Содержание гамма-глутамилтранспептидазы в сыворотке крови и моче у новорожденных как показатель нарушения функции почек вследствие асфиксии

А.Н. Лобода, В.Э. Маркевич

Ключевые слова: γ-глутамилтранспептидаза; поражение почек при асфиксии новорожденных.

Цель исследования — оценить диагностическое значение содержания γ-глутамилтранспептидазы (ГГТП) в сыворотке крови и моче новорожденных с нарушением функции почек вследствие асфиксии.

Материалы и методы. Обследовано 200 доношенных новорожденных с признаками поражения почек: 100 детей, которые перенесли тяжелую асфиксию, и 100 детей с умеренной асфиксией. Группу сравнения составили 20 детей, не имевших асфиксии при рождении. Исследовали периферическую венозную кровь и мочу новорожденных. Материал забирали на 1–2, 7–8 и 25–30-е сутки жизни. Активность ГГТП определяли унифицированным методом по «конечной точке» с учетом скорости образования 5-амино-2-нитробензоата при длине волны 405 нм и температуре 37°С на полуавтоматическом фотометре с использованием реактивов фирмы «Ольвекс» (Россия).

Результаты. Поражение почек у новорожденных с асфиксией сопровождается существенным повышением уровня ГГТП в сыворотке крови и моче в первые 24–48 ч после рождения. Концентрация энзима в биологических жидкостях в этот временной промежуток была максимальной. В течение раннего неонатального периода отмечалось снижение содержания ГГТП как в сыворотке, так и в моче у детей с поражением почек вследствие асфиксии. К концу неонатального периода содержание фермента и в сыворотке, и в моче у этих новорожденных оставалось высоким.

У новорожденных с поражением почек вследствие умеренной асфиксии в течение первой недели жизни отмечалось снижение коэффициентов соотношения ГГТП сыворотки и ГГТП мочи (менее 2,5) относительно группы сравнения с последующим подъемом на 25–30-е сутки жизни. В то же время для новорожденных с поражением почек вследствие тяжелой асфиксии характерны высокие коэффициенты (более 4,0) в течение всего неонатального периода. В обследованных группах детей в течение раннего неонатального периода отмечается наличие статистически значимой средней силы положительной корреляции между содержанием ГГТП в сыворотке крови и моче.

Заключение. Сывороточная активность ГГТП характеризует выраженность синдрома цитолиза эпителия проксимальных почечных канальцев у новорожденных с поражением почек на фоне асфиксии. Неинвазивное определение уровня ГГТП в моче в раннем неонатальном периоде предпочтительно для скрининга поражения почек у новорожденных с асфиксией.

Оценка уровня органоспецифических ферментов в биологических жидкостях позволяет определить локализацию и интенсивность поражения почек [1]. Это имеет особое значение при асфиксии у новорожденных, поскольку может влиять на тактику ведения пациентов.

Одним из энзимов, специфичных для почечной ткани, является γ-глутамилтранспептидаза (ГГТП, γ-глутамилтрансфераза). Это фермент, катализирующий перемещение γ-глутамиловой группы от пептида либо содержащего данную группу соединения к акцепторному пептиду или аминокислоте [2].

ГГТП выявляют в мембранах клеток, обладающих высокой секреторной или абсорбционной способностью. Наиболее высокая активность характерна для эпителия проксимальных почечных канальцев. Несмотря на это, из-за высокой молекулярной массы в моче здоровых людей фермент практически не определяется. Повышение его концентрации в моче отмечается у пациентов с острыми инфекционными заболеваниями мочевой системы и состояниями, которые сопровождаются значительной деструкцией почечной ткани [2, 3].

Период полужизни ГГТП в сыворотке крови здоровых людей составляет 7–10 сут, при нарушении клиренса фермента он увеличивается до 28 сут. Благодаря этому, а также высокой органоспецифичности относительно почечной ткани, ГГТП может использоваться для диагностики поражения почек [4], в том числе у новорожденных.

Кроме того, данный энзим может выступать в качестве маркера оксидативного стресса. Высокий уровень ГГТП вызывает снижение обеспеченности глутатионом, что усиливает продукцию свободных радикалов и провоцирует оксидативный стресс [5]. Последний является одним из ключевых элементов асфиксии при рождении [6]. В то же время вопрос о диагностической роли ГГТП при нарушении функции почек у новорожденных с асфиксией остается неизученным.

Цель исследования — оценить диагностическое значение содержания γ-глутамилтранспептидазы в сыворотке крови и моче новорожденных с нарушением функции почек вследствие асфиксии.

Материалы и методы. Обследовано 200 доношенных новорожденных с признаками поражения почек. Младенцев распределили на две группы: 1-я (n=100) — дети, которые перенесли тяжелую асфиксию, 2-я (n=100) — дети с умеренной асфиксией. Группу сравнения составили 20 детей, не имевших асфиксии при рождении, которые находились на стационарном обследовании и лечении по другим причинам.

Исследование было выборочным. Из него были исключены новорожденные с наличием других заболеваний, помимо асфиксии, которые могли обусловить тяжесть состояния ребенка: полицитемия, гемолитическая и геморрагическая болезни, острая хирургическая патология, требовавшая коррекции в неонатальном периоде, гнойный менингит, пневмония новорожденных, инфекция мочевыводящих путей, врожденные пороки развития (сердца, желудочно-кишечного тракта, почек), аритмии в неонатальном периоде, множественные врожденные пороки развития, хромосомные аномалии. Кроме того, из исследования были исключены младенцы, которые имели конъюгационную желтуху, патологию печени, а также новорожденные от родителей, употреблявших алкоголь, поскольку уровень фермента в сыворотке в этом случае мог быть обусловлен внепочечными причинами [2]. Обследованные группы не содержали детей с гипоксическим поражением миокарда для исключения влияния на показатель ГГТП сердечных причин [1, 2].

Исследование было одобрено комиссией по биоэтике медицинского института Сумского государственного университета и соответствует принципам, изложенным в Хельсинкской декларации (принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия)). От родителей пациентов получено информированное согласие.

Нарушение функции почек диагностировали в случае повышения уровня креатинина крови более 89 мкмоль/л, мочевины крови — более 8 ммоль/л, снижения диуреза менее 1 мл/кг/ч [7]. Диагноз умеренной и тяжелой асфиксии устанавливали в соответствии с Протоколом по первичной реанимации и послереанимационной помощи новорожденным (приказ МОЗ Украины от 08.06.2007 №312).

Диагностическими критериями тяжелой асфиксии при рождении являлись: оценка по шкале Апгар менее 4 баллов в течение первых 5 мин жизни; наличие клинических симптомов поражения ЦНС тяжелой степени, которые возникли в первые 72 часа жизни; признаки нарушения функции еще одного жизненно важного органа или системы (дыхательной, сердечно-сосудистой, мочевыделительной, желудочно-кишечного тракта и т.д.) в течение первых 3 дней жизни; метаболический или смешанный ацидоз (рН<7,0 и/или дефицит оснований (ВЕ) больше 12 ммоль/л) в крови из артерии пуповины.

Диагностическими критериями умеренной асфиксии при рождении служили: оценка состояния новорожденного по шкале Апгар в течение первых 5 минут менее 7 баллов; наличие клинических симптомов умеренного поражения ЦНС, которые возникли в первые 72 часа жизни; признаки транзиторного нарушения функции одного жизненно важного органа или системы (дыхательной, сердечно-сосудистой, мочевыделительной, желудочно-кишечного тракта и т.д.) в течение первых 3 дней жизни; метаболический или смешанный ацидоз (рН<7,15 и/или дефицит оснований (ВЕ) больше 12 ммоль/л) в крови из артерии пуповины. При отсутствии технических возможностей оценить кислотно-щелочной баланс крови новорожденного диагноз асфиксии при рождении основывался на первых трех признаках.

Материалом для исследования была периферическая венозная кровь новорожденных с признаками поражения почек вследствие асфиксии. Кровь брали путем венепункции утром натощак для исключения влияния суточных колебаний и употребления пищи на уровень ферментемии. Кровь забирали на 1–2-е сутки жизни, в конце раннего неонатального периода (7–8-е сутки жизни) и в конце первого месяца жизни (25–30-е сутки). Для исследования использовали периферическую венозную кровь из остатков после лабораторного обследования, необходимого для оценки состояния здоровья детей, которые перенесли асфиксию.

Для определения активности ферментов в моче проводили ее забор в стерильный мочеприемник после туалета наружных половых органов. Для исключения влияния на экскрецию ферментов мочи суточных ритмов исследовали утреннюю порцию мочи, которую собирали между 8 и 10 ч утра.

Активность ГГТП определяли унифицированным методом по «конечной точке» с учетом скорости образования 5-амино-2-нитробензоата при длине волны 405 нм и температуре 37°С на полуавтоматическом фотометре с использованием реактивов фирмы «Ольвекс» (Россия).

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью программ Exel и Statistica 6.0. Использовали методы вариационной статистики, пригодные для медико-биологических исследований [8]. Определяли среднеарифметическое (М), погрешность среднеарифметического (m), доверительный интервал (ДИ). Для повышения диагностической ценности определения уровня ферментов в биологических жидкостях произведен расчет коэффициентов соотношения содержания ГГТП в сыворотке крови и моче у новорожденных. Для оценки наличия связи между переменными использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Поскольку данные не соответствовали нормальному закону распределения, показатель достоверности (р) определяли с помощью критерия Вилкоксона.

Результаты. У обследованных детей группы сравнения показатель ГГТП в сыворотке крови в течение всего первого месяца жизни находился в пределах референтных значений — 0–23 нмоль/(с·л). При этом у 25, 15 и 30% здоровых новорожденных он был нулевым в 1–2, 7–8 и 25–30-е сутки жизни соответственно.

У детей с поражением почек асфиксия вызывает существенное повышение уровня ГГТП в сыворотке крови в первые 24–48 ч после рождения. Концентрация энзима в этот временной промежуток в группах обследованных детей была максимальной за период наблюдения и превышала более чем в 7 раз показатель здоровых детей у новорожденных с поражением почек при умеренной асфиксии и более чем в 17 раз — при тяжелой асфиксии и поражении почек (табл. 1).

Таблица 1. Содержание ГГТП в сыворотке крови доношенных новорожденных (M±m) и доверительный интервал (ДИ), нмоль/(с·л)

В течение раннего неонатального периода отмечалось снижение сывороточного содержания ГГТП в обеих группах детей на 20%, при этом сохранялась статистическая разница в концентрации фермента в сыворотке между группами.

К концу неонатального периода происходило дальнейшее статистически значимое снижение уровня ГГТП в сыворотке, однако его содержание по сравнению со здоровыми младенцами оставалось высоким. При этом у детей с поражением почек вследствие тяжелой асфиксии концентрация ГГТП в 2,5 раза превышала показатель при умеренной асфиксии.

Среди новорожденных группы сравнения содержание ГГТП в моче определялось только у 75% на 1–2-е сутки жизни, у 80% — на 7–8-е сутки жизни и у 85% — к концу неонатального периода. Средний уровень фермента в моче здоровых детей оставался стабильным в течение 1-го месяца жизни.

Максимальная энзимурия у новорожденных с поражением почек вследствие асфиксии отмечалась на 1–2-е сутки жизни в обеих группах (табл. 2). Наиболее высокий показатель был у младенцев, перенесших тяжелую асфиксию. В дальнейшем происходило статистически значимое снижение концентрации фермента в моче у всех детей, при этом сохранялась разница между группами новорожденных с поражением почек вследствие умеренной и тяжелой асфиксии. Следует отметить, что к концу неонатального периода уровень ГГТП в моче обеих обследованных групп младенцев оставался высоким, превышая показатель группы сравнения в 4 и 6 раз при умеренной и тяжелой асфиксии соответственно.

Таблица 2. Содержание ГГТП в моче доношенных новорожденных (M±m) и доверительный интервал (ДИ), нмоль/(с·л)

У новорожденных с поражением почек вследствие умеренной асфиксии в течение первой недели жизни отмечается снижение коэффициентов соотношения уровней ГГТП в сыворотке крови и моче относительно группы сравнения с последующим подъемом на 25–30-е сутки жизни (табл. 3). В то же время для новорожденных с поражением почек вследствие тяжелой асфиксии характерны высокие коэффициенты в течение всего неонатального периода.

Таблица 3. Коэффициенты соотношения содержания ГГТП в сыворотке крови и моче у новорожденных

В обследованных группах детей, как и у здоровых новорожденных, в течение раннего неонатального периода отмечается наличие статистически значимой средней силы положительной корреляции между содержанием ГГТП в сыворотке крови и моче (табл. 4). Достоверная взаимосвязь между этими показателями исчезает у всех младенцев к концу первого месяца жизни.

Таблица 4. Коэффициент корреляции Спирмена содержания ГГТП в сыворотке крови и моче в течение неонатального периода

Обсуждение. Выявление у здоровых новорожденных детей ГГТП в сыворотке крови, вероятнее всего, связано с внепочечными источниками его поступления [1, 2, 9]. Наличие данного энзима в моче здоровых детей объясняется его локализацией в щеточной кайме эпителия канальцев. Вследствие этого в процессе обновления цитоплазматических мембран возможно попадание фермента в мочу [10].

Повышение уровня ГГТП в сыворотке крови является характерной особенностью острого повреждения почек и оксидативного стресса [6, 11]. В ходе исследования нами установлено, что возрастание сывороточной активности ГГТП отмечается достаточно рано у новорожденных с поражением почек на фоне асфиксии. Уже в первые 24–48 ч после рождения для всех новорожденных с асфиксией и поражением почек характерен высокий сывороточный уровень ГГТП, максимальных значений он достигает при тяжелой асфиксии.

Значительная ферментемия связана с высокой скоростью освобождения энзимов из клеток проксимальных почечных канальцев вследствие повреждения клеточной мембраны на фоне ишемии — реперфузии [12]. Учитывая цитозольную локализацию фермента [2, 10], следует понимать, что только значительная деструкция мембраны или гибель клетки будут вызывать повышение его концентрации в сыворотке крови.

Определение активности указанного энзима в сыворотке может не только свидетельствовать о наличии оксидативного стресса, но и характеризовать степень выраженности синдрома цитолиза нефротелия [10]. Результаты данного исследования позволяют утверждать, что синдром цитолиза наиболее выражен у младенцев с поражением почек на фоне тяжелой асфиксии. В динамике неонатального периода отмечается уменьшение его проявлений, однако до нормальных значений уровень ГГТП в сыворотке не снижается даже к концу 1-го месяца жизни.

Таким образом, авторами доказано, что высокий уровень ГГТП в сыворотке является ранним индикатором повреждения эпителия проксимальных почечных канальцев у новорожденных с поражением почек на фоне асфиксии.

Энзимурия также является маркером почечной дисфункции [13]. Поскольку около 2/3 ГГТП локализовано в щеточной кайме проксимальных извитых канальцев нефрона, поражение именно этих отделов сопровождается появлением ферментурии [2, 14]. Приблизительно 1/3 фермента имеет внутриклеточную локализацию в комплексе Гольджи и лизосомах [2, 10], поэтому, на наш взгляд, высокая активность ГГТП в моче может быть проявлением выраженного повреждения эпителиальных клеток почечных канальцев вследствие асфиксии при рождении.

Высокая энзимурия в раннем неонатальном периоде у новорожденных с поражением почек на фоне асфиксии, вероятнее всего, обусловлена ишемией почечной ткани, дисфункцией клеточных мембран и попаданием в мочу ферментов не только щеточной каймы, но и внутриклеточных. К концу неонатального периода содержание ГГТП в моче у новорожденных с асфиксией и поражением почек снижается, и это, по всей видимости, преимущественно связано с сохранением нестабильности щеточной каймы.

ГГТП мочи, кроме того, является ранним маркером повреждения — его уровень повышается уже на 1–2-е сутки. Но в отличие от сывороточного его определение в моче имеет существенное преимущество — неинвазивность, что особенно актуально у новорожденных в критическом состоянии [15, 16]. Поэтому оценка активности ГГТП в моче может использоваться в отделениях интенсивной терапии новорожденных для лабораторного подтверждения поражения почек новорожденных с асфиксией.

Сочетание высокой ферментемии и ферментурии у большинства младенцев с поражением почек вследствие асфиксии связано со значительной дисфункцией как апикальной, так и базальной мембран эпителиоцитов почечных канальцев, что вызывает поступление энзима не только в мочу, но и в сыворотку.

Расчет коэффициентов соотношения ГГТП сыворотки/ГГТП мочи позволяет повысить диагностическую ценность обследования новорожденных (см. табл. 3). Значение коэффициента менее 2,5 в раннем неонатальном периоде, характерное для новорожденных с поражением почек вследствие умеренной асфиксии, по всей вероятности, отражает относительное преобладание энзимурии на фоне структурно-функциональных и метаболических нарушений щеточной каймы эпителия проксимального отдела нефрона. В то же время значение коэффициента более 4,0, характерное для новорожденных с поражением почек на фоне тяжелой асфиксии, является следствием относительно высокой ферментемии из-за нестабильности базальной мембраны канальцевого эпителия.

Наличие достоверной положительной связи между показателями активности ГГТП в сыворотке крови и моче у новорожденных с поражением почек на фоне асфиксии в раннем неонатальном периоде (см. табл. 4) свидетельствует о том, что ГГТП мочи может с большой достоверностью отражать сывороточный уровень фермента у ребенка. При этом уровень ГГТП в моче возрастает раньше появления протеинурии и повышения содержания сывороточного креатинина [17, 18]. Поэтому неинвазивному определению уровня ГГТП в моче следует отдавать предпочтение при диагностике поражения почек у новорожденных с асфиксией. Метод может использоваться как скрининговый, поскольку исследование является простым, недорогим, воспроизводимым.

Заключение. Неинвазивное определение уровня ГГТП в моче в раннем неонатальном периоде — предпочтительный метод для скрининга поражения почек у новорожденных с асфиксией. Повышение сывороточной активности ГГТП служит маркером, позволяющим оценить выраженность синдрома цитолиза эпителия проксимальных почечных канальцев у новорожденных с поражением почек на фоне асфиксии.

Финансирование исследования. Работа проведена на личные средства авторов.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.