацией в гене LRRK2, совпадающие по срокам культивирования с контролем (26 DIV — БП, 25 DIV — контроль), демонстрировали признаки значительных дегенеративных изменений (рис. 3–5). В некоторых клетках цитоплазма была электронно-­прозрачной, запустевшей, содержала единичные элементы цитоскелета и короткие фрагменты цистерн ЭПС, цитолемма при этом была частично или полностью разрушена (рис. 3, а, б). У другой части клеток, наоборот, в цитоплазме выявлялся умеренно электронно-­плотный мелкозернистый материал, представляющий, по всей видимости, коагулирующие белки цитозоля и цитоскелета (рис. 3, в, г). Ядра большинства клеток содержали хлопьевидный материал в кариоплазме, глыбки конденсированного хроматина и мембранные включения, образовывавшие пузыри и мультиламеллярные структуры (см. рис. 3, в, г; рис. 3, д). Цистерны гранулярной ЭПС были часто лишены рибосом; открепившиеся рибосомы находились в цитоплазме вблизи цистерн (см. рис. 4, а, б). Нередко встречались расширенные и заполненные умеренно электронно-­плотным содержимым цистерны гранулярной ЭПС. Наблюдались также цистерны гранулярной ЭПС с аномально суженным внутренним пространством. Гранулярная ЭПС часто образовывала 1–3 сплошных кольца вокруг ядра (рис. 4, в). В некоторых клетках присутствовали концентрические структуры, состоящие из цистерн или трубочек; вокруг некоторых из них обнаруживались гранулы гликогена (рис. 4, г).

---

Рис. 3. Электронная микроскопия культуры астроцитов на 26 DIV, полученных из клеточного материала от донора c мутацией в гене LRRK2: а, б — клетки, дегенерирующие по «светлому» типу; цитоплазма электронно-­прозрачная, с крупными липидными каплями, одиночными фрагментами цитоскелета и органелл; митохондрии отсутствуют; в, г — клетки, дегенерирующие по «темному» типу; цитоплазма электронно-­плотная, содержит одиночные дегенерирующие рибосомы и другие органеллы; присутствуют липидные капли и липофагосомы, митохондрии отсутствуют; в ядре (Я) видны мультиламеллярные структуры (желтые стрелки); д — двумембранные вакуоли присутствуют как в ядре, так и в цитоплазме (желтые звезды); последние предположительно образовались из митохондрий, поскольку в них определяются единичные кристы (красные стрелки); е — клетка, заполненная аутофаголизосомами со смешанным электронно-­плотным и электронно-­прозрачным содержимым

---

Рис. 4. Электронная микроскопия культуры астроцитов на 26 DIV, полученных из клеточного материала от донора c мутацией в гене LRRK2: а, б — изменения гранулярной эндоплазматической сети; красная стрелка — участок цистерны нормального диаметра; желтая стрелка — аномально расширенный участок гранулярной эндоплазматической сети, заполненный умеренно электронно-­плотным содержимым; зеленая стрелка — аномально суженный участок гранулярной эндоплазматической сети, лишенный рибосом; в — длинные цистерны гранулярной эндоплазматической сети (желтая стрелка)концентрически закручены вокруг ядра (Я); в цитоплазме присутствуют разнообразные крупные вакуоли (красные стрелки); митохондрии отсутствуют; г — концентрически закрученные ламеллярные структуры (желтая звезда), по всей вероятности, образовавшиеся из эндоплазматического ретикулума; рядом присутствуют электронно-­плотные включения гликогена (красные стрелки); д — клетка с электронно-­плотной цитоплазмой, аутофагическими вакуолями (В) и удлиненными митохондриями (М) с темным матриксом; Я — ядро; е — удлиненные митохондрии с темным матриксом и включениями кальция (красные стрелки)

---

Митохондрии во многих клетках были неопределимы. Вместо них присутствовали вакуоли с различным по плотности содержимым (см. рис. 3, а, в; см. рис. 4, в). Уцелевшие митохондрии были небольшие, вытянутые, с темным матриксом и слабо различимыми кристами и темными гранулами — включениями кальция (рис. 4, д, е).

Вакуоли с различным по электронной плотности содержимым составляли наиболее характерный элемент ультраструктуры астроцитов с БП-ассоциированной мутацией на 26 DIV (см. рис. 3, а, рис. 3, е; см. рис. 5). Некоторые вакуоли выглядели пустыми, у части из них имелось 2 мембраны, причем внутренняя подчас образовывала единичные впячивания, напоминающие кристы, что позволяет предположить образование их из дегенерировавших путем набухания митохондрий (см. рис. 3, д; рис. 5, а, б). Другие вакуоли имели одну мембрану и умеренно электронно-­плотное, неравномерно окрашенное содержимое и представляли собой липидные капли (рис. 5, в). Третий вид вакуолей содержал внутри неравномерно окрашенный электронно-­плотный материал, вероятно смешанной липид-­белковой природы (рис. 5, д). В большом количестве встречались аутофаголизосомы, содержащие продукты частичного переваривания мембранных органелл и липидных капель (см. рис. 3, е; см. рис. 4, д; рис. 5, г, е).

---

Рис. 5. Электронная микроскопия культуры астроцитов на 26 DIV, полученных из клеточного материала от пациента c мутацией в гене LRRK2: а, б — набухшие митохондрии, превратившиеся в вакуоли с электронно-прозрачным содержимым; о митохондриальном происхождении этих вакуолей можно судить по двойной мембране и наличию по периферии небольших единичных крист (красные стрелки); Я — ядро; в — липидная капля (желтая стрелка) с неоднородно умеренно электронно-плотным содержимым и одинарной мембраной; Я — ядро; г — липофагосомы (желтые стрелки), окруженные двумя или большим количеством мембран; Я — ядро; д— электронно-прозрачные, заполненные жидкостью вакуоли (красная стрелка); вакуоли с электронно-плотным белково-липидным содержимым (желтая стрелка) в клетке, полностью лишенной митохондрий; е — разнообразные аутофаголизосомы, содержащие частично лизированные липидные капли (красная стрелка); белковое содержимое (длинная желтая стрелка) и множество спрессованных дегенерирующих мембран (короткая желтая стрелка)

---

Поскольку клетки культуры от пациента с БП на 26 DIV демонстрировали ультраструктурные признаки дегенерации, характерные для состояния некробиоза, мы дополнительно исследовали клетки данной линии на меньшем сроке культивирования (10 DIV) для оценки динамики этих патологических изменений. По ультраструктуре клетки на 10 DIV значительно отличались от контроля (рис. 6). Культуры были морфологически неоднородны. Наряду с крупными глиальными клетками (рис. 6, б, в, красная звезда) встречались как мелкие малодифференцированные клетки (рис. 6, в, желтая звезда), так и клетки, по ультраструктуре соответствующие нейронам: с более развитыми органеллами, в том числе с упорядоченно расположенными стопками цистерн гранулярной ЭПС, напоминающими тельца Ниссля (рис. 6, г). Часто наблюдались клетки с гипертрофированными цистернами гладкого эндоплазматического ретикулума или комплекса Гольджи. Цистерны были концентрически закручены и занимали порой значительную площадь в клетке (рис. 6, д). Эти цистерны в отдельных участках набухали и давали начало электронно-­прозрачным вакуолям. Цитоскелет был представлен короткими хаотично расположенными фрагментами промежуточных филаментов и микротрубочек (рис. 6, е).

---

Рис. 6. Электронная микроскопия культуры астроцитов на 10 DIV, полученных из клеточного материала от донора c мутацией в гене LRRK2: а— разнообразные по размеру и форме клетки, с относительно нормальной ультраструктурой; в одной из клеток виден значительный по размеру конгломерат цистерн, вероятно гладкой эндоплазматической сети (желтая звезда); б— крупная клетка с маленьким ядерно-цитоплазматическим соотношением, с объемной цитоплазмой (Ц), богатой органеллами; Я — ядро; в — 2 типа клеток с разной ультраструктурой; клетка слева (желтая звезда) с более темной цитоплазмой, бедной элементами цитоскелета и богатой полисомами; клетка справа (красная звезда)с более электронно-прозрачной цитоплазмой, хорошо развитыми элементами цитоскелета и темными удлиненными митохондриями; г — клетка, напоминающая по ультраструктуре нейрон; хорошо развитый комплекс Гольджи (желтая звезда); стопка цистерн гранулярной эндоплазматической сети (красная звезда), напоминающая тельце Ниссля, характерное для нейронов; д— концентрически расположенные цистерны гладкой эндоплазматической сети с зонами набухания (желтые звезды); е — набухающие митохондрии с зонами просветления (желтые стрелки)

---

Белоксинтезирующий аппарат в одной части клеток был представлен хорошо развитой гранулярной ЭПС и полисомами, в других, наоборот, он был слабо развит и состоял в основном из свободных неактивных рибосом.

В клетках присутствовали как нормальные митохондрии, так и набухающие, с деструкцией крист и электронно-­плотными включениями кальция (см. рис. 6, е).

Мы провели морфометрическую оценку различных параметров клеток всех исследованных культур и сравнили по этим параметрам клетки от пациента с БП на 26 DIV с клетками от здорового донора, соответствующими по сроку культивирования (25 DIV), а также клетки от пациента с БП на 26 DIV с клетками той же линии на 10 DIV (рис. 7). По средним показателям площади клетки, площади ядра, площади цитоплазмы, ядерно-­цитоплазматическому соотношению клетки не различались (рис. 7, а–г).

---

Рис. 7. Морфометрическое исследование астроцитов на 25 DIV (а–з), полученных из клеточного материала от здорового донора, и астроцитов на 10 DIV и 25 DIV, полученных из клеточного материала от донора c мутацией в гене LRRK2 Данные представлены в виде «среднее значение ± стандарт­ная ошибка среднего». ЗД 25 DIV — здоровый донор, 25 дней invitro; БП 10 DIV — донор с БП, 10 дней invitro; БП 26 DIV — донор с БП, 26 дней invitro. Сравнения проводили между группами: ЗД 25 DIV и БП 26 DIV и между группами БП 26 DIV и БП 10 DIV. Различия считались статистически значимыми при p≤0,05 (критерий Манна–Уитни); * статистически значимое различие между группами ЗД25 DIV и БП 26 DIV; # между группами БП 26 DIV и БП 10 DIV

---

Были выявлены различия в средних значениях морфометрических параметров митохондрий в клетках исследованных культур. В культуре с БП-ассоциированной мутацией на 26 DIV число митохондрий на клетку и относительная площадь, занимаемая митохондриями в цитоплазме, были значительно меньше, чем в контроле (рис. 7, д, е). Вместе с тем в культуре астроцитов с БП-ассоциированной мутацией на 10 DIV среднее значение этих параметров было выше, чем в культуре той же линии на 26 DIV. Как видно из гистограммы (см. рис. 7, д, е), значения этих показателей в культуре БП на 10 DIV были несколько выше, чем в контроле. Однако мы не проводили сравнения между двумя этими культурами, поскольку они различались по срокам культивирования, и любые выявленные различия между ними могут объясняться в большей степени различиями в сроках дифференцировки, нежели патологическими особенностями культуры с генетической мутацией. В культуре БП на 25 DIV показатель степени округлости митохондрий был ниже, чем в культуре БП на 10 DIV, но не отличался от контроля (рис. 7, ж). Площадь митохондрий в клетках культуры БП на 25 DIV была немного меньше, чем в контроле и в культуре БП на 10 DIV, однако эти различия не были статистически значимыми (рис. 7, з).

Обсуждение

В настоящей работе исследованы культуры астроцитов, полученные методом направленной дифференцировки из ИПСК. Разработка технологии репрограммирования соматических клеток в ИПСК с дальнейшей их направленной дифференцировкой в клетки любого заданного типа произвела революцию в области in vitro технологий и в настоящий момент является одним из наиболее бурно развивающихся направлений биомедицинских исследований во всем мире. Протоколы дифференцировки клеток каждого типа постоянно обновляются и совершенствуются. Разработанный и описанный в данном исследовании протокол основан на методических рекомендациях, описанных в работе 2018 г. [19], и обеспечивает стабильное получение жизнеспособных культур астроцитов, фенотип которых был нами подтвержден в настоящей работе с помощью комплекса методов: ПЦР в режиме реального времени, иммуноцитохимического окрашивания и просвечивающей электронной микроскопии. И в контрольной линии, и в линии с БП-ассоциированной мутацией клетки экспрессировали глияспецифичные белки, а их ультраструктура в основном соответствовала ультраструктуре астроцитов серого вещества головного мозга человека, описанной в литературе [20]. Вместе с тем в культуре астроцитов с БП-ассоциированной мутацией в гене LRRK2 встречались клетки, ультраструктурно соответствующие развивающимся нейронам. В ранее опубликованной работе [14] выявлено более значительное повышение транскрипции гена β-­III-тубулина, специфичного для нейронов, в процессе длительного культивирования астроцитов с мутацией в гене LRRK2 по сравнению с контрольными астроцитами. Эти данные свидетельствуют о возможности наличия в культуре астроцитов, полученных из ИПСК по использованному протоколу, некоторого количества клеток, дифференцировавшихся в нейрональном направлении. Кроме того, ПЦР-исследование показало, что часть глияспецифичных генов экспрессировалась на пониженном уровне в клетках, несущих мутантный ген, что может указывать на смещение сроков или нарушение процесса дифференцировки в глиальных клетках от пациента с БП. Проведенное морфометрическое исследование не выявило различий в размере клеток и ядерно-­цитоплазматическом соотношении между клетками от здорового донора и от пациента с БП. В работе [21] получены другие данные морфометрии: астроциты с мутацией G2019S в гене LRRK2 отличались от контроля значительно меньшими размерами.

Полученные в настоящей работе результаты электронно-­микроскопического исследования свидетельствуют о резко выраженных изменениях ультраструктуры астроцитов с БП-ассоциированной мутацией в гене LRRK2, приводящих в конечном итоге к гибели этих клеток при длительном их культивировании. Повышенный уровень апоптоза был ранее показан в работах на культурах нейробластомы и мышиных кортикальных нейронов с мутацией в гене LRRK2 [22]. Однако в нашей работе в клетках с мутацией LRRK2 при длительном культивировании (26 DIV) не наблюдалось классических ультраструктурных признаков апоптоза, таких как структурированная конденсация хроматина и органелл и образование апоптотических телец. Клетки находились в состоянии некробиоза с характерными необратимыми изменениями ядра и органелл: деструкцией хроматина, прекращением синтеза белка с отсоединением рибосом от цистерн гранулярной ЭПС и распадом их на отдельные субъединицы, дезинтеграцией цитоскелета и клеточных мембран, а также исчезновением митохондрий. Последний признак был самым выраженным, и это свидетельствует, что именно митохондрии при мутациях в гене LRRK2 подвержены наиболее драматическим изменениям. Разрушение митохондрий приводит к нарушению окисления жирных кислот в клетке и образованию липидных и белковых включений, а также вызывает остановку продукции АТФ и, как следствие, прекращение всех энергозависимых внутриклеточных процессов. Астроциты способны синтезировать и накапливать небольшое количество гликогена [23]. В нашем исследовании в культурах астроцитов с БП, в отличие от контроля, в клетках были значительно сильнее развиты цистерны гладкой ЭПС и встречались включения гликогена, что свидетельствует о наличии компенсаторно-­приспособительных реакций клеток в ответ на снижение продукции АТФ вследствие деструкции митохондрий. Накопленный гликоген позволяет астроцитам еще некоторое время поддерживать жизнедеятельность за счет гликолиза, однако запасы гликогена исчерпаемы. О снижении митохондриальной активности и продукции АТФ при одновременном усилении процесса гликолиза у астроцитов, полученных из ИПСК лиц с БП и мутацией G2019S в гене LRRK2, сообщалось также в работе [21].

В ранее опубликованном исследовании мы показали патологические изменения митохондрий в культуре нейронов, дифференцированных из ИПСК от того же донора с мутацией в гене LRRK2 [24]. Митохондрии в нейронах находились на разных стадиях разрушения крист, набухания и превращения в электронно-­прозрачные вакуоли. В том же исследовании с помощью технологии мультиплексного измерения транскрипционной активности генов Nanostring было продемонстрировано изменение в нейронах пациентов с БП активности генов, связанных с функционированием дыхательной цепи, продукцией АТФ, взаимодействием митохондрий с ЭПС, поддержанием внутриклеточного баланса кальция, митофагией и репликацией митохондриальной ДНК [24]. Митохондриальные нарушения были выявлены не только в нейронах и глии, но и в фибробластах c мутацией в гене LRRK2 [25]. Эти нарушения, по-видимому, являются универсальным и ведущим признаком БП, ассоциированной с данной мутацией. Несколько других исследований также показали изменение уровня митофагии в культурах с мутацией в гене LRRK2. Например, в работе [26] продемонстрировано уменьшение количества митохондрий в дендритах в результате повышения уровня митофагии вследствие нарушения кальциевого баланса. В нашем же исследовании снижение количества митохондрий вплоть до полного их исчезновения в культуре на 26 DIV проходило не столько путем митофагии, сколько в результате постепенной деструкции самих митохондрий, их набухания и превращения в вакуоли. Возможной причиной дисфункции митохондрий у астроцитов с мутацией G2019S в гене LRRK2 может быть стресс эндоплазматического ретикулума [27], свидетельствующий о нарушении и прекращении посттрансляционных изменений и дальнейшего внутриклеточного транспорта синтезированных в гранулярной ЭПС белков. Ультраструктурные признаки стресса эндоплазматического ретикулума, такие как появление расширенных и заполненных умеренно электронно-­плотным содержимым цистерн, открепление от гранулярной ЭПС рибосом, были выявлены в нашей работе. Усиленное образование контактов между дисфункциональной ЭПС и митохондриями при этом состоянии приводит к перегрузке митохондрий ионами Са²⁺, их повреждению [27] и последующему запуску процесса клеточной гибели [28].

Другой характерной патологией глиальных клеток от пациента с БП в нашей работе было появление вакуолей с содержимым различной электронной плотности. Такие вакуоли особенно часто встречались в клетках, полностью лишенных митохондрий на длительном сроке культивирования (26 DIV). Мы полагаем, что образование вакуолей напрямую связано с дегенерацией митохондрий.

Крупные вакуоли с электронно-­прозрачным содержимым, вероятно, образовались в результате набухания митохондрий. C.M. Higgins и соавт. [29] описали вакуолизацию цитоплазмы у мышей на модели бокового амиотрофического склероза. Методами иммунофлуоресценции и иммуноэлектронной микроскопии авторы показали, что эти вакуоли образовывались путем набухания митохондрий, а не в результате аутофагии. Процесс набухания, разрушения крист и постепенного превращения митохондрий в вакуоли описан и при патологии кардиомиоцитов под названием «митохондриальная вакуолярная дегенерация» [30].

Накопление в клетках липидных капель рассматривают как признак стресса, вызванного разнообразными внешними и внутренними факторами [31]. Липидные капли были обнаружены и в нейронах с той же мутацией в гене LRRK2 [32]. Увеличение количества липидных капель в астроцитах при митохондриальной дисфункции, гипоксии и образовании активных форм кислорода представляет собой адаптационно-­защитный эволюционно-­консервативный механизм, являющийся одним из ранних признаков нейродегенеративного процесса [33, 34]. Выявленные в нашем исследовании липидные капли и липофагосомы в погибающих клетках могли быть образованы как в результате повышения уровня их синтеза в эндоплазматической сети, так и в результате декомпозиции (фанероза) дегенерирующих митохондрий и других мембранных органелл, что, однако, требует подтверждения с помощью методов молекулярной биологии. В ряде исследований последних лет показана локализация продукта экспрессии гена LRRK2, дардарина, в тесной взаимосвязи с мембранными органеллами и клеточными везикулами и участие его в метаболизме липидов, в том числе в фосфорилировании и катаболизме плазматических мембран и лизосомальных липидов [35]. Следовательно, мутация в гене LRRK2 может быть связана с нарушением нормальной утилизации мембран клеточных органелл и накоплением продуктов деградации в виде липидных и белковых включений.

Выявленное в нашей работе накопление аутофаголизосом свидетельствует о нарушении процесса макроаутофагии в клетках с мутацией в гене LRRK2 и согласуется с многочисленными данными литературы [7–11, 17].

Для оценки динамики патологических изменений в астроцитах с мутацией в гене LRRK2 мы сравнили ультраструктуру длительно культивированных (26 DIV) клеток с клетками этой же линии на меньшем сроке культивирования (10 DIV). По морфометрическим параметрам (площадь профильного поля, площадь ядра, ядерно-­цитоплазматическое соотношение) клетки этих культур не различались. В культуре на 10 DIV ультраструктура клеток была более сохранна, лишь единичные клетки демонстрировали признаки развивающейся клеточной гибели. Более того, клетки этой культуры проявляли признаки гиперпластических компенсаторно-­адаптационных изменений, таких как гипертрофия синтетического аппарата, увеличение количества митохондрий. Вероятно, к 26-му дню in vitro адаптационный резерв был исчерпан и у клеток в культуре на 26 DIV выявлялись уже только ультраструктурные признаки дегенерации.

Проведенное морфометрическое исследование показало, что в культурах с БП-ассоциированной мутацией (26 DIV) среднее количество митохондрий на клетку было статистически значимо меньше, чем в контроле. Эти различия в значительной мере объяснялись тем, что во многих клетках в культуре с БП-ассоциированной мутацией вообще не обнаруживалось ни одной митохондрии: они были изменены до неузнаваемости. Вместе с тем по морфометрическим параметрам (размеры и вытянутость) оставшиеся митохондрии слабо отличались от контроля. В обеих группах митохондрии были преимущественно мелкие, овальные. В клетках с LRRK2-мутацией в культуре на 10 DIV количество и площадь митохондрий были выше, чем в клетках культуры на 26 DIV, что является признаком компенсаторно-­приспособительных реакций на более коротком сроке культивирования.

Результаты нашего электронно-­микроскопического исследования, свидетельствующие о выраженном снижении жизнеспособности митохондрий в клетках при наличии мутации в гене LRRK2, соотносятся с литературными данными [24–26] о ключевой роли митохондрий в патогенезе БП. Накопление разнообразных вакуолей является характерным фенотипическим признаком клеток с данной мутацией и свидетельствует о нарушении в них процессов аутофагии. Дальнейшие исследования необходимы для уточнения молекулярных механизмов, приводящих к наблюдаемым ультраструктурным изменениям в клетках с мутантным геном LRRK2.

Заключение

В проведенном исследовании с помощью комплекса методов ПЦР в режиме реального времени, иммуноцитохимического окрашивания на глияспецифичные белки и просвечивающей электронной микроскопии подтвержден фенотип астроцитов, дифференцированных из ИПСК. И ПЦР, и электронно-микроскопическое исследование показали нарушения процесса дифференцировки в линии клеток с БП-ассоциированной мутацией. Вместе с тем применение метода электронной микроскопии позволило выявить ультраструктурные патологические признаки в клетках мутантной линии, не заметные при рутинном исследовании живых клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии и клеток, окрашенных иммунофлуоресцентным методом, с помощью люминесцентной микроскопии. Среди выявленных электронно-микроскопическим методом нарушений отмечаются повреждение митохондрий, нарушение аутофагии и стресс эндоплазматического ретикулума. Эти патологии можно выявить и молекулярно-генетическими методами, в том числе ПЦР, Nanostringи другими. Однако метод электронной микроскопии значительно менее дорогостоящий и не требует применения разных реактивов под разные задачи, как, например, специальных панелей для Nanostringили праймеров для ПЦР. При электронно-микроскопическом исследовании на одном срезе можно наблюдать морфофункциональное состояние сразу всех компонентов клетки: ядра, цитоплазмы, органелл. Поэтому электронная микроскопия может быть использована и как первичный метод исследования на начальном этапе изучения патологического образца для определения векторов дальнейшего молекулярно-генетического и функционального исследования с применением других методов.

Таким образом, просвечивающая электронная микроскопия демонстрирует значительный потенциал применения в исследованиях, касающихся клеточных технологий, как в качестве самостоятельного метода, так и в комплексе с традиционными для данной области методами, в том числе ПЦР, иммуноцитохимическим окрашиванием на глияспецифичные белки и другими.

Финансирование. Работа поддержана грантом Российского научного фонда №24-45-00052, а также выполнена при финансовой поддержке в рамках государственного задания НИЦ «Курчатовский институт» с использованием оборудования ресурсного центра «Центр клеточных и генных технологий».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.