Флюоресцентный мониторинг фотодинамической терапии рака кожи в клинической практике

Фотодинамическая терапия (ФДТ) — современный, минимально инвазивный метод лечения опухолей, который в последние годы находит широкое применение в клинической практике [1–3]. Основными компонентами фотодинамической реакции являются: фотосенсибилизатор (ФС), предварительно введенный в организм и избирательно накопленный в опухолевой ткани, свет строго определенной длины волны, соответствующей максимуму поглощения ФС, и кислород [2, 4, 5]. ФДТ может использоваться в качест­ве метода радикального лечения при ранних стадиях опухолевого процесса, а также в схемах паллиативного лечения при запущенных стадиях опухолей, в качестве самостоятельного метода или в комбинации с другими подходами [1–3]. Привлекательность ФДТ для клинического применения в онкологии обусловлена следующими факторами: минимальное повреждение окружающих здоровых тканей за счет селективности накопления ФС в опухоли, незначительные системные эффекты, отсутствие механизмов первичной и приобретенной резистентности, отсутствие лимитирующих кумулятивных доз ФС и светового воздействия и, как следствие, возможность повторного проведения процедуры. Дополнительными преимуществами являются возможность использования в амбулаторных условиях, хорошая переносимость с минимальными болевыми реакциями, совместимость с другими методами лечения, хорошие косметические результаты. К факторам, ограничивающим широкое применение ФДТ, относятся: ослабление интенсивности лазерного излучения с глубиной проникновения света в биоткани и, как следствие, снижение эффективности и непредсказуемость фотодинамических реакций; влияние на результаты процедуры особенностей кровоснабжения и степени оксигенации опухоли; отсутствие эксцизионного материала для морфологического контроля лечения; эмпирический характер подбора режимов воздействия [1–5]. Минимизировать влияние этих недостатков на результаты ФДТ можно при использовании эффективных методов оценки адекватности проводимого лечения. Для успешности динамического контроля и управления фотодинамической реакцией методы мониторинга должны быть неинвазивными и быстродействующими с реализацией в режиме реального времени [5, 6]. Одним из таких методов является флюоресцентная визуализация, которая позволяет оценить степень накопления препарата в опухоли, уточнить границы опухолевого поражения и контролировать выгорание ФС. На основании данных флюоресцентной диагностики может быть оптимизирован режим лазерного воздействия: время проведения процедуры после введения ФС, плотность мощности и доза лазерного облучения [5, 7–11].

Цель исследования — оценить возможности метода флюоресцентной визуализации для мониторинга фотодинамической терапии немеланомных опухолей кожи и проанализировать взаимосвязь показателей флюоресценции фотосенсибилизатора — ФС (степени накопления и выгорания) с эффективностью проведенного лечения.

Материалы и методы. Исследование выполнено на базе Нижегородского областного онкологического диспансера. Флюоресцентный мониторинг проведен при ФДТ у 226 пациентов с базально-клеточными и плоскоклеточными карциномами кожи.

Исследование осуществлено в соответствии с Хельсинкской декларацией (принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия)) и одобрено Этическим комитетом НижГМА. От каждого пациента получено информированное согласие.

В качестве ФС применяли препарат хлоринового ряда Фотодитазин («Вета-грант», Россия) при системном введении в дозе 1,0 мг/кг массы тела. Лазерное воздействие проводили с использованием установки «Лахта-Милон» («Милон Лазер», Россия), длина волны излучения — 662 нм. Для доставки света к опухоли использовали световоды с микро- и макролинзами. Плотность мощности в среднем составляла 0,3 Вт/см² (0,28–0,32 Вт/см²), доза лазерного облучения — 200 Дж/см² при базально-клеточном раке и 300 Дж/см² — при плоскоклеточном раке.

Анализ параметров флюоресценции ФС проводили с помощью системы «Флуовизор» (ООО «Аткус», Россия). Через 1,5–2,0 ч после введения ФС (максимум накопления препарата согласно фармакодинамике Фотодитазина) оценивали интенсивность флюоресценции в реперных точках опухоли (I_t0) и окружающей здоровой кожи (I_N0) с определением отношения интенсивностей флюоресценции опухоль/норма (I_t0/I_N0). Степень выгорания (фотобличинга) препарата (ΔI_t/I_N) рассчитывали после определения флюоресценции в реперных точках непосредственно после сеанса лазерного воздействия по следующей формуле:

Интенсивность флюоресценции косвенно свидетельствует о концентрации ФС в опухоли.

При клинической оценке результатов ФДТ ответ опухоли оценивали на основании международных критериев RECIST [12] по изменению двух наибольших размеров с последующим проведением биопсии для морфологической верификации. Побочные эффекты классифицировали по шкале CTCAE v. 4.03 [13]. Длительность наблюдения составила от 2 до 40 мес, медиана — 26 мес.

Результаты и обсуждение. Полученные в исследовании данные о степени (концентрации) накопления ФС в опухоли относительно здоровых тканей позволили нам выделить три группы случаев. 1-я группа, условно оцененная нами как «отсутствие накопления», характеризуется низким отношением концентраций опухоль/норма I_t/I_N<1,1, когда флюоресценция окружающих тканей и опухоли сравнима. При I_t/I_N>1,3 диагностировали «высокое накопление». Параметры флюоресценции в границах 1,1<I_t/I_N<1,3 отнесены к «низкому накоплению» (рис. 1).

Рис. 1. Флюоресцентные изображения области опухоли (фокусы опухоли выделены пунк­тиром, точки А и В соответствуют курсорам измерения интенсивности флюоресценции). Степени накопления фотосенсибилизатора: а — пациентка Ц., мультицентричный базально-клеточный рак кожи лица, отсутствие накопления (зона 1), флюоресценция в опухоли сравнима с флю­оресценцией окружающих тканей (отношение менее 1,1), и высокое накопление (зона 2), флюо­ресценция в опухоли значительно отличается от флюоресценции окружающих тканей (отношение более 1,3); б — пациент В., базально-клеточный рак кожи лица, низкое накопление, флюоресценция в опухоли незначительно отличается от флюоресценции окружающих тканей (отношение 1,1–1,3)

При оценке степени фотобличинга ФС непосредственно после сеанса лазерного воздействия также было выделено три группы реакций (рис. 2). При уменьшении отношения флюоресценции опухоль/норма более чем на 20% от исходного [(I_t/I_N)/(I_t0/I_N0)<0,8)] выгорание препарата расценивалось как полное. Уменьшение отношения менее чем на 10% от исходного уровня [(I_t/I_N)/(I_t0/I_N0)>0,9] соответствовало отсутствию фотобличинга ФС, показатель в пределах 0,8–0,9 трактовался как частичное выгорание.

Рис. 2. Флюоресцентные изображения области опухоли (фокусы опухоли выделены пунктиром, точки А и В соответствуют курсорам измерения интенсивности флюоресценции). Степени выгорания фотосенсибилизатора: а — пациентка П., базально-клеточный рак кожи волосистой части головы, полное выгорание [(It/IN)/(It0/IN0)<0,8]; б — пациентка Ю., базально-клеточный рак кожи лица, выгорание частичное [0,8<(It/IN)/(It0/IN0)<0,9]; в — пациент­ка C., базально-клеточный рак кожи носа, отсутствие выгорания ((It/IN)/(It0/IN0)>0,9)

С клинической точки зрения результаты ФДТ в исследованной группе пациентов могут быть оценены как хорошие: при медиане наблюдения 26 мес выздоровление (безрецидивный период) зарегистрировано у 198 пациентов из 226 (87,6%), рецидивы отмечены у 18 пациентов (12,4%), которым проведены повторные сеансы ФДТ с хорошим клиническим результатом и медианой длительности безрецидивного периода после повторной ФДТ 13 мес. Важным также является получение хороших функциональных и косметических результатов у подавляющего большинства пациентов (96%) обследованной группы (рис. 3).

Рис. 3. Фото пациентки И., 68 лет, диагноз — «первичный базально-клеточный рак кожи лица»: а — до ФДТ, размер опухоли 45×48 мм с толщиной (экзофитный компонент и инвазия) 6 мм; б — после ФДТ, полный ответ опухоли, хороший косметический эффект, безрецидивный период 4 года

Осложнений после проведения ФДТ не отмечено, однако у отдельных пациентов зарегистрированы нежелательные явления: незначительное повышение фоточувствительности (2 случая), стойкая гиперемия кожных покровов (5 случаев), умеренный болевой синдром в зоне воздействия (78 случаев), длительные (более 3 мес) воспалительные реакции в зоне воздействия (37 случаев), формирование гипо- и гипертрофических рубцов (9 случаев). Все нежелательные явления оценивались не выше чем I–II степень по шкале CTCAE v. 4.03. Побочных явлений или осложнений, связанных с использованием метода мониторинга, нами не отмечено.

При анализе характера ответа опухоли на проведение ФДТ в зависимости от степени накопления препарата (I_t0/I_N0) статистически значимых различий не выяв лено: частота полных ответов составила 90–93% при всех вариантах накопления. При анализе влияния на непосредственные результаты степени фотобличинга препарата (ΔI_t/I_N) установлена тенденция к увеличению частоты полных ответов опухоли при полном выгорании ФС (см. таблицу).

Зависимость непосредственных и отдаленных результатов от параметров флюоресценции фотосенсибилизатора

В ходе анализа отдаленных результатов установлено, что частота рецидивов опухоли при отсутствии накопления и/или отсутствии выгорания ФС статистически значимо выше, чем при наличии флюоресцентного контраста между опухолью и окружающими тканями и полном или частичном выгорании.

Наилучшие непосредственные и отдаленные результаты достигнуты у 62 пациентов с сочетанием высокого накопления препарата и полного его выгорания после проведения процедуры. Количество полных ответов опухоли в этой группе составило 94% (58/62), отмечено всего 3,2% рецидивов (2/62) при сроках наблюдения от 4 до 40 мес.

Полученные результаты убедительно свидетельст­вуют о возможности использования флюоресцентной визуализации для неинвазивного наблюдения за ключевыми с точки зрения механизма ФДТ моментами: накоплением и выгоранием ФС, что позволяет говорить о перспективности мониторинга этих параметров для прогноза результата лечения. По нашим данным, у пациентов с низкой степенью накопления ФС в опухоли и/или отсутствием выгорания препарата после проведения ФДТ существует наибольший риск рецидива заболевания, что требует более интенсивного динамического наблюдения. Подобные результаты получены и другими авторами в серии экспериментальных исследований [5, 7–11].

Для повышения эффективности ФДТ в клинической практике важны не только пассивное наблюдение за основными компонентами лечения, но и возможность планирования режимов, управления основными реакциями ФДТ в режиме реального времени. В качестве метода планирования флюоресцентный имиджинг используется для детектирования реальных границ опухоли с целью формирования оптимальных полей и границ лазерного облучения, что особенно актуально при наличии невидимого инфильтративного компонента опухоли или мультицентричного поражения. Адекватный выбор поля светового воздействия способствует снижению риска рецидива на периферии и риска резидуальных опухолей [7, 14].

Целесообразным представляется изучение параметров флюоресценции для использования ее с целью дозиметрии и оптимизации режимов светового воздейст­вия. В частности, время начала процедуры светового воздействия, плотность мощности и доза излучения могут быть персонифицированы в зависимости от времени и степени накопления и выгорания ФС [4, 5, 8, 11, 15]. Для управления фотодинамическими реакциями в режиме реального времени оптимальным является применение флюоресцентной визуализации непосредственно во время светового воздействия [8], что, к сожалению, было невозможно в нашем исследовании из-за технологического несовершенства использованного оборудования. Еще одним ограничением проведенного исследования является измерение флюоресценции в условных единицах и анализ относительных величин, что позволяет лишь косвенно судить об истинной концентрации ФС в опухоли. С другой стороны, относительные величины позволяют минимизировать погрешности измерений, связанные с индивидуальными особенностями биотканей и существенным влиянием на результаты внешних условий проведения исследования. Все сказанное свидетельствует о необходимости совершенствования приборной базы флюоресцентного мониторинга ФДТ.

Для широкого использования в клинической практике диагностическая система должна обладать воспроизводимостью получаемых результатов, что достигается минимизацией влияния на результаты измерений внутренних шумов прибора и внешних факторов (фоновое освещение, расстояние от прибора до пациента). Для количественной оценки концентрации ФС в опухоли требуется принимать во внимание индивидуальные оптические характеристики биоткани (показатели рассеяния и поглощения, в том числе с учетом гетерогенности объекта), так как эти характеристики влияют на уровень измеряемой флюоресценции. Поскольку данные параметры варьируют от пациента к пациенту, а также существенно меняются в процессе ФДТ, для их корректного учета необходимы дополнительные измерения и соответствующая математическая обработка данных. Эти измерения могут быть проведены как точечно [10, 16], так и с помощью цифровых камер с использованием нескольких источников излучения и приемных спектральных каналов [17, 18]. Следует также отметить, что поскольку оптическое поле экспоненциально падает с глубиной, эффективность ФДТ также уменьшается с глубиной. Зная глубину опухоли, оптические характеристики ткани и степень накопления ФС в опухоли, можно оценить дозу оптического излучения [19, 20].

Необходимо сказать, что механизм ФДТ основан на взаимодействии основных компонентов (фотосенсибилизатор, свет, кислород) с реализацией трех видов реакций: феномен флюоресценции, фотохимические реакции I (без присутствия кислорода) и II типа (с присутствием кислорода) [4, 5]. Флюоресцентная визуализация позволяет контролировать только параметры ФС через наблюдение феномена флюоресценции, в то время как основным звеном механизма ФДТ является фотохимическая реакция II типа с образованием синглетного кислорода, приводящая к прямому цитотоксическому действию и абляции сосудистого русла опухоли. Для мониторинга этих элементов ФДТ целесообразно использовать другие подходы. В серии исследований [15, 21, 22] показана важность диагностики кислородного статуса опухоли до начала ФДТ и мониторинга образования синглетного кислорода в ходе терапии с применением комбинации методов спектроскопии для оценки исходной оксигенации тканей, методов флюоресценции для контроля накопления ФС и методов детектирования люминесценции синглетного кислорода после воздействия.

Другое направление оптического имиджинга основано на использовании оптической когерентной томографии (ОКТ) для неинвазивной диагностики изменений структуры опухоли после ФДТ. На примере немеланомных опухолей кожи показана эффективность ОКТ в визуализации границ новообразований для планирования ФДТ, в оценке непосредственных (ответ опухоли на лечение, адекватность процессов заживления) и отдаленных (диагностика резидуальных фокусов) результатов [23, 24]. Новые модификации ОКТ информативны относительно микроциркуляции опухолей, что перспективно в плане мониторинга основного патофизиологического механизма ФДТ — абляции сосудистого русла опухоли [25, 26].

Альтернативным и весьма перспективным подходом для неинвазивного мониторинга ФДТ является развитие технологии оптико-акустической визуализации. Этот вид биоимиджинга, объединяющий преимущества оптических и акустических методов, активно развивается в последние годы [27]. Как показывают первые результаты, оптико-акустический имиджинг при ФДТ позволяет получать информацию о структуре опухоли и архитектонике ее микрососудистого окружения до лечения и об изменении морфологии объекта после ФДТ, а также может использоваться для мониторинга одного из критичных компонентов фотодинамических реакций — параметров оксигенации опухоли [28].

Еще одним вариантом неинвазивного мониторинга могут стать методы многофотонной визуализации, приборная реализация и внедрение которых в клиническую практику стали возможными благодаря развитию фемтосекундной оптики [29–31]. Эти методы, несомненно, перспективны для детектирования опухолей. В работе [29] показаны преимущества многофотонной томографии по сравнению с конфокальной микроскопией в прижизненной диагностике базально-клеточной карциномы кожи. Возможность неинвазивного динамического детектирования снижения флюоресценции восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (NADH) в коже при экспериментальной артериальной окклюзии делает многофотонную томографию перспективной для мониторинга методов воздействия, связанных с влиянием на микроциркуляцию, в том числе и для контроля ФДТ [30].

Все перечисленные подходы обладают определенными преимуществами и недостатками. В обзоре K. König [31] показана целесообразность комбинации разных методов: как в приборной реализации гибридной техники, так и в комплементарном использовании различных технологий.

Для широкого внедрения метода в клиническую практику требуются усовершенствование приборной базы флюоресцентного мониторинга ФДТ, разработка методик его использования и проведение рандомизированных исследований по эффективности применения метода в клинической практике. Развитие метода может способствовать персонификации ФДТ за счет планирования индивидуальных параметров лазерного воздействия и управления фотодинамическими реакциями в режиме реального времени в зависимости от параметров флюоресценции, что позволит добиться максимального количества полных ответов опухоли на лечение и снизить процент рецидивов заболевания. Перспективным и актуальным направлением является развитие мультимодального биоимиджинга на основе флюоресцентной визуализации, новых модификаций ОКТ, оптико-акустической и многофотонной визуализации для дальнейшего развития дозиметрии и индивидуализации параметров ФДТ.

Заключение. На примере фотодинамической терапии опухолей кожи с использованием фотосенсибили­затора хлоринового ряда показано, что флюоресцентная визуализация является эффективным неинвазивным методом оценки характеристик одного из основных компонентов фотодинамических реакций — фотосенсибилизатора. Мониторинг таких параметров, как его накопление и выгорание, позволяет прогнозировать результаты фотодинамической терапии.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках Комплексной программы развития и внедрения ФДТ при финансовой поддержке экспериментальных работ Российским фондом фундаментальных исследований (грант РФФИ №14-02-00753/14), Программой повышения конкурентоспособности ННГУ (соглашение от 27 августа 2013 г. №02.В.49.21.0003 между Министерством образования и науки РФ и ННГУ) и в рамках технологических разработок и клинических исследований Министерства образования и науки РФ (проект RFMEFI60414X0027, договор №14.В25.31.0015).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.