Повышение противоопухолевой активности Диоксадэта и Цисплатина при гипертермической интраперитонеальной химиоперфузии на модели распространенного рака яичника

В современной клинической онкологии перспективным методом повышения эффективности лечения злокачественных новообразований является гипертермия, которая применяется в комбинации с хирургической циторедукцией, химио- и лучевой терапией [1–4]. Известно, что гипертермия сама по себе оказывает противоопухолевое действие, а также способствует повышению цитотоксичности противоопухолевых препаратов и усиливает их проникновение в ткани, однако данный метод пока не входит в стандарты лечения онкологических больных [5–7]. Одной из проблем, препятствующих распространению гипертермического лечения в клинике, является отсутствие технического оснащения и трудоемкость выполнения. Системы безопасности здоровья нации Нидерландов и Франции рекомендуют гипертермическую интраперитонеальную химиоперфузию (ГИПХ) в качестве стандарта лечения канцероматоза брюшины только при раке толстой кишки; в других странах Европы и в России ГИПХ применяют в зависимости от конкретного случая [2–4].

Мы считаем, что ГИПХ может более широко использоваться интраоперационно при циторедуктивных операциях на брюшной полости: как самостоятельный метод лечения опухолей, которые поражают стенку брюшной полости, а также для профилактики канцероматоза брюшины. Применяемые сегодня противоопухолевые препараты при ГИПХ отличаются сравнительно высокой местной и системной токсичностью: болями после введения, образованием спаек в брюшной полости; развитием лейкопении и тромбоцитопении; поражением почек, печени, нервной системы [8]. Для улучшения результатов лечения больных и снижения токсичности необходим поиск новых противоопухолевых препаратов. В НИИ онкологии им. Н.Н. Пет­рова (С.-Петербург, Россия) был разработан противоопухолевый препарат из группы алкилирующих соединений этилениминов — Диоксадэт, обладающий высоким контактным противоопухолевым действием и более благоприятным профилем токсичности в сравнении с другими алкилирующими цитостатиками [8, 9].

Цель исследования — изучить противоопухолевую активность Диоксадэта и Цисплатина в режиме гипертермической интраперитонеальной химиоперфузии на модели канцероматоза брюшины после перевивки рака яичника.

Материалы и методы.

Животные и опухолевый штамм. Исследование проведено на 103 аутбредных крысах-самках линии Вистар с массой тела 200–260 г, полученных из разводки питомника «Рапполово» РАМН. Животные содержались в стандартных условиях вивария, получали полнорационный брикетированный комбикорм (рецепт ПК-120) производства компании «Лабораторкорм» (Россия) и водопроводную питьевую воду без ограничений. Обслуживание и уход за всеми экспериментальными животными осуществлялись согласно рекомендациям этического комитета по защите животных НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова и в соответст­вии с Национальными рекомендациями.

Использован штамм опухоли яичника (ОЯ), полученный из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Штамм ОЯ перевивали внутрибрюшинно крысам в количестве 1·10⁷ опухолевых клеток.

Технология химиоперфузионного лечения. Для химиоперфузионного лечения использовано оборудование производства Центрального научно-исследовательского и опытно-конструкторского института робототехники и технической кибернетики (Россия): мехатронный перфузионный перистальтический насос «Марс»; баня термостатирующая прецизионная LOIP LB-200; универсальный кибернетический комплекс регистрации и анализа параметров витальных функций «Телец». Использованы также грелка (Microlife FH 80, 30,5×34,5 см, Германия), цифровые термометры CheckTemp (Hanna, Германия), катетеры (KD Medical GmbH Hospital Products, Германия), рассасывающийся шовный материал (Safil 3/0 B/Braun, Германия), нерассасывающийся шовный материал (Ethibond Excel 2.0, Johnson & Johnson, США), лекарственные препараты: гемобаланс (Nature Vet, Австралия), кетопрофен (Фламакс^®, ЗАО «ФармФирма “Сотекс”», Россия), тиопентал натрия (ОАО «Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий “Синтез”», Россия), цефтриаксон (MEDOCHEMIE LTD, Кипр), Цисплатин (Pharmachemie B.V., Нидерланды). Диоксадэт был синтезирован компанией «Кемконсалт» (Россия) в соответствии с лабораторным технологическим регламентом, подлинность подтверждена 1H-ЯМР-спектроскопией, инфракрасной спектроскопией, высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке Zorbax Eclipse XDB-C18 4,6×150 mm, 5um (Agilent, США); содержание Диоксадэта составляло не менее 95%.

Для наркоза и аналгезии животным вводили подкожно кетопрофен 5 мг/кг массы тела и внутрибрюшинно — тиопентал натрия 60 мг/кг, после чего выполняли лапаротомию и устанавливали в брюшную полость катетеры на приток и отток, а также цифровые термометры. Абдоминальная стенка зашивалась в два слоя с использованием стерильного рассасывающегося шовного материала для мышечной ткани и нерассасывающегося — для кожи. С помощью перистальтического перфузионного насоса осуществляли нагнетание раствора по приточной магистрали в термостатирующую водяную баню, где он нагревался до 45–46°С и далее поступал в брюшную полость. Температура перфузата в брюшной полости составляла 40,5–41,5°С. Перфузия проводилась 45 мин, объем перфузата — 200 мл. На протяжении операции животное находилось на теплой грелке для предотвращения гипотермии организма. Температуру брюшной полости, частоту сердечных сокращений и ритм сердца контролировали с помощью цифрового термометра, электродных датчиков универсального кибернетического комплекса регистрации и анализа параметров витальных функций. Ректальную температуру измеряли цифровым термометром. После химиоперфузии проводили промывание брюшной полости 0,9% раствором натрия хлорида в течение 20 мин, катетеры и термометры вынимали и стенку брюшной полости зашивали в два слоя. Сразу после операции и через 24 ч животному вводили внутримышечно цефтриаксон 93 мг/кг, подкожно гемобаланс 0,1 мл и 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

Экспериментальные группы и оценка противоопухолевых эффектов. Крысы после перевивки ОЯ были рандомизированы на 6 групп: 1-я группа (n=19) — контроль (0,5 мл физиологического раствора внутрибрюшинно); 2-я группа (n=14) — гипертермическая интраперитонеальная перфузия физиологическим раствором (ГИПП); 3-я группа (n=12) — Цисплатин в физиологическом растворе 4 мг/кг внутрибрюшинно; 4-я группа (n=14) — ГИПХ Цисплатином 20 мг/кг; 5-группа (n=19) — Диоксадэт в физиологическом растворе 1,5 мг/кг внутрибрюшинно; 6=я группа (n=13) — ГИПХ Диоксадэтом 15 мг/кг. Внутрибрюшинное введение и ГИПХ противоопухолевыми препаратами проводили в ранее установленных максимально переносимых дозах. Все манипуляции осуществляли однократно через 48 ч после перевивки ОЯ. За животными наблюдали в течение 90 дней. Противоопухолевые эффекты лечения оценивали по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) животных, сравнивая медианы продолжительности жизни (МПЖ) крыс разных групп.

Обработка данных. Результаты эксперимента подвергали статистической обработке с помощью программ GraphPad Prism 6, SPSS Statistics 17.0. При статистическом анализе показателей выживаемости использовали критерий Лиллиефорса, показателей МПЖ в группах — непараметрический критерий U (Манна–Уитни). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Работа проведена в соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.), и одобрена Локальным этическим комитетом НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава России.

Результаты и обсуждение. Критерий Лиллиефорса, примененный к анализу результатов выживаемости, показал, что распределение не соответствует нормальному, поэтому выживаемость крыс в группах сравнивали только по МПЖ.

Влияние противоопухолевых препаратов при внутрибрюшинном введении и ГИПХ на выживаемость животных. УПЖ крыс в группе ГИПП физиологическим раствором (2-я группа) по сравнению с контролем (1-я группа) составляло 150% (p=0,008). При внутрибрюшинном введении Цисплатина (3-я группа) и Диоксадэта (5-я группа) УПЖ составило соответственно 117 (p=0,007) и 211% (p=0,001) по сравнению с контролем (1-я группа) (см. таблицу, рис. 1). Полученные результаты убедительно показывают, что гипертермия сама по себе оказывает противоопухолевое действие на рост ОЯ у крыс, сопоставимое с эффектом внутрибрюшинного введения цитостатиков.

---

Влияние диоксадэта и цисплатина при внутрибрюшинном и химиоперфузионном введении на продолжительность жизни крыс-самок с опухолью яичника

---

Рис. 1. Влияние Диоксадэта и Цисплатина при гипертермической интраперитонеальной перфузии на выживаемость животных с опухолью яичников (кривые Каплана–Мейера)

---

Механизмы гибели опухолевых клеток при гипертермии являются многосторонними [3, 4, 10, 11]:

1) увеличение проницаемости мембраны клеток сосудов, что приводит к повышению доставки лекарст­венного вещества в опухолевые клетки, нарушению транспорта ионов (Ca²⁺, Na⁺, Mg²⁺, K⁺), свободнорадикальному окислению. Ca²⁺ может вовлекаться в гипертермическую клеточную смерть. Увеличение Ca²⁺ вне клетки стимулирует активность кальмодулинзависимых протеинкиназ, образование инозитолтрифосфата и другие сигнальные каскады;

2) индукция разборки цитоскелета, увеличение пор опухоли, изменение веретена деления, организация центросом и денатурация белков приводят к образованию многоядерных неклональных клеток, способствуют аноикозу (отрыв клеток от клеток-соседей) и апоптозу;

3) ингибирование ДНК, РНК и синтеза белка. Гипертермия вызывает разрыв двойной спирали ДНК в результате денатурации и дисфункции белков, восстанавливающих температурные повреждения (таких как ДНК-полимераза), или из-за осаждения денатурированных белков на структуры ядерного хроматина, что создает барьер, препятствующий восстановлению ферментов с поврежденного участка;

4) индукция синтеза белков теплового шока (HSPs), которые защищают жизненно важные белки в нормальных клетках. Белки теплового шока при гипертермии могут активировать иммунную систему. Важность белков теплового шока, включая HSPs70 и HSPs90, в иммунных реакциях продемонстрирована разными исследователями, которые показали, что лечение нагреванием опухолевых клеток может выполнять вакциноподобную роль и вызывать противоопухолевый иммунитет [12].

Выраженность клеточной гибели при гипертермии зависит от клеточного цикла. Клетки S- и M-фазы подвергаются медленной гибели, в то время как клетки G1-фазы подвергаются быстрой гибели сразу после гипертермии. Микроскопический анализ клеток M-фазы, подвергнутых гипертермии, показал повреждения их митотического аппарата, приводящие к неэффективности митоза и полиплоидии. Клетки S-фазы также чувствительны к гипертермии, после которой в них наблюдали хромосомные повреждения [11].

При ГИПХ Цисплатином (4-я группа) и Диоксадэтом (6-я группа) по сравнению с контролем (1-я группа) УПЖ составило 183 (p=0,002) и 444% (p<0,001) соответственно, причем для Цисплатина статистически значимой разницы значений с таковыми при его внутрибрюшинном введении (3-я группа) и ГИПП физиологическим раствором (2-я группа) не отмечено. Диоксадэт при ГИПХ (4-я группа) по сравнению с его внутрибрюшинным введением (5-я группа) и ГИПП физиологическим раствором (2-я группа) увеличивал МПЖ соответственно на 75 (p=0,002) и 118% (p=0,038). УПЖ при ГИПХ Диоксадэтом было на 261% больше, чем при ГИПХ Цисплатином (p=0,145) (см. таблицу, рис. 1).

Применение Цисплатина и Диоксадэта в режиме ГИПХ увеличивает их противоопухолевую активность, что согласуется с литературными данными, согласно которым гипертермия проявляет синергизм с противоопухолевыми препаратами, такими как блеомицин, Адриамицин, производные платины [4]. В наших исследованиях наиболее высокая эффективность химиоперфузионного лечения установлена при ГИПХ Диоксадэтом, когда достигается потенцирование противоопухолевого действия гипертермии и цитостатика.

Эффективность интраперитонеального введения лекарственных веществ определяется молярной массой соединения, его растворимостью в липидах и воде, значением AUC (area under the curve — площадь под фармакокинетической кривой: концентрация–время) и другими показателями. Диоксадэт и препарат сравнения Цисплатин имеют сходный механизм действия. Они убивают клетки на всех стадиях клеточного цикла, взаимодействуют с нуклеофильными группами ДНК, РНК и белка, образуют меж- и внутримолекулярные сшивки ДНК–белок и ДНК–ДНК [9, 13]. Молярная масса Диоксадэта (М=322,36 г/моль) незначительно больше, чем Цисплатина (300,05 г/моль). Одно из основных отличий физико-химических свойств между препаратами — растворимость в воде и липидах. Преимуществом диоксадэта является наличие амфифильных свойств, тогда как Цисплатин обладает только гидрофильными. Следовательно, в опухолевую клетку оба препарата проникают одинаково и создают там высокую концентрацию, тогда как на ее поверхности и в пространстве вокруг опухоли высоким будет содержание только Диоксадэта в результате его липофильности [13, 14]. Значение AUC для Цисплатина составляет 12, для Диоксадэта — не установлено. По показателям растворимости и молярной массы Диоксадэт сходен с митомицином С, у которого AUC достигает 80. Исходя из этого мы можем предположить, что значение AUC диоксадэта примерно такое же, как у митомицина С, что объясняет более высокий противоопухолевый эффект Диоксадэта по сравнению с Цисплатином при интраперитонеальном введении данных препаратов.

При анализе изменения массы тела экспериментальных животных в первые 10 дней после гипертермической интраперитонеальной перфузии (рис. 2) максимальное снижение массы тела наблюдали в группе крыс, получавших ГИПХ Цисплатином (до 6-го дня после перфузии). Минимальные значения относительной массы тела в группах ГИПП и ГИПХ Диоксадэтом были равны. Полученные результаты могут быть обусловлены тем, что Цисплатин оказывает более выраженное токсическое действие, чем Диоксадэт, поэтому послеоперационный период у крыс в группе ГИПХ Цисплатином протекал тяжелее.

---

Рис. 2. Изменение средней относительной массы тела крыс-самок с опухолью яичника в течение 10 сут после гипертермической интраперитонеальной перфузии

---

Перспективы ГИПХ для лечения канцероматоза брюшины. Полученные результаты дают возможность утверждать, что использование ГИПХ Диоксадэтом позволяет существенно повысить эффективность лечения канцероматоза брюшины у больных раком яичника. Преимуществом применения Диоксадэта для интраперитонеальной химиотерапии рака яичника служит более высокая эффективность по сравнению с Цисплатином и то, что он не вызывает спаек в брюшной полости, тогда как осложнением при внутрибрюшинном введении препаратов платины является спаечный процесс. Кроме того, попадая в кровоток, Диоксадэт обладает только гематотоксичностью, тогда как препараты платины оказывают гематотоксическое, ототоксическое, нейротоксическое и нефротоксическое действия [9]. ГИПХ Диоксадэтом можно рекомендовать для дальнейших клинических испытаний с целью внедрения в практику лечения канцероматоза брюшины у больных с далеко зашедшими стадиями рака яичника. С учетом широкого спектра противоопухолевой активности Диоксадэта [9] следует предположить, что его высокодозная лекарственная форма может успешно применяться и в химиоперфузионном лечении канцероматоза брюшины, вызываемого злокачественными опухолями толстой кишки, желудка и других локализаций.

Заключение. На модели канцероматоза брюшины при раке яичника гипертермическая интраперитонеальная перфузия физиологическим раствором оказывает противоопухолевое действие, сопоставимое с эффектами внутрибрюшинного введения алкилирующих цитостатиков Цисплатина и Диоксадэта. При гипертермической интраперитонеальной химиоперфузии Диоксадэт оказывает существенно более выраженное противоопухолевое действие, чем Цисплатин.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Минобрнауки России «Разработка инновационной технологии лечения диссеминированного рака яичника», соглашение №8305; стипендии Президента Российской Федерации молодым ученым и аспирантам, осуществляющим перспективные научные исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации россий­ской экономики на 2012–2014 гг. «Разработка инновационного противоопухолевого лекарственного препарата для химиоперфузионного лечения канцероматоза брюшины»; программы «Участник Молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») Мин­обрнауки РФ (Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, соглашения №9556р/14193 от 04.07.2011, №10810р/16939 от 13.08.2012, №141 ГУ1/2013 от 07.10.2013).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.