Использование MALDI-TOF-технологии для идентификации возбудителей септических состояний в педиатрической практике

В последние годы заболеваемость септическими состояниями — сепсисом, тяжелым сепсисом и септическим шоком — в развитых странах колеблется в диапазоне от 240 до 300 случаев на 100 000 населения в год [1]. Даже в условиях лечения в отделениях интенсивной терапии и реанимации летальность при сепсисе составляет 17,9%, при тяжелом сепсисе — от 28,6 до 50% [1, 2]. Количество зарегистрированных случаев сепсиса ежегодно увеличивается — в начале ХХI в. прирост в США составлял 1,5% в год [3]. Эффективность лечения септических состояний во многом обусловлена быстрой и правильной диагностикой. Важнейшей составляющей в постановке диагноза является микробиологическое подтверждение, которое заключается в обнаружении и идентификации жизнеспособных микробов в крови. Современные способы микробиологической диагностики септических состояний базируются на трех методических идеологиях [4–6]. Наиболее распространенный способ предполагает традиционное микробиологическое культивирование, направленное на получение чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией на основе морфологических, биохимических и серологических критериев. Метод обладает достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, но имеет важный минус — длительность выполнения (от 48 до 96 ч). Второй подход основан на выявлении в исследуемой крови генов-маркеров того или иного вида возбудителя при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Главным достоинст­вом ПЦР-диагностики является быстрота получения результата. Но и этот способ имеет принципиальный недостаток: положительные результаты не служат свидетельством наличия в крови живого возбудителя, они говорят лишь о присутствии в крови микробных нуклеиновых кислот, которые могут быть дериватами погибших микробов. Это часто приводит к ложноположительным результатам [6]. Третий методический подход выполняется на основе идентификации возбудителя по масс-спектрометрическому (МС) профилю его рибосомальных белков, полученному по технологии матрица-активированной лазерной десорбции/ионизации протеинов образца — MALDI-TOF (от англ. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization,Time-Of-Flight) [7]. МС-идентификация микробов в гемокультурах была успешно апробирована в диагностике бактериемий у взрослых пациентов [8]. Более того, одна из фирм-производителей масс-спектрометров (Bruker Daltonics, Германия) выпускает специальный набор MALDI Sepsityper Kit, предназначенный для пробоподготовки крови при МС-диагностике бактериемий. Однако диагностика в педиатрии принципиально отличается от взрослой: она не позволяет применять «взрослые» диагностические технологии без их предварительной адаптации как в части техники исполнения, так и в отношении интерпретации результатов. Так, проведение МС-диагностики бактериемий при помощи MALDI Sepsityper Kit ограничено невозможностью получить рекомендуемый фирмой-изготовителем объем крови для исследования (минимально — 8,0 мл) у некоторых категорий детей, например у детей с низкой и экстремально низкой массой тела, у детей после кровопотери и др. В неонатологии использование малых объемов крови, начиная от 0,5–1,0 мл, считается достаточным для достоверной диагностики бактериемий при помощи рутинных микробиологических методов [9]. Для решения этого противоречия в методику пробоподготовки крови для МС-исследования нами была включена операция дополнительного инкубирования малого объема крови (1,0–4,0 мл), полученного от ребенка и внесенного в специальную питательную среду. Аналогичные методики прединкубации крови для МС-диагностики бактериемий применялись в исследованиях взрослых пациентов [10], но при этом использовались большие объемы крови.

Цель исследования — оценка эффективности использования MALDI-TOF-масс-спектрометрии для идентификации микроорганизмов из малых объемов крови (1–4 мл), полученных от детей с подозрением на септические состояния, путем сравнения ее результатов с данными классического микробиологического исследования.

Материалы и методы. Объектами исследования служили образцы крови, полученные от детей из стационаров Научного центра здоровья детей РАМН и НИИ неотложной детской хирургии и травматологии Департамента здравоохранения г. Москвы. Критерием включения в исследование было подозрение на развитие септического состояния. Все образцы крови, инокулированные во флаконы для гемокультивирования, инкубировали в анализаторе гемокультур BACTEC 9050 (Becton Dickinson, США) до момента регистрации микробного роста. Критерием исключения являлось отсутствие микробного роста в инкубаторе BACTEC.

Немедленно после регистрации микробного роста из гемокультуры производили забор материала (4,0 мл), который разделяли на две части (обе по 2,0 мл). Первую часть высевали на плотные питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя по классическим микробиологическим методикам. В качестве методов идентификации изолятов применяли микроскопическое исследование, посев на селективные и хромогенные питательные среды, иммунохимические и биохимические методы, включая использование автоматического бактериологического анализатора Vitek 2 (BioMerieux, Франция). Вторую часть (2 мл гемокультуры) использовали для масс-спектрометрического определения таксономической принадлежности возбудителя, которое выполняли согласно отработанному ранее протоколу [11]. Процедуру выделения микробных белков завершали нанесением их (по 0,001 мл) на мишень для MALDI-TOF-масс-спектрометрии. В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту. Для повышения достоверности каждый образец тестировали в триплетах. Снятие спектров проводили в ручном режиме на масс-спектрометре MALDI Biotyper MicroFlex (Bruker Daltonics, Германия), диапазон спектра — 2–20 кДa. С каждого образца получали не менее 1000 спектров.

Статистическая обработка масс-спектров проводилась с помощью программы Biotyper 3.0 RTC. Степень достоверности идентификации оценивали по полученным значениям Score, сравнивая с данными спектров референсной библиотеки Biotyper 3.0. Случаи со Score <1,7 рассматривались как недостоверные и не учитывались в качестве случаев успешного определения таксономической принадлежности изолята [7]. Для сравнения эффективности двух методов идентификации возбудителей инфекций кровотока — классического микробиологического исследования и MALDI-TOF-масс-спектрометрии — применяли стандартный статистический прием, направленный на определение степени парной согласованности результатов. Для этого была использована каппа Коэна — мера согласованности, которая равна максимум 1 при полной согласованности, и 0 в том случае, если согласованность между оценками (тестами) наблюдается не чаще, чем можно было бы ожидать при случайном совпадении. Значения >0,75 считаются достаточной степенью согласованности [12].

Результаты. При помощи классического микробиологического исследования тестировано 139 гемокультур, из которых было выделено 164 изолята. Спектр идентифицированных микроорганизмов включал 26 видов бактерий и 3 вида дрожжеподобных грибов (Candida albicans — 4 изолята, Candida parapsilosis — 14 изолятов и Candida guilliermondii — 1 изолят). Среди бактерий обнаружено 12 грамположительных видов: Staphylococcus aureus — 7 изолятов, Staphylococcus capitis — 1 изолят, Staphylococcus epidermidis — 33 изолята, Staphylococcus haemolyticus — 17 изолятов, Staphylococcus hominis — 11 изолятов, Staphylococcus warneri — 1 изолят, Enterococcus faecalis — 9 изолятов, Enterococcus faecium — 3 изолята, Streptococcus gordonii — 1 изолят, Streptococcus parasanguinis — 1 изолят, Streptococcus vestibularis — 1 изолят, Streptococcus viridans — 2 изолята. 14 идентифицированных грамотрицательных видов были представлены Acinetobacter baumannii — 8 изолятов, Acinetobacter lwoffii — 1 изолят, Pseudomonas aeruginosa — 9 изолятов, Pseudomonas putida — 1 изолят, Stenotrophomonas maltophilia — 7 изолятов, Burkholderia cenocepacia — 1 изолят, Klebsiella pneumoniae — 23 изолята, Klebsiella oxytoca — 1 изолят, Escherichia coli — 1 изолят, Enterobacter aerogenes — 1 изолят, Enterobacter cloacae — 2 изолята, Enterobacter kobei — 1 изолят, Chryseobacterium indologenes — 1 изолят и Serratia marcescens — 1 изолят.

В 120 случаях гемокультуры содержали только по одному виду микроорганизма. Из монокультур выделены 21 вид бактерий (11 — грампозитивных и 10 — грамнегативных) и 4 вида грибов (табл. 1). Из 19 образцов были изолированы ассоциации, содержащие два или три вида микроорганизмов. Поэтому принципиальным для анализа было разделение всех результатов на две группы. В первую группу вошли результаты, полученные при исследовании гемокультур, содержащих только один вид микроорганизма (см. табл. 1), во вторую группу были включены данные для гемокультур, содержащих более одного вида микроорганизмов, — полимикробных культур (табл. 2).

Таблица 1. Результаты видовой идентификации микроорганизмов из гемокультур, содержащих по одному виду микроорганизма

Таблица 2. Результаты видовой идентификации микроорганизмов из гемокультур, содержащих более одного вида микроорганизмов

Результаты, полученные для монокультур методом MALDI-TOF, соответствовали классической идентификации в 115 случаях из 120 (95,8%) (см. табл. 1). Все несоответствия касались только грамположительных бактерий. В двух случаях ошибка отмечена при идентификации S. haemolyticus: он был определен МС-методом как S. warneriили как S. epidermidis; S. vestibularis был ошибочно идентифицирован как S. salivarius; S. viridans в двух случаях был ошибочно определен как Streptococcus pneumoniae. Степень согласованности результатов, полученных двумя методами, была высокой — значение каппы Коэна составило 0,96 (р<0,001).

Результаты исследования полимикробных гемокультур отражены в табл. 2. В 7 образцах (36,8%) из 19 полимикробных гемокультур методом MALDI-TOF с достоверным уровнем Score не был идентифицирован ни один вид. Для остальных 12 гемокультур (63,2%) определение вида с достоверным Score зарегистрировано только для одного из возбудителей, входящих в ассоциацию. Совпадение результатов MALDI-TOF-масс-спектрометрии и классического микробиологического исследования наблюдалось лишь для 27,3% (12 штаммов) из общего количества изолятов (n=44) всех полимикробных культур. Степень согласованности результатов двух методов была слабой, т.е. статистически не значимой (каппа Коэна составляла 0,58; р>0,05).

Обсуждение. Настоящее исследование является примером удачного применения MALDI-TOF-диагностики септических состояний в детской практике — в случаях, которые требовали быстрого получения результатов, но исключали возможность использования объемов крови, превышающих 4,0 мл. Полученные нами данные говорят о двух уровнях соответствия результатов микробиологической и МС-диагностики. Первый уровень касается моногемокультур. Для грамотрицательных бактерий и грибов результаты идентификации совпадали в 100% случаев. Моногемокультуры с грампозитивными возбудителями демонстрировали неполное (92,6%), но достаточно высокое совпадение (каппа Коэна — 0,89). Таким образом, мы подтвердили возможность эффективного применения для моногемокультур МС-идентификации возбудителей бактериемий, что соответствует результатам, полученным нашими коллегами ранее [13]. В целом соответствие результатов идентификации микробов из моногемокультур двумя методами было высоким и статистически доказанным.

Исследование полимикробных гемокультур показало неэффективность МС-технологии в диагностике бактериемии. Статистическая обработка данных подтвердила невозможность полноценной идентификации возбудителей, присутствующих в ассоциации, при помощи метода MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Лишь в 27,3% случаев данным методом определялся один из присутствующих возбудителей. Следует отметить, что в литературе имеются и другие, более позитивные результаты MALDI-TOF-диагностики полимикробных бактериемий. Например, в работе T.J. Gray с соавт. [10] проанализировано 26 случаев полимикробных инфекций кровотока, один из возбудителей с достаточным уровнем Score был идентифицирован в 96,2% случаев. Мы полагаем, что такие результаты связаны со специальным отбором гемокультур для анализа: авторы работали только с гемокультурами, в которых первоначально при помощи световой микроскопии были обнаружены грамотрицательные бактерии (хотя другими возбудителями в ассоциации могли быть и грамположительные бактерии). Как упоминалось выше, вероятность верной MALDI-TOF-идентификации для грамнегативных микробов является более высокой, чем для грампозитивных. Специального отбора образцов с грамотрицательными бактериями для наших экспериментов не проводилось.

По-видимому, главная причина негативных результатов идентификации микробов из смешанных культур связана не с принципиальными недостатками MALDI-TOF-масс-спектрометрии, а с несовершенством программного обеспечения существующих масс-спектрометров. Разработка методов идентификации микробов в микст-культурах требует создания колоссальных протеомных библиотек и совершенствования программ для обработки результатов. Однако в настоящее время реальность такова, что значительное количество ошибочных результатов, полученных при анализе полимикробных гемокультур, существенно ограничивает применение MALDI-TOF-метода в диагностике септических состояний.

Результаты работы показали перспективность применения масс-спектрометрической идентификации возбудителя в мономикробной гемокультуре. Однако использование данного метода не может рассматриваться как абсолютная альтернатива общепринятым способам идентификации возбудителя. Масс-спектрометрия может быть оправдана в качестве дополнительного исследования, позволяющего сократить время идентификации на 24–48 ч и, следовательно, ускорить применение адекватных антимикробных препаратов с учетом природной (видовой) резистентности возбудителя. Ускорение постановки диагноза при септических состояниях является жизненно важным: за каждый час промедления в назначении адекватной антибиотикотерапии выживаемость пациентов снижается примерно на 8% [14]. Поэтому необходимо использовать любую возможность ускорения постановки микробиологического диагноза.

Заключение. Результаты, полученные при помощи масс-спектрометрического MALDI-TOF-метода идентификации микроорганизмов в гемокультурах от детей с инфекциями кровотока, содержащих один микроб-возбудитель, имеют высокую степень соответствия результатам классического микробиологического исследования. MALDI-TOF-масс-спектрометрическая иден­тификация возбудителей инфекций кровотока мо­жет быть рекомендована в качестве дополнительного метода диагностики, направленного на сокращение времени анализа.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (соглашение №14.607.21.0064, уникальный идентификатор прикладных научных исследований RFMEFI60714X0064).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.