Исследование процессов синтеза, накопления и выброса предсердного и мозгового натрийуретических пептидов при экспериментальной вазоренальной гипертензии

Предсердный (ПНП) и мозговой (МНП) натрийуретические пептиды входят в группу гормонов, участвующих в регуляции водно-солевого баланса и гемодинамики. Действие их направлено на снижение артериального давления (АД) [1–6]. При различных сердечно-сосудистых патологиях, сопровождающихся повышенным АД, высокие концентрации натрийуретических пептидов не обеспечивают гипотензивный эффект. Предполагают [7], что одной из причин артериальной гипертензии служит недостаточный синтез ПНП и МНП: происходит повышение их концентрации в плазме крови и снижение — в предсердиях. Другой причиной неэффективности натрийуретических пептидов считают снижение плотности рецепторов А- и В-типа на поверхности органов-мишеней и нарушение связи с гуанилатциклазой [8]. Существует еще версия об увеличении количества рецепторов С-типа, активация которых приводит к ферментативному разрушению ПНП и МНП нейтральной эндопептидазой [9]. Такая неоднозначность в гипотезах может быть связана с разными методологическими подходами: одни исследователи изучают плазму с помощью иммуноферментного анализа [10], другие используют блот-анализ миокарда [11], третьи — морфометрию гранул предсердных миоцитов [12]. Сочетание методов электронной микроскопии, иммуноцитохимии с количественным анализом разных типов гранул секреторных кардиомиоцитов (КМЦ) и контролем уровня АД позволяет объяснить процессы, происходящие в организме крыс при моделировании патологических состояний [13].

Одной из распространенных патологий сердечно-сосудистой системы является вазоренальная гипертензия, развивающаяся вследствие ишемического повреждения почек. Как правило, при естественном течении болезни и отсутствии соответствующего лечения около 70% больных погибают в течение ближайших 5 лет от осложнений (инсульт головного мозга, инфаркт миокарда, почечная недостаточность) [14–16]. Для моделирования вазоренальной гипертензии при изучении ее патогенеза используют перевязку почечной артерии [17, 18]. Ранее в наших работах на данной модели [19] показано, что к 30-м суткам развивается стойкая артериальная гипертензия. При повышенном АД обнаружены снижение синтеза и увеличение выброса натрийуретических пептидов в предсердных миоцитах крыс в изучаемые сроки. Интерпретация полученных результатов может быть неоднозначна, так как сущест­вует предположение [20], что сами натрийуретические пептиды служат регуляторным звеном формирования гипертонической болезни. В связи с этим для понимания процессов патогенеза вазоренальной гипертензии необходимо исследование динамики изменений, происходящих в организме в более отдаленный период эксперимента (60 сут).

Цель исследования — изучить динамику процессов синтеза, накопления и выброса предсердного и мозгового натрийуретических пептидов крыс на 60-е сутки экспериментальной вазоренальной гипертензии с применением морфометрии гранул секреторных кардиомиоцитов.

Материалы и методы. Исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики на 15 нелинейных крысах-самцах массой 180–220 г. Работа выполнена в полном соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Вазоренальную гипертензию изучали на двупочечной модели с перевязкой левой почечной артерии по Когану [21]. АД измеряли через хвостовую артерию инвазивным методом с помощью датчика давления MPX5050DP (Motorola, США). Полученный сигнал анализировали в программном комплексе PowerGraph V.2.0.

Электронно-микроскопический анализ образцов ткани левого желудочка и правого предсердия интакт­ных и экспериментальных животных (на 60-е сутки после перевязки левой почечной артерии) проводили по стандартной методике [22]. Клеточную локализацию ПНП и МНП выявляли методом иммуноцитохимии на ультратонких срезах, заключенных в эпоксидные смолы, используя поликлональные антитела к ПНП — Rabbit anti-Atrial Natriuretic Factor (1-28) (rat) (Peninsula Lab. Inc., Bachem, США) и МНП — Rabbit anti-Brain Natriuretic Peptide-32 (Rat) Serum (Peninsula Lab. Inc., Bachem, США). В качестве вторых антител использовали Protein-A/Gold (15 nm) (EM Grade, Electron Microscopy Sciences, США). Срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца и анализировали в электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI, США). Количественный анализ двух типов гранул с пептидами в предсердных КМЦ (А-тип, «зрелые, запасающие», и В-тип, «растворяющиеся») выполняли подсчетом в полях зрения (38×38 мкм) [21, 23]. Проводили морфометрический анализ морфологических разновидностей митохондрий КМЦ правого предсердия и левого желудочка в полях зрения (38×38 мкм). По одной из основных классификаций [24] выделили три типа митохондрий: митохондрии в энергизированном состоянии (состояние физиологической нормы), ортодоксальные митохондрии (набухшее состояние, просветление матрикса и дезориентация крист) и вакуолизированные митохондрии (характерны крупные внутримитохондриальные вакуоли, которые содержат мембранные структуры, напоминающие миелиноподобные тела).

Исследование ткани левого желудочка на светооптическом уровне проводилось у интактных и у опытных крыс через 60 сут после перевязки левой почечной артерии. Образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин [24]. Приготовленные на микротоме SM 2000R (Leica, Австрия) срезы 5–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и изучали с помощью светового микроскопа Eclips 80i (Nikon, Япония) и программы NIS-Elements BR 4.00.02. При увеличении ×40 измеряли площади КМЦ, мкм².

Статистическую обработку проводили с помощью программы Statistica 10.0 с применением критерия Манна–Уитни (р<0,05).

Результаты. В КМЦ экспериментальных животных выявлен ПНП- и МНП-иммунореактивный материал в гранулах обоих типов. Следует отметить, что все гранулы были помечены обоими антителами, т.е. содержали и ПНП, и МНП. Морфометрический анализ секреторных КМЦ правого предсердия на 60-е сутки после перевязки левой почечной артерии показал, что число гранул А- и В-типов, общее количество гранул статистически значимо не отличались от показателей интактных животных (рис. 1).

---

Рис. 1. Количественное распределение гранул с ПНП и МНП в течение 60 сут после перевязки левой почечной артерии у крыс (по тесту Манна–Уитни)

---

Уровень АД к 60-м суткам эксперимента статистически значимо не отличался от исходного значения (рис. 2).

---

Рис. 2. Изменение среднего АД в течение 60 сут после перевязки левой почечной артерии у крыс (по тесту Манна–Уитни)

---

Светооптическое изучение миокарда левого желудочка выявило гипертрофию КМЦ (рис. 3). Морфометрический анализ показал статистически значимое увеличение площади КМЦ на 61% по сравнению с интактными животными и на 6% — относительно 30-х суток эксперимента (рис. 4).

---

Рис. 3. Структура миокарда левого желудочка; ок. ×10, об. ×40; окраска гематоксилин-эозином: а — у интактной крысы; б — у крысы через 60 сут после перевязки левой почечной артерии

---

Рис. 4. Изменение площади кардиомиоцитов в течение 60 сут после перевязки левой почечной артерии у крыс (по тесту Манна–Уитни)

---

При электронно-микроскопическом анализе левого желудочка и правого предсердия экспериментальных животных обнаружены аналогичные мозаичные изменения КМЦ: в одних клетках ядра содержали ядрышко и эухроматин; в других клетках ядра были без ядрышек, отмечались инвагинации кариолеммы и гетеро­хроматин, перинуклеарное пространство определялось тотально расширенным (рис. 5). Во всех миоцитах наблюдалось изменение структуры митохондрий: происходило снижение количества митохондрий в состоянии физиологической нормы почти вдвое; увеличение ортодоксальных форм митохондрий и вакуолизированных митохондрий (рис. 6).

---

Рис. 5. Ультраструктура кардиомиоцита правого предсердия через 60 сут после перевязки левой почечной артерии: АГ — развитый аппарат Гольджи; Гр — гранулы; Мх — митохондрии; СПР — расширенный саркоплазматический ретикулум; Я — ядро; ×8900

---

Рис. 6. Изменение процентного содержания морфологических разновидностей митохондрий на 60-е сутки после перевязки левой почечной артерии

---

Миофибриллы находились в состоянии релаксации. В отдельных КМЦ наблюдались зоны пересокращения миофибрилл. В большинстве миоцитов выявлено расширение цистерн саркоплазматического ретикулума. Комплекс Гольджи хорошо развит. Hаблюдались гиперплазия и гипертрофия его компонентов, которые располагались не только около ядра, но и на периферии предсердных КМЦ (см. рис. 5). Обнаружены участки с потерей четкости сарколеммы и разрыхлением основного вещества базальной мембраны. Эти изменения сочетались с межклеточным отеком. Наблюдалось расхождение вставочных дисков.

В микроциркуляторном русле выявлены деструктивные изменения: происходило нарушение целостности эндотелиальной стенки и выход эритроцитов в интерстициальное пространство, в капиллярах встречались агрегированные эритроциты и тромбоциты, определялся перикапиллярный отек (рис. 7).

---

Рис. 7. Капилляр с агрегированными эритроцитами; ×8900, Эр — эритроциты

---

Обсуждение. Внутриклеточные механизмы синтеза, накопления и выведения натрийуретических пептидов исследованы весьма поверхностно из-за методических трудностей их идентификации и визуализации [25]. Применение количественного метода подсчета иммуномеченых гранул секреторных КМЦ, морфологических и физиологических методов дает наиболее полную информацию для изучения натрий­уретических пептидов сердца. С учетом данных, полученных нами на 30-е сутки эксперимента [19], дальнейшее исследование позволяет выявить динамику изменений, происходящих в организме крыс в отдаленный период. Отсутствие достоверных различий числовых значений А- и В-типов гранул и уровня АД на 60-е сутки эксперимента по сравнению с интактной группой свидетельствовало о восстановлении данных параметров до исходных в исследуемый период. На фоне этих результатов в КМЦ левого желудочка и правого предсердия выявлены выраженные деструктивные изменения. Из литературных источников [26] известно, что набухание митохондрий носит адаптивный характер. Однако оно способствует увеличению их функционирования до тех пор, пока сохранены пространственные взаимоотношения структурных элементов. Обнаруженное нами значительное набухание митохондрий свидетельствовало о нарушении эффективного функционирования — деэнергизации. Наблюдаемые изменения митохондрий, сарколеммы и расширение цистерн саркоплазматического ретикулума являются общим признаком кальциевого повреждения КМЦ.

Исследования, проведенные нами ранее [19, 21], выявили быстрое выведение ПНП и МНП из клеток на 30-е сутки после перевязки левой почечной артерии на фоне повышенного АД и гипертрофии КМЦ (см. рис. 2). По данным J. Wang и соавт. [27], гипертрофия КМЦ связана с экспрессией ING3 (inhibitor of growth family, member 3), активация которого приводит к повышению плазменного уровня ПНП и МНП после пережатия брюшной аорты у крыс. Другими исследователями [20] отмечено, что гипертрофия КМЦ в левом желудочке, развивающаяся у 6-месячных крыс НИСАГ (крысы с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией) на фоне высокого АД, является компенсаторной реакцией на гемодинамические нарушения, обусловленные повышением периферического сопротивления.

По-видимому, натрийуретические пептиды способст­вовали наблюдаемому восстановлению уровня АД к 60-м суткам и таким образом являлись важным компонентом в цепи сложных компенсаторных реакций, направленных на сдерживание гипертензии. Защитные свойства пептидов были показаны в эксперименте на собаках с левожелудочковой недостаточностью, вызванной кардиостимуляцией: использование ингибитора нейтральной эндопептидазы и введение ПНП приводило к увеличению натрийуреза и образованию в почках циклического гуанозинмонофосфата [7]. В клинических исследованиях [28] выявлено, что внутрикоронарное введение МНП снижает давление в легочной артерии, конечное диастолическое давление в левом желудочке и среднее АД.

Обнаруженное восстановление количества гранул с ПНП и МНП и давлением до исходного уровня на 60-е сутки экспериментальной вазоренальной гипертензии не совпадает с результатами, показывающими снижение содержания натрийуретических пептидов в предсердиях у больных с прогрессирующей артериальной гипертензией [29, 30]. Авторами работы [25] отмечено накопление большого количества зрелых гранул и заторможенное выведение таких пептидов у старых крыс-гипертоников линии НИСАГ на фоне сохраняющегося повышенного давления. По-видимому, эффективность или неэффективность натрийуретических пептидов, выступающих в роли регуляторного звена при формировании гипертонической болезни, зависит от генеза артериальной гипертензии. Использование нами комплекса современных методов исследования позволило выявить положительное влияние ПНП И МНП на давление в отдаленном периоде (60-е сутки).

Таким образом, восстановление синтетической активности натрийуретических пептидов и возвращение АД к исходному уровню происходили на фоне напряженности системы внутриклеточной регуляции в условиях адаптации к вазоренальной гипертензии, о чем свидетельствуют выраженные ультраструктурные изменения кардиомиоцитов правого предсердия и левого желудочка и гемокапилляров.

Заключение. Проведенное исследование на уровне целостного организма с применением количественного анализа гранул предсердных кардиомиоцитов, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, позволяет сделать вывод, что в отдаленный период экспериментальной вазоренальной гипертензии (на 60-е сутки) предсердный и мозговой натрийуретические пептиды оказывают положительное влияние на уровень артериального давления, снижающегося до исходного за счет выброса изучаемых пептидов на 30-е сутки. Эффективность натрийуретических пептидов, выступающих в роли регуляторного звена при формировании гипертонической болезни, зависит от генеза артериальной гипертензии.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках ведомственной НИР Минздрава России 2012–2016 гг. «Механизмы регуляции физиологических функций при экспериментальных состояниях организма».

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.