Генное регулирование программированной клеточной гибели миокарда при остром инфаркте миокарда, ее динамика при лечении и перспективы терапии

С.С. Белоусов, А.Н. Кузнецов, Н.В. Ерошевская, Д.В. Новиков, В.В. Новиков

Ключевые слова: апоптоз при инфаркте миокарда; гены апоптоза; левокарнитин.

Цель исследования — изучение генной регуляции апоптоза при остром инфаркте миокарда и в процессе лечения, оценка влияния левокарнитина (Элькара) на экспрессию генов Fas-зависимого пути апоптоза.

Материалы и методы. Обследовано 28 больных Q-инфарктом миокарда, включенных в исследование в первые сутки от начала заболевания и наблюдавшихся в процессе лечения, из которых сформировали две группы. 1-я группа (n=10) состояла из больных, находившихся на принятом в настоящее время стандартном лечении (антиагреганты, ингибиторы АПФ, антиангинальные — по показаниям). 2-я группа (n=18) — больные, получающие стандартное лечение, к которому с первого дня добавлялся Элькар (левокарнитин) внутривенно в физиологическом растворе 5% глюкозы в дозе 3,0 г дважды в сутки в течение трех дней. В течение последующих 7 дней больной получал Элькар перорально по 4,0 г в сутки. 3-я группа (n=18) — контрольная, состояла из здоровых лиц.

Всем больным проводилось общеклиническое обследование, ЭКГ, эхокардиография, генетическое исследование: определялась экспрессия мPHK генов mFas и sFas с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, трижды у каждого больного — при поступлении, через неделю лечения и в конце второй недели лечения.

Результаты. Выявлено, что экспрессия генов апоптоза у больных Q-инфарктом повышена по сравнению с нормой и что это повышение длится и за пределами острого периода инфаркта. Установление данного факта позволяет объяснить причину пролонгирования апоптоза сохраняемой активностью генов, индуцирующих апоптогенез. Применение левокарнитина способствует нормализации повышенного уровня экспрессии генов и таким путем оказывает кардиопротективное действие, важное при лечении острого инфаркта, особенно в острый период.

К числу важных достижений современной биологической науки и медицины относится открытие механизмов апоптоза клеток и изучение роли генных нарушений в онтогенезе, патогенезе сердечно-сосудистых и других заболеваний.

Установлено, что при остром инфаркте миокарда программированная гибель миокарда сопутствует гибели клеток от некроза в центральной зоне инфаркта и наблюдается в значительно большем размере (в разы) в периинфарктной зоне [1–3]. Апоптоз продолжается также и в постинфарктном периоде на протяжении нескольких недель и даже месяцев, вызывая расширение зоны погибшего миокарда и ремоделирование желудочка, развитие сердечной недостаточности, повышая риск аритмогенеза и других осложнений постинфарктного периода. Процесс программированной гибели клеток протекает под контролем генетической системы — от первого, начального, периода инициации до финальной стадии, стадии деградации. Как установлено, в этот процесс вовлечено свыше 25 генов, которые могут действовать на апоптогенез по-разному. Конечный результат зависит от нарушения баланса между про- и антиапоптозными влияниями этих генов. Именно поэтому необходимо знать состояние генной активности. Имеются разные патогенетические виды апоптоза, например Fas-зависимый вид начала и течения апоптоза. Есть вид, связанный с нарушениями митохондриальной генетической системы, а также другие виды: цитокиновый, пероксидативный и т.д.

Очевидно, что регуляция программированной гибели клеток органов и тканей будет требовать разных лечебных мероприятий. Решение этой важной задачи невозможно без кооперативных исследований клиницистов-кардиологов, генетиков, иммунологов. Это позволит: 1) провести поиск возможных путей генетической регуляции индуцированного апоптоза у больных инфарктом миокарда; 2) оценить эффективность парциальных и комбинированных методов регуляции генетического аппарата клеток.

В процессе работы решались следующие задачи: 1) количественная характеристика активности генов основного (рецепторного) пути апоптоза при остром инфаркте миокарда (так называемого Fаs-зависимого пути апоптоза) на различных этапах развития болезни; 2) исследование динамики в процессе лечения двух форм гена Fas: мембраносвязанной формы mFas (CD95, FasR) и растворимой формы sFas (FasL, CD178); 3) количественная оценка влияния на экспрессию генов Fas препарата левокарнитин (Элькар), способного, по некоторым данным, оказывать тормозящее действие на процесс апоптоза. Этот препарат обладает антиоксидантным действием, повышает толерантность миокарда к дефициту кислорода (гипоксии), улучшает сократительную функцию сердца [4–10].

Материалы и методы. Активность генов апоптоза исследовали путем определения в крови после лизиса клеточных и ядерных мембран содержания мРНК исследуемых генов, которое зависит от общего количества генов и их эффективности. Уровень мРНК в крови определяли путем амплификации (накопления) ее количества в ходе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени cпомощью специального устройства DT Lite 4 («ДНК-Технология», Россия) и рассчитывали с учетом фотофлюоресцентной реакции праймеров, специфичных для исследуемых мРНК. Учитывали число циклов, необходимое для амплификации праймера до того количества, которое давало реакцию флюоресценции. Этот момент носит наименование Cp — точка пересечения (англ. crossing point) и позволяет провести расчет количества амплификата. Для этого применяются специальные формулы, предложенные биотехнологами. Наибольшую популярность имеет метод расчета, разработанный генетиками Германии и Англии, известный под названием REST (relative expression softlove tool) — компьютерная программа расчета относительной экспрессии нуклеопротеинов [11, 12].

Группа экспертов, проверявшая этот метод расчета экспрессии генов, отметила точность, воспроизводимость данных этой программы и ее пригодность для расчетов межгрупповых и индивидуальных соотношений [3].

Все операции по исследованию экспрессии генов апоптоза проводились в лаборатории НИИ молекулярной иммунологии Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского.

При определении экспрессии генов указанная программа использует относительную величину R, выводимую из формулы R=E⁽^Δ^{Cp target gene–Cp ref gene)}.

В этой формуле E (эффективность) выражает величину, на которую увеличивается концентрация мРНК в течение одного цикла; Cp — количество циклов до начала кривой флюоресценции; ref gene — ген сравнения (контроля); а target gene — целевой ген; Δ — разница между средним значением Ср в группе обследуемых и средним значением референтного гена.

Найденная величина R отображает, насколько искомый (таргетный) ген активнее по показателю экспрессии в сравнении с покоящимся геном. Численное значение R является безразмерной величиной. Считается, что определение абсолютного значения уровня гена в крови не имеет преимуществ перед информативностью относительной экспрессии. Все данные приводятся в сравнении с уровнем гена «домашнего хозяйства» (убиквитина/референтного гена), считающегося наиболее стабильным и принимаемым за точку отсчета в так называемых нормализованных результатах. Изучение экспрессии проведено путем сравнения усредненных данных экспрессии мРНК (mFas и sFas форм гена Fas) в группах больных и группах здоровых. При анализе динамики генов использовалось сравнение исходных и достигнутых данных. Статистические данные признавались достоверными при величине р<0,05. Получаемые данные являются «нормализованными», т.е. соотнесенными с уровнем гена «домашнего хозяйства».

На протяжении времени госпитализации больные получали лечение установленного стандарта — ингибиторами ангиотензина, антиангинальными и антиагрегантными средствами. Поводили ЭКГ- и эхоКГ-исследования в динамике и биохимические исследования (С-реактивный белок, КФК-МВ, тропонин-I, липиды крови и др.).

Всего обследовано 28 больных инфарктом миокарда, из которых 16 мужчин и 12 женщин. Средний возраст мужчин — 62 года, женщин — 68 лет.

Тяжесть состояния оценивали при поступлении по показателю TIMI, среднегрупповые значения которого в группе мужчин были равны 4, в группе женщин — 4,2. Передний инфаркт миокарда установлен у 16 больных, нижний — у 9, циркулярный — у 3.

Также были обследованы 18 здоровых лиц (доноров и сотрудников лечебных учреждений) с целью формирования группы сравнения (контроля).

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия)) и одобрено Этическим комитетом НижГМА. От каждого пациента получено информированное согласие.

Исследование динамики экспрессии генов Fas выполнено у 10 больных инфарктом миокарда, которые прошли десятидневный курс лечения левокарнитином (Элькар, ф. «Пик-Фарма», Россия), препаратом, у которого предполагается ингибирующее апоптоз действие.

Всего проанализировано 156 анализов от здоровых и больных людей.

Результаты и обсуждение. Уровень экспрессии мРНК гена mFasздоровых людей, нормализованный по уровню референтного гена, равен 4,2. Экспрессия этого гена в группе больных крупноочаговым инфарктом оказалась в первый день равной 9,56, т.е. в 2 раза выше. Экспрессия мРНК sFas была равной 4,5 в группе здоровых и 8,87 — в группе больных. Функциональную активность генов Fas у больных в процессе лечения демонстрируют данные повторных исследований экспрессии мРНК Fas, проведенных через 1 и 2 нед, что согласно консенсусным методическим разработкам AHA (Американской кардиологической ассоциации и коллегии университетских кардиологов), Европейской кардиологической ассоциации и Российского общества кардиологов, соответствует первому — острому и второму — подострому периодам инфаркта миокарда (см. таблицу и рисунок).

Динамика экспрессии генов апоптоза при лечении инфаркта миокарда (величина R)

Экспрессия гена mFas (а) и sFas (б) у здоровых и больных острым инфарктом миокарда на фоне лечения Элькаром и без него: 1 — при поступлении; 2 — через 1 нед; 3 — через 2 нед

В таблице приведены значения R — относительной величины экспрессии генов (мРНК генов mFas и sFas) у больных острым инфарктом миокарда на протяжении острого и раннего постинфарктного периода и у здоровых людей, чьи данные приняты за норму. Также в таблице и рисунке приведены результаты мониторирования экспрессии генов под влиянием стандартного лечения больных в остром и раннем подостром периодах (1-я и 2-я недели) и на фоне комплексного лечения с включением левокарнитина (Элькара).

Показанная связь между длительностью экспрессии генов апоптоза mFas и sFas отмечена впервые и обосновывает необходимость проведения ингибиции апоптоза в целях протекции миокарда с помощью генной терапии инфаркта миокарда.

В связи с «кризисом» генно-инженерных методов в клинических условиях [13–16] фармакологическая регуляция генной активности (экспрессии) может быть альтернативой генно-инженерному методу, а применение левокарнитина, тормозящего митохондриальные нарушения, — важным дополнением к известным фармакологическим агентам защиты миокарда при инфаркте.

Заключение. Активация (экспрессия) генов, участвующих в развитии и поддержании Fas-зависимого пути апоптоза у больных крупноочаговым острым инфарктом миокарда, повышена по сравнению с нормой (уровнем экспрессии у здоровых людей). Повышенная экспрессия генов апоптоза сохраняется не только в фазе острейшего и острого (развивающегося) инфаркта, но и в ранней постинфарктной фазе, что может служить причиной длительности апоптоза у этих больных.

Препарат левокарнитин (Элькар), примененный в ранний период инфаркта миокарда, ингибирует апоптоз, снижая экспрессию генов апоптоза Fas-пути и оказывая цитопротективное действие.

Финансирование исследования. Работа проведена на личные средства авторов.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.