Метод диагностики онкологических заболеваний на основе анализа изображений хромато-масс-спектрограмм летучих метаболитов мочи

А.А. Роженцов, А.В. Коптина, А.А. Митраков, Т. Шарипова, И. Цапаев, В.Л. Рыжков, К.А. Лычагин, Р.Р. Фурина, Н.Н. Митракова

Ключевые слова: летучие метаболиты мочи; онкомаркеры; хромато-масс-спектрометрия; метаболический профиль мочи.

Цель исследования — разработка метода ранней диагностики рака на основе анализа изображений хромато-масс-спектрограмм летучих метаболитов, содержащихся в моче, и оценка его эффективности.

Материалы и методы. Сформированы несколько групп пациентов по нозологическим типам: рак легкого, рак пищевода, рак желудка, рак толстой кишки, а также контрольная группа, состоящая из здоровых лиц. Исследование метаболических профилей онкологических заболеваний проводилось с использованием газовой хроматографии с последующим масс-спектрометрическим детектированием.

Результаты. По данным обработки изображений хромато-масс-спектрограмм летучих метаболитов мочи каждого из пациентов получены эталонные метаболические профили онкологических заболеваний. Предложенный метод выявления раковых заболеваний отличается простотой, неинвазивностью, низкой трудоемкостью и приемлемой стоимостью. Согласно оценке полученных результатов, чувствительность метода составляет 100%, специфичность — 90,62%, вероятность ошибок первого рода — 0, вероятность ошибок второго рода — 9,38%.

Заключение. Полученные результаты могут послужить основой для проведения исследований в области диагностики разных форм онкологических заболеваний.

Ранняя диагностика является необходимым условием успешного лечения онкологических заболеваний [1]. В настоящее время существует большое количество подходов к решению данной проблемы, однако проведение массовых обследований на их основе не всегда возможно из-за недостаточной доступности квалифицированной медицинской помощи, материальных и организационных проблем, низкой пропускной способности используемого оборудования [2–5]. В связи с этим разработка способа диагностики онкологических заболеваний, обладающего низкой трудоемкостью, не требующего значительных материальных затрат на проведение анализа, обеспечивающего возможность массовых обследований населения, остается актуальной задачей.

Одним из подходов может служить составление метаболических профилей онкологических заболеваний [6–8]. Наиболее доступным источником информации о метаболизме человека является моча, в частности ее летучие фракции [9–12]. Забор и анализ мочи — стандартная процедура при диспансеризации населения, поэтому выполнение дополнительного анализа не должно представлять организационных сложностей. Таким образом, построение метаболических профилей онкологических заболеваний на основе данных анализа летучих метаболитов, содержащихся в моче, представляет научный интерес.

Материалы и методы. Для выявления метаболических профилей онкологических заболеваний были сформированы группы пациентов с клинически подтвержденными формами рака, в том числе рака желудка (n=12), рака легкого (n=14), рака кишечника (n=8), рака пищевода (n=12). Выбор именно этих форм онкопатологии обусловлен тем, что в российской статистике смертности они занимают лидирующие позиции: рак легких — 18,5%, желудка — 13,5% и толстой кишки — 12,7% [1]. Кроме того, была сформирована контрольная группа клинически здоровых людей (n=35).

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией, принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия)) и одобрено Этическим комитетом Поволжского государственного технологического университета. От каждого пациента получено информированное согласие.

Анализ состава летучих метаболитов мочи проводили методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Для подготовки пробы использовали метод твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ), при котором забор летучих метаболитов осуществляется с помощью специального волокна, входящего в состав шприца (рис. 1).

Рис. 1. Шприц для ТФМЭ-метода

Перед каждым экспериментом для удаления остатков предыдущих проб из шприца игла конденсируется. Для этого ее помещают в испаритель с температурой 250°С и задают следующий режим работы хроматографа: температура колонки — 250°С; поток газа-носителя гелия через колонку — 1 мл/мин; температура испарителя — 250°С.

Через 5 мин конденсирования волокно втягивается в иглу и шприц извлекается. Затем в специальный герметичный и стерилизованный пузырек набирается 15 мл мочи пациента. Для лучшего выделения летучих фракций мочи в образец последовательно добавляется 250 мкл концентрированной соляной кислоты и 0,8 г соли NaCl. Полученный раствор сбалтывается таким образом, чтобы соль полностью растворилась, но без образования пены. После этого пузырек помещается в ванну термостата с температурой 48°С. Далее ТФМЭ-волокно помещается в пузырек над образцом мочи и в течение 15 мин в нем происходит адсорбция летучих веществ. Затем волокно втягивается в иглу, извлекается из пузырька и помещается в испаритель хроматографа, где происходит десорбция летучих веществ и разделение их на компоненты. В масс-спектрометрическом детекторе компоненты разделяются на ионы и регистрируются, образуя масс-спектр. Через 6 мин после включения режима исследования шприц извлекается из испарителя. Через 75 мин процесс анализа завершается и формируется хромато-масс-спектрограмма, представляющая собой развертку во времени сигнала с выхода масс-спектрометрического детектора. На рис. 2 представлен пример изображений хромато-масс-спектрограмм. Уровень сигнала на выходе детектора кодируется яркостью изображения.

Рис. 2. Изображения 3D-спектрограмм: а — контрольная группа; б — колоректальный рак

Стандартной процедурой обработки хромато-масс-спектрограмм является идентификация веществ, соответствующих выделенным в хроматограмме пикам, путем сопоставления полученных и эталонных масс-спектров. Из полученного перечня исключались вещества, выделяющиеся с поверхности колонки и других узлов хроматографа (табл. 1).

Таблица 1. Перечень исключаемых веществ

Эталонные масс-спектры берутся из библиотек масс-спектральных данных NIST 02, NIST 05, WILEY и др., которые подключаются к программам, как правило, входящим в состав масс-спектрометрического оборудования.

Далее определялась частота выявления каждого метаболита в различных группах и формировались их метаболические профили. Для этого выделялись те метаболиты, количество которых более чем на 20% выше в одной группе по сравнению с любой другой группой. После проведения данной процедуры были выявлены метаболические профили для каждого заболевания и для контрольной группы, представленные в табл. 2.

Таблица 2. Метаболические профили различных групп

Расшифровка хромато-масс-спектрометрических данных может сопровождаться ошибками, обусловленными неточностью выделения хроматографических пиков, ошибками идентификации веществ по масс-спектрам, неполнотой используемых библиотек и т.п. В связи с этим была рассмотрена возможность формирования метаболических профилей онкологических заболеваний непосредственно по изображениям хромато-масс-спектрограмм летучих метаболитов мочи.

Процедура формирования изображений хромато-масс-спектрограмм, соответствующих метаболическим профилям различных онкологических заболеваний, состоит из нескольких этапов. Исходное изображение хромато-масс-спектрограммы содержит помимо полезной информации и значительную долю помех, обусловленных попаданием в детектор материалов внутреннего покрытия колонки, наличием примесей в газе-носителе и т.п. На изображении они проявляются в виде горизонтальных линий, наблюдаемых на всем протяжении хромато-масс-спектрограммы (см. рис. 2). Кроме того, возможен дрейф базовой линии хроматограммы, что может проявляться в виде изменения средней яркости изображения с течением времени. Для устранения указанных помех на первом этапе выполняется фильтрация изображения горизонтальным стробом, удаляющим постоянную составляющую вдоль строки изображения. Значения яркости фоновых отсчетов в результирующем изображении определяются по формуле, предложенной авторами:

где J_x_,_y — яркость пикселя исходного изображения спектрограммы с координатами x, y; s — размер апертуры фильтра; — яркость пикселя обработанного изображения спектрограммы с координатами x, y.

На рис. 3 приведен пример обработки изображения хромато-масс-спектрограммы.

Рис. 3. Пример удаления помех из изображения хромато-масс-спектрограммы: а — исходное изображение; б — изображение после удаления помех

На следующем этапе с целью выявления наиболее характерных для данного пациента метаболитов проводится пороговая обработка полученного изображения. Как показывает анализ гистограммы яркости (рис. 4), бóльшая часть фоновых отсчетов в изображении хромато-масс-спектрограммы сосредоточена в диапазоне яркостей от 0 до 50, поэтому порог отсечения по яркости был выбран равным 50. На рис. 5 приведен пример пороговой обработки изображения, представленного на рис. 3, б.

Рис. 4. Пример гистограммы яркости обработанного изображения хромато-масс-спектрограммы. По оси ординат использован логарифмический масштаб

Рис. 5. Пример пороговой обработки изображения хромато-масс-спектрограммы

Для формирования метаболического профиля определенной формы онкологического заболевания в соответствии с приведенной методикой обрабатываются все изображения хромато-масс-спектрограмм пациентов, принадлежащих к той или иной группе больных, а также здоровых людей из контрольной группы. Далее формируются групповые изображения, содержащие информацию обо всех метаболитах, присутствующих у пациентов данной группы. Для этого выполняется операция логического ИЛИ между всеми изображениями данной группы. На рис. 6 приведены примеры подобных изображений для людей из контрольной группы, пациентов с раком легкого, пищевода, желудка и кишечника.

Рис. 6. Групповые изображения метаболитов: а — контрольная группа; б — рак кишечника; в — рак легкого; г — рак пищевода; д — рак желудка

На следующем этапе обработки в каждом изображении выявляются уникальные элементы и формируются эталонные изображения метаболических профилей в соответствии с правилом:

где — яркость пикселя в эталонном метаболическом профиле m-го заболевания, — яркость пикселя обработанного изображения спектрограммы n-го заболевания с координатами x, y. Таким образом, в результирующее изображение данной группы пациентов попадают только те метаболиты, которые не встречаются в изображениях других групп. На рис. 7 приведены результаты формирования изображений хромато-масс-спектрограмм эталонных метаболических профилей.

Рис. 7. Эталонные изображения метаболических профилей: а — контрольная группа; б — рак кишечника; в — рак легкого; г — рак пищевода; д — рак желудка

Результаты. Для оценки возможности идентификации различных форм рака по данным исследования состава летучих метаболитов мочи был проведен эксперимент, в ходе которого статистическими методами анализировалась эффективность распознавания различных форм онкологических заболеваний. Для этого выполняли сравнительный анализ изображения хромато-масс-спектрограммы каждого из пациентов с изображениями эталонных хромато-масс-спектрограмм (см. рис. 7). В качестве результата распознавания принимали эталон, для которого была получена наибольшая мера сходства. После обработки всей выборки оценивали вероятности правильных и ошибочных решений (табл. 3).

Таблица 3. Оценка эффективности диагностики

Согласно оценке полученных результатов, чувствительность метода на рассмотренной выборке составляет 100%, специфичность — 90,62%, вероятность ошибок первого рода — 0, вероятность ошибок второго рода — 9,38%.

Обсуждение. В настоящее время наиболее известными и распространенными подходами к решению проблемы ранней диагностики онкологических заболеваний на уровне скрининга являются следующие.

1. Использование методов лучевой диагностики, включающих в себя классические рентгенологические исследования, ультразвуковое исследование, томографические исследования (компьютерная, магнитно-резонансная, позитронно-эмиссионная томография), радиоизотопные (радионуклидные) исследования. Диагностическая ценность этих методов весьма высока, однако их использование требует привлечения высококвалифицированного медицинского и технического персонала, применения дорогостоящей диагностической аппаратуры, имеющей ограниченную пропускную способность. Поэтому использование этих методов для проведения скрининговых обследований населения в настоящее время не всегда целесообразно.

2. Эндоскопические исследования. Они проводятся преимущественно для обнаружения онкологических заболеваний, поражающих слизистые оболочки органов, к которым имеется доступ через естественные пути. Это ограничивает область применения данных методов.

3. Технологии метаболического профилирования. Эти технологии базируются на изменении метаболизма человека при возникновении онкологических заболеваний. Для анализа состава метаболитов применяются различные методы, в том числе магнитно-резонансная спектроскопия (MРС), ядерный магнитный резонанс — ЯМР (в основном 1Н ЯМР), Фурье-ионный циклотронный резонанс масс-спектрометрии и другие методы масс-спектрометрии, которые часто сочетаются с методами разделения — жидкостной хроматографией и газовой хроматографией. MРС может использоваться как дополнение к МРТ и позволяет обнаруживать специфические метаболиты в естественных условиях. Главное преимущество MРС — ее способность обнаруживать и количественно определять тканеспецифические метаболиты, недостатками служат низкая чувствительность и низкое спектральное разрешение.

Из всех перечисленных методов масс-спектрометрия является самым чувствительным методом, что делает перспективным ее применение в клинической практике.

Кроме выбора оптимальных методов чрезвычайно важной составляющей в диагностике различных форм онкологических заболеваний служит используемый материал. В этом плане интерес представляют следующие технологии.

1. Анализ состава выдыхаемого воздуха. Большое количество работ в данном направлении принадлежит коллективу под руководством M. Phillips [7, 8]. Ими разработана «индикаторная трубка» для автоматизированного анализа дыхания и обнаружения летучих органических соединений для различных видов рака. Наилучшие результаты получены ими при диагностике рака легких (84,5% — чувствительность и 81,0% — специфичность), однако по другим формам рака подобная информация отсутствует, что позволяет сделать предположения о недостаточной эффективности метода в этих случаях. Также отмечается необходимость разработки эффективных стандартизированных методик пробоподготовки.

2. Анализ состава тканей. Данный подход базируется на изменении химического состава тканей при возникновении патологий. Показана возможность диагностики рака пищевода, рака желудка, опухолей яичников, злокачественных и доброкачественных опухолей молочной железы. В качестве общего недостатка данного метода можно отметить необходимость проведения инвазивных процедур забора проб, сложность пробоподготовки перед проведением анализа.

3. Анализ состава крови. В отличие от анализа состава тканей, анализ крови имеет преимущества в плане получения образцов. В то же время образцы чувствительны к изменению температуры, pH, ионной концентрации и т.д. Недостатком данного подхода является сложность пробоподготовки и значительная зависимость получаемых результатов от условий проведения эксперимента. Отсутствует информация о возможности различения широкого спектра онкологических заболеваний.

Указанных недостатков лишен метод иммуноферментного анализа крови, однако стоимость комплексного исследования нескольких видов онкозаболеваний является достаточно высокой.

4. Анализ состава мочи. Известны работы по применению газовой хромато-масс-спектрометрии для обнаружения рака мочевого пузыря, груди, яичников, шейки матки, почки, гепатоцеллюлярной карциномы. Большинство исследований касаются различения только отдельных групп рака, для ряда из них получены хорошие диагностические результаты. В то же время вопросы выделения одного из нескольких видов рака в указанных работах не рассматривались и эффективность предложенных подходов для таких случаев не исследовалась.

Предложенная нами технология определения онкомаркеров на основе анализа состава летучих метаболитов мочи лишена всех вышеперечисленных недостатков. Высокая чувствительность метода, простота, неинвазивность, низкая трудоемкость и приемлемая стоимость делают его пригодным для скрининговых обследований населения.

Заключение. Предложенный метод выявления раковых заболеваний на основе анализа изображений хромато-масс-спектрограмм летучих метаболитов мочи отличается высокой эффективностью. Чувствительность метода — 100%, специфичность — 90,62%.

Полученные результаты могут послужить основой для проведения исследований в области диагностики разных форм онкологических заболеваний, а также использоваться в клинической практике для первичной диагностики онкологических заболеваний.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Благодарность. Авторы выражают благодарность предприятию ЗАО СКБ «Хроматэк» за предоставленное оборудование и помощь при проведении исследований.