Диагностическое значение определения концентрации нейротрофических факторов и нейронспецифической енолазы в крови новорожденных с нарушениями ЦНС

Своевременная диагностика и лечение судорожных состояний остается важной проблемой перинатальной неврологии и неонатологии. Частота судорог в популяции новорожденных составляет 0,5–6%, у недоношенных — 8–12%, у детей с экстремально низкой массой тела — до 20% [1]. У новорожденных, особенно у недоношенных, отмечается достаточно ограниченный набор неврологической симптоматики, во многом клинические проявления при различных патологических состояниях имеют схожие симптомы. При этом судороги — наиболее яркий, клинически очерченный и нередко определяющий симптом, указывающий на дисфункцию и поражение центральной нервной системы (ЦНС) ребенка [2]. Это обусловливает необходимость глубокого анализа клинических показателей у новорожденных с обязательной оценкой данных, полученных при использовании современных методов исследования ЦНС, включая видео-ЭЭГ-мониторинг, нейросонографию (НСГ), компьютерную томографию (КТ) и магнитно-резонансную томографию (МРТ) головного мозга. Однако у этих детей не всегда возможно объективно оценить состояние ЦНС, так как тяжесть поражения часто не соответствует клинической симптоматике, особенно у недоношенных, а необходимость соблюдения щадящего режима делает невозможным проведение функциональной диагностики. Поэтому так важна разработка диагностических методов, основанных на результатах лабораторных исследований. Чрезвычайно перспективным направлением в ранней диагностике церебральных повреждений является иммунохимическое определение нейроспецифических белков в различных биологических жидкостях (кровь, ликвор). Эти белки тканеспецифичны для нервной системы и гистогенетически являются продуктами жизнедеятельности нейроэпителиальной ткани, т.е. нейронов и глиальных клеток. Любой патологический процесс в головном мозге неизбежно приводит к структурным повреждениям нервной ткани и нарушению функциональной целостности гематоэнцефалического барьера, что сопровождается выходом нейроспецифических белков в ликвор, а затем — в кровь. Наиболее сущест­венное преимущество иммунохимического определения данных белков в биологических жидкостях — высокая чувствительность, диагностическая точность и малые количества (0,2–0,5 мкл) требуемого для исследований материала [3, 4].

К нейроспецифическим белкам, имеющим ключевое значение для функционирования головного мозга, относят нейронспецифическую енолазу (NSE), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и глиальный нейротрофический фактор (GDNF).

BDNF — это важная сигнальная молекула, участвующая в регуляции нейрогенеза, роста и выживаемости нейронов в ЦНС. Этот фактор играет важную роль при ишемических и нейродегенеративных заболеваниях, а также принимает участие в защитных механизмах нерв­ной ткани при ишемическом повреждении [5].

Представитель семейства трансформирующего фактора роста бета нейротрофический фактор GDNF секретируется клетками глии (астроциты, шванновские клетки) и способствует сохранению, пролиферации и дифференцировке различных популяций клеток центральной и периферической нервной системы [6, 7]. Выявлено, что при повреждении нервной системы уровень мРНК GDNF быстро возрастает и остается повышенным в течение недели после травмы [8].

NSE — изоформа фермента енолазы, необходимого для осуществления гликолиза. В настоящее время NSE рассматривается как один из наиболее специфичных маркеров повреждения нейронов и служит индикатором для выявления степени дифференцированности ЦНС (NSE обнаруживается на относительно поздних стадиях нейрональной дифференцировки, с началом синаптогенеза, т.е. после 22-й недели беременности). Это специфический сывороточный маркер нейроэндокринных опухолей и разрушения нервной ткани [9]. Уровень NSE повышен при ишемическом повреждении и травме мозга, эпилепсии, субарахноидальном кровоизлиянии и является неблагоприятным прогностическим фактором неврологического дефицита [10].

Цель исследования — оценить диагностическое значение содержания нейротрофического фактора мозга, глиального нейротрофического фактора и нейронспецифической енолазы в сыворотке крови у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением центральной нервной системы.

Материалы и методы. Обследовано 17 новорожденных с гестационным возрастом от 31 до 42 нед. В основную группу вошли 10 детей (мальчиков — 7, девочек — 3) с минимальной массой тела при рождении — 1290 г, находившихся на стационарном лечении в Детской городской клинической больнице №1 Нижнего Новгорода. Все новорожденные имели признаки тяжелого перинатального поражения ЦНС, которое было диагностировано на основании осмотра, оценки динамики неврологического статуса и данных нейросонографического обследования.

В ходе наблюдения дети были разделены на две группы: в 1-ю включены дети с неонатальными судорогами гипоксического генеза (n=5), во 2-ю — с тяжелым постгипоксическим поражением нервной системы с формированием атрофических процессов в головном мозге без судорожных проявлений (n=5).

Пробы крови для определения сывороточной концентрации BDNF, GDNF и фермента NSE брали не позднее 72 ч после возникновения судорог и через 10–14 дней от начала лечения. Полученную плазму в объеме 0,5 мл замораживали и хранили при температуре –20°С не более 2 мес. Содержание белков BDNF, GDNF определяли методом иммуноферментного анализа с использованием реактивов ф. R&D Systems (США), детектирование фермента NSE проводили с использованием реактивов ф. «Вектор Бест» (Россия).

Оценку нервно-психического статуса новорожденных выполняли по шкале NACS, включающей определение 5 областей: способность к адаптации, пассивный тонус, активный тонус, безусловные рефлексы и общее состояние. Тест состоит из 20 пунктов, каждый из которых оценивается от 0 до 2 баллов. Значение 35–40 баллов присуще типичному соматически здоровому новорожденному.

Из данных анамнеза известно, что все дети были рождены матерями с отягощенным течением беременности и родов. Чаще всего встречались следующие факторы риска: угроза выкидыша на ранних сроках беременности, признаки гестоза и недостаточности маточно-плацентарного кровообращения, длительный безводный период, стимуляция родовой деятельности. При рождении состояние всех детей расценивалось как тяжелое или средней тяжести. Оценка по шкале Апгар на первой минуте жизни составляла 1–3 балла у 10% новорожденных, 4–7 баллов — у 70%, 7–9 баллов — у 20%. Всем детям, родившимся в тяжелом состоянии, проводился комплекс первичных реанимационных мероприятий в условиях родильного дома.

Контрольная группа была представлена 7 доношенными детьми без поражения ЦНС. Взятие проб крови у детей контрольной группы осуществляли при проведении необходимых анализов в стационаре по показаниям.

Исследование выполнено в соответствии с Хель­синкской декларацией (принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия)) и одобрено Этическим комитетом НижГМА. От родителей пациентов получено информированное согласие.

Достоверность различий между экспериментальными группами определяли с помощью пакета программ ANOVA. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты. При первичной оценке нервно-психического статуса новорожденного по шкале NACS у большинства зарегистрированы достаточно низкие показатели (в среднем 23,2 балла). Однако на фоне лечения и адаптации ребенка данный показатель увеличился до 30,125 балла.

У детей 1-й группы судороги возникли в первые двое суток жизни. По своему характеру это были фокальные клонические или генерализованные тонические судороги. Продолжение судорог отмечено у 60% детей. Для быстрого купирования судорожного приступа применялось парентеральное введение диазепама из расчета 0,25–0,5 мг/кг массы тела. В дальнейшем при повторном возникновении судорог назначался фенобарбитал для перорального применения в начальной дозе 10 мг/кг в сутки в два приема и поддерживающей дозе 5 мг/кг в сутки (также двукратный прием). На фоне лечения судороги купировались у всех пациентов. Кроме того, проводили необходимую симптоматическую терапию и лечение, направленное на улучшение обменных процессов в головном мозге.

По результатам НСГ у всех детей 1-й группы диагностированы постгипоксические изменения. При записи ЭЭГ эпилептиформная активность не регистрировалась.

Все дети из 2-й группы были рождены в тяжелом состоянии, потребовавшем проведения реанимационных мероприятий и в дальнейшем — искусcтвенной вентиляции легких. По результатам НСГ и КТ головного мозга были диагностированы признаки развития атрофических процессов в головном мозге: перивентрикулярная лейкомаляция, увеличение размеров желудочков и субарахноидального пространства. Тяжелый неврологический дефицит в ходе наблюдения сформировался у 40% детей из этой группы, у остальных — умеренная задержка нервно-психического развития.

При изучении концентрации нейротрофических факторов BDNF, GDNF и фермента NSE в плазме крови новорожденных с неонатальными судорогами через 10–14 дней от начала лечения получены следующие результаты. Отмечено статистически значимое (р<0,01) увеличение концентрации NSE: по сравнению с контрольной группой данный показатель превышал свои значения практически в 2 раза (23,75±5,49 и 10,12±1,27 нг/мл соответст­венно) (см. рисунок). Во 2-й группе наблюдалась тенденция к увеличению концентрации плазматической фракции фермента.

Динамика концентрации нейротрофических факторов BDNF и GDNF и нейронспецифической енолазы NSE в плазме крови новорожденных детей с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС: а — NSE, * — статистическая значимость различий значений с контрольной группой (p<0,01), ANOVA; б — BDNF (разведение плазмы крови 1:10), * — статистическая значимость различий значений с контрольной группой (р<0,05), ANOVA; в — GDNF, * — статистическая значимость различий значений с контрольной группой (p<0,01), ANOVA

В 1-й группе больных отмечена прямая корреляция между концентрацией NSE и сроком гестации (r=0,58). Поскольку значение концентрации в плазме крови связано со степенью повреждения ткани мозга, можно предположить, что большее количество поврежденных клеток головного мозга при гипоксических нарушениях будет наблюдаться у детей на более позд­них сроках гестации. В последние недели беременности идет дифференцировка и активное развитие головного мозга, формируется большое количество нейронных связей, масса мозга увеличивается, закладываются извилины. Однако известно, что дифференцированные нейроны со сформированными контактами более подвержены действию стресс-факторов [11]. В связи с этим гипоксические состояния на более поздних сроках гестации затрагивают большее число нейронов. При этом необходимо учитывать, что головной мозг новорожденных более позднего срока развития имеет огромный репарационный запас и возможности к адаптации организма. При оценке неврологического статуса по шкале NACS установлено, что значениям менее 20 баллов соответствуют высокие показатели NSE (27–37 нг/мл), а при оценке более 20 баллов концентрация NSE была статистически значимо (р<0,05) снижена (11–20 нг/л). Эти результаты свидетельствуют о повреждении большого числа нейронов при тяжелой гипоксии.

После проведенного курса лечения средний уровень NSE в основных группах статистически значимо не изменился (концентрация NSE в плазме крови после лечения в 1-й группе — 29,75±5,15 нг/мл, во 2-й группе — 11,56±1,83 нг/мл). Полученные данные свидетельствуют о длительном и глубоком повреждающем действии неонатальных судорог и гипоксии на нерв­ную систему новорожденного ребенка. Кроме того, увеличение NSE через 10–14 дней от начала курса лечения говорит о том, что гипоксия и судорожные состояния запускают необратимые процессы в клетках нервной системы, провоцирующие гибель нейронов в отдаленном периоде.

Исследование концентрации нейротрофического фактора BDNF в плазме крови показало, что в обеих группах больных через 10–14 дней от начала лечения наблюдается выраженная тенденция к увеличению данного показателя (р<0,05): в 1-й группе оно составило 36,87%, во 2-й — 22,01%.

Данный эффект на фоне применения противосудорожных препаратов может рассматриваться как приспособительная реакция организма на действие стресса. Поскольку основной фармакологической мишенью противосудорожных препаратов является увеличение активности GABA-сигнальной системы (ГАМК-системы), повышение показателей BDNF говорит о компенсаторной реакции организма на введение веществ, регулирующих активность GABA-рецепторов. Согласно данным литературы [11, 12], BDNF опосредованно, через тирозинкиназный рецептор В-типа способен влиять на эндоцитоз GABA-рецепторов, тем самым контролируя количество данного типа рецептора на плазматической мембране клетки.

Особый интерес представляет обнаруженная взаимосвязь между концентрацией BDNF в плазме крови и неврологическим статусом больного после курса лечения (r=–0,81). Она свидетельствует о прогностическом значении данного показателя. При этом концентрация NSE (основного биохимического показателя нарушений ЦНС) в начале терапии никак не связана с успешностью лечебных мероприятий и изменением неврологического статуса больных. Обнаруженная зависимость указывает на диагностическое значение определения концентрации BDNF у детей с тяжелыми нарушениями ЦНС. Неблагоприятным прогностическим признаком является исходное повышение BDNF до уровня свыше 4000 пг/мл (разведение плазмы крови — 1:10 при определении концентрации BDNF). Подобное увеличение может рассматриваться как декомпенсаторная реакция. Именно у таких больных установлена неэффективность применяемой терапии и фиксируется нарастание неврологических нарушений.

Концентрация GDNF в плазме крови у детей обеих основных групп до лечения, напротив, была несколько ниже, чем у детей контрольной группы, что может быть обусловлено угнетением процессов роста нерв­ной ткани после перенесенной тяжелой гипоксии: в контрольной группе она составила 9,55±0,66 пг/мл, в группе с судорогами — 7,09±0,70 пг/мл, во 2-й группе — 6,43± 0,63 пг/мл.

Проведенное исследование позволило обнаружить достоверную корреляционную зависимость между концентрациями нейротрофических факторов (r=–0,65) в плазме крови новорожденных контрольной группы (см. таблицу). В 1-й и 2-й основных группах отмечена более высокая корреляционная связь нейротрофических факторов (в 1-й группе r=–0,91, во 2-й r=–0,90), которая после проведения курса лечения снижалась за счет увеличения концентрации BDNF (в 1-й группе r=–0,52, во 2-й корреляционная связь теряется, r=–0,07). Полученные данные полностью подтверждаются экспериментальными работами по исследованию роли нейротрофических факторов BDNF и GDNF в защите нейронных сетей диссоциированных культур клеток гиппокампа от гипоксического повреждения [13]. Каждый из нейротрофических факторов обладает выраженным нейропротективным эффектом, однако совместное их применение, напротив, снижает положительную роль каждого из нейротрофинов.

Коэффициент корреляции между концентрациями нейротрофических факторов BDNF, GDNF в плазме крови новорожденных

Усиление отрицательной корреляционной зависимости между концентрациями нейротрофических факторов при развитии судорожных состояний свидетельствует о том, что в условиях стресса внутриклеточные метаболические каскады, активируемые BDNF и GDNF, разнонаправлены. Снижение коэффициента корреляции после применения терапии, вероятнее всего, обусловлено активацией синтеза BDNF при использовании противосудорожных препаратов.

Обсуждение. Исследования последних лет доказали исключительную роль нейротрофических факторов не только в процессе пренатального нейрогенеза, но и в постнатальный период. Сигнальные пути, активируемые нейротрофическим фактором головного мозга и глиальным нейротрофическим фактором, различны, но направлены на повышение выживаемости нейронов при стрессе и снижении воспалительных реакций.

Проведенные нами исследования показали, что как противосудорожная, так и нейрометаболическая терапия приводят к повышению концентрации BDNF в плазме крови. Этот фактор играет важную роль в формировании адаптивных реакций организма при действии тяжелой перинатальной гипоксии. Основной молекулярной мишенью BDNF является тирозинкиназный рецептор В-типа (TrkB). В результате взаимодейст­вия зрелой молекулы BDNF и рецептора запускаются внутриклеточные сигнальные механизмы, приводящие к росту аксонов и дендритов, повышению выживаемости клеток, пластичности нейронов, транскрипции самого нейротрофического фактора. В соответствии с локализацией TrkB-рецептора в аксональных терминалях и дендритных шипиках BDNF влияет на пресинаптическую и постсинаптическую передачи сигнала [14]. Недавние исследования [11, 15] показали, что существует положительная обратная связь между GABA-ергической системой и уровнем синтеза BDNF. Вход Са²⁺ в клетку после активации GABA-рецепторов стимулирует высвобождение BDNF и его связывание с TrkB-рецептором с последующим запуском фосфоинозитол-3 и протеинкиназа-С сигнальных путей, в результате которых уровень экспрессии GABAА-рецепторов заметно повышается. При запуске сигнальных каскадов BDNF снижает эндоцитоз GABAА-рецепторов, тем самым повышая их количество на поверхности клетки, что приводит к увеличению чувствительности развивающихся нейронов к GABA [11, 15].

Таким образом, повышение концентрации BDNF может рассматриваться, с одной стороны, как компенсаторная реакция организма на действие тяжелой хронической гипоксии, а с другой стороны, может служить одним из звеньев метаболического ответа на применение препаратов, влияющих на синаптическую передачу. Особый интерес представляют данные о корреляционной зависимости между концентрацией BDNF и GDNF. Согласно устоявшейся концепции [11, 15], оба нейротрофических фактора играют ключевую роль в дифференцировке нейронов и развитии полноценных синаптических контактов. Методически данный фундаментальный подход реализуется в методах дифференцировки и пролиферации нейрональных прогенеторов, в том числе индуцированных плюрипотентных клеток [16]. Однако экспериментальные исследования [17] показали, что эффекты, оказываемые BDNF и GDNF, носят разнонаправленный характер, а совместное использование нейротрофических факторов снижает эффективность их применения.

Заключение. Нейронспецифическая енолаза является наиболее ярким маркером повреждения нервной ткани. Высокий уровень данного фермента отмечается у детей, перенесших неонатальные судороги, что свидетельствует о выраженном повреждающем дейст­вии судорог на нервную систему новорожденного. Концентрация NSE коррелирует с неврологическим статусом больных и у 62,5% пациентов продолжает нарастать даже после курса лечения, что может свидетельствовать о продолжающемся разрушении нейронов. Концентрация BDNF в плазме крови новорожденных с тяжелыми нарушениями ЦНС после терапии также достоверно увеличивается. Доказательством диагностической роли определения BDNF служит обнаруженная корреляция между исходным уровнем данного нейротрофина и состоянием больного (оценка неврологического статуса) после лечения. Достоверных изменений в концентрации GDNF в плазме крови новорожденных с тяжелыми нарушениями ЦНС не установлено.

Таким образом, наибольшей диагностической значимостью для оценки тяжести поражения головного мозга на этапе раннего неонатального периода обладают концентрации NSE и BDNF, что позволяет использовать данные маркеры сразу после рождения, еще до развития неврологической симптоматики.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках проекта Федеральной целевой программы «Уникальная научная установка для исследования информационных процессов в головном мозге с использованием методов оптогенетики»; уникальный идентификатор проекта RFMEFI59114X0004, соглашение о предоставлении субсидии от 01.12.2014 №14.591.21.0004 между Министерством образования и науки РФ и ННГУ с использованием оборудования — уникальной научной установки.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.