Эффективность наночастиц магнетита, стабилизированных производным 3-гидроксипиридина и поливинилпирролидоном, в экспериментальной терапии острой кровопотери

Использование наноматериалов в медицине и фармакологии позволяет управлять биосистемами на молекулярном уровне, сочетать в одном препарате возможности диагностики и лечения — тераностику [1–3].

Среди наночастиц, которые интенсивно изучаются с целью биомедицинского применения, особое место занимают наноразмерные частицы оксидов железа, в том числе оксида железа (II, III), или магнетита. Свойства этих наночастиц обусловливают возможности их применения для визуализации структур при магнитно-резонансной томографии, гипертермии злокачественных новообразований, адресной доставки лекарств, а также для фармакокоррекции анемических состояний [4–7].

В исследованиях, посвященных наночастицам оксидов железа, используют феррофлюиды (наножидкости) — суспензии коллоидных магнитных наночастиц, стабилизированных поверхностно-активными веществами в жидкой среде [8], на основе которых возможно создание лекарственных форм для парентерального введения [9]. С целью стабилизации наночастиц оксидов железа их инкапсулируют, создавая покрытие, которое обеспечивает устойчивость к окислению, коррозии и агрегации, а также сохраняет однодоменность [10]. Стабилизирующие агенты (органические, неорганические, мономерные или полимерные) определяют не только гидродинамические размеры и физико-химические свойства магнитных наночастиц, но и их биологическую активность, взаимодействие с клетками-мишенями, поглощение макрофагами, токсичность [11]. При достаточном многообразии веществ для покрытия наночастиц оксидов железа производные 3-гидроксипиридина с этой целью ранее не использовались, поэтому нами была получена жидкая дисперсная система, содержащая наночастицы магнетита, стабилизированные 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинатом (Мексидолом) и поливинилпирролидоном (ПВП) [12], которая открывает новые перспективы биомедицин­ского применения как наножелеза, так и покрывающих его препаратов, в частности Мексидола.

Цель исследования — изучить влияние наночастиц магнетита, стабилизированных в жидкой среде Мексидолом и ПВП, на гематологические показатели лабораторных животных в норме и при острой пост­геморрагической анемии, оценить эффективность данных наночастиц путем сравнения их противоанемической активности с действием препарата железа для парентерального применения Феррум Лек.

Материалы и методы. Эксперименты выполнены на 109 белых крысах-самцах линии Wistar массой 210–225 г, полученных из питомника «Биомодельсервис» (Киев, Украина). Они производились в соответствии с правилами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.), и не вызвали возражений комиссии по биоэтике Украинской медицинской стоматологической академии.

Было проведено 3 серии экспериментов. В первой серии изучали влияние наночастиц, стабилизированных Мексидолом и ПВП, на крыс с выделением таких групп, как интактные животные; животные с введением растворителя (контроль); с введением референс-препарата (Феррум Лек); образцов наножидкости, содержащей наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП, с дальнейшим исследованием через 3 и 72 ч. Во второй серии изучали эффекты наночастиц магнетита, стабилизированных Мексидолом и ПВП, через 3 ч, в третьей серии — через 72 ч после острой кровопотери. В двух последних сериях выделяли следующие группы: интактные животные; кровопотеря с введением растворителя (без фармакокоррекции); кровопотеря с введением референс-препарата или с введением жидкой дисперсной системы, содержащей наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП (далее по тексту «наножидкость»). Острую кровопотерю моделировали путем пункции сердца под эфирным наркозом и извлечения 25% объе­ма циркулирующей крови [13].

Для приготовления наножидкости использовали конденсат наночастиц магнетита (Fe₃O₄) класса USPІО (ultra small particles of iron oxide) размерами 5–8 нм, осажденных направленным паровым потоком на кристаллы натрия хлорида путем электронно-лучевой технологии в вакууме (Институт электросварки им. Е.О. Патона НАН Украины, Киев, Украина) [14]. Этот порошок имел следующий состав (в массовых процентах): железо — 26,9%; натрий — 22,5%; хлор — 34,4%; кислород — 16,2%. Для солюбилизации и стабилизации наночастиц магнетита в водной среде применяли субстанцию 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината (известного как препарат Мексидол и обладающего антиоксидантным, антигипоксантным и анксиолитическим действием [15]), которую получали от производителя (ООО «Бион», Россия). Совместно с Мексидолом для стабилизации наночастиц магнетита использовали поливинилпирролидон (ПВП, повидон) с молекулярной массой 8,0±2,0 кДа (ООО «АК Синтвита», Россия) [16]. Дисперсную систему, содержащую перечисленные ингредиенты в соотношении 1 мг конденсата наночастиц магнетита, 20 мг Мексидола и 30 мг ПВП в 1 мл, готовили ex tempore, используя в качестве растворителя жидкость, которая содержит 2,75 г натрия хлорида, 0,21 г калия хлорида, 0,25 г кальция хлорида, 0,00025 г магния хлорида, 0,115 г натрия гидрокарбоната и дистиллированную воду до 1 л. Для этого в асептических условиях к смеси порошков наночастиц магнетита и субстанции Мексидола прибавляли 3% раствор ПВП в описанном выше ратворителе, перемешивали, выдерживали 2 ч при +60°С и охлаждали до комнатной температуры (+20°С). По данным фотон-корреляционной спектроскопии, наножидкость, приготовленная таким способом, содержит частицы с гидродинамическим размером 30–40 нм в преобладающем количестве (99,9% от общего числа) [12]. Образцы наножидкости вводили животным интраперитонеально сразу же после кровопотери в объеме 1 мл, чтобы доза по элементному железу составляла 1,35 мг Fe/кг массы тела. В качестве препарата сравнения использовали Феррум Лек (Lek, Словения) в дозе 1,25 мг Fe/кг массы тела [17], который инъецировали аналогично.

Животных выводили из эксперимента через 3 и 72 ч после кровопотери и в те же сроки — после введения наножидкости интактным белым крысам. Эвтаназию производили под эфирным наркозом путем забора крови из сердца до его остановки.

В крови из сердца определяли общее число эритроцитов (RBC), гематокрит (Hct), общий гемоглобин (Hb), средний объем эритроцита (MCV), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (MCHC), среднее количество гемоглобина в эритроците (MCH), а также индекс анизоцитоза — ширину кривой распределения эритроцитов (RDW) с помощью гематологического анализатора MicroCC-20Plus Vet (High Technology Inc., США) [18]. Содержание ретикулоцитов в крови изучали путем суправитального окрашивания метиленовым синим с последующим подсчетом клеток в мазках на микроскопе AmScope T490B-10MT (United Scoppe LLC, США) с объективом ×100 [19].

Полученный цифровой материал статистически обрабатывали с помощью стандартных компьютерных программ пакета Statistica for Windows 8.0. При этом вычисляли среднее М, стандартную ошибку m и оценивали достоверность различий между группами с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с апостериорным тестом Fisher LSD.

Результаты. В первой серии экспериментов установлено, что гематологические показатели у животных контрольной группы, которым вводили растворитель, не отличались от таковых у интактных белых крыс (табл. 1). Через 3 ч после введения интактным животным эталонного антианемического препарата Феррум Лек значения RBC и Hct находились на уровне контроля, а Hb возрастал на 11% (р=0,0054). В этом сроке наблюдений Феррум Лек увеличивал эритроцитарные индексы МСН (р=0,0001) и МСНС (р=0,0002) по сравнению с контролем. Введение интактным крысам жидкости, которая содержит наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП, приводило к увеличению RBC на 17% (р=0,0016), Hb — на 11% (р=0,0036) и Hct — на 17,5% (р=0,0001) по сравнению с контролем (см. табл. 1). Это статистически значимо выше RBC и Hct на фоне действия референс-препарата (соответственно р=0,0016 и р=0,0001). При введении наножидкости отмечалась также тенденция к сни­жению индекса МСНС (р=0,084) по отношению к контролю, причем данный показатель был ниже, чем насыщение эритроцитов гемоглобином при введении референс-препарата (р=0,0001). Остальные индексы не изменялись.

---

Таблица 1. Влияние наножидкости, содержащей наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП, на гематологические показатели интактных животных, M±m

---

Через 72 ч после введения Феррум Лек интактным белым крысам регистрировалось повышение Hb (р=0,0012) по сравнению с контролем на фоне неизменившихся RBC и Hct (см. табл. 1). Эритроцитарные индексы в этот период после введения интактным животным Феррум Лек характеризовались повышением МСН (р=0,0001) и МСНС (р=0,0001), а также уменьшением RDW (р=0,0135). В данном сроке наблюдения использование наножидкости вызывало повышение RBC на 16% (р=0,0082), Hct — на 18% (р=0,0001) и Hb — на 13% (р=0,0058) по отношению к контролю. Изменения числа эритроцитов и гематокрита под действием наночастиц были более выраженными, чем таковые при использовании референс-препарата (соответственно р=0,0085 и р=0,0013). На фоне действия наножидкости эритроцитарные индексы находились на уровне контроля, но насыщенность эритроцитов гемоглобином (МСН и МСНС) была ниже, чем под влиянием препарата сравнения Феррум Лек (р=0,0001).

У интактных животных введение Феррум Лек не влияло на содержание ретикулоцитов в крови через 3 ч после инъекции (рис. 1). После применения наножидкости этот показатель также не отличался от контроля, но был выше по сравнению с таковым при использовании Феррум Лек (р=0,0369). Через 72 ч при введении как эталонного препарата железа, так и стабилизированных наночастиц магнетита содержание ретикулоцитов в крови интактных животных оставалось на уровне контроля.

---

Рис. 1. Содержание ретикулоцитов в крови через 3 и 72 ч после введения интактным животным наножидкости, содержащей наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП; * — статистически значимая разница значений по сравнению с группой «Феррум Лек, 3 ч» (р<0,05)

---

Во второй серии экспериментов кровопотеря с введением растворителя (без фармакологической коррекции) сопровождалась снижением основных показателей «красной» крови (табл. 2). Через 3 ч значения RBC, Нсt и Hb уменьшались соответственно на 30, 29 и 27% (р=0,0001), а эритроцитарные индексы не изменялись по сравнению с таковыми у интактных животных. Введение крысам с кровопотерей референс-препарата Феррум Лек повышало Hb на 17% (р=0,0117) по сравнению с патологией без фармакокоррекции. Это происходило на фоне тенденций к повышению RBC (р=0,083) и Нсt (р=0,075). Введение эталонного препарата железа способствовало увеличению МСН (р=0,03) против кровопотери без фармакокоррекции. Наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП, на данном этапе наблюдений обеспечивали увеличение RBC на 20% (р=0,0004) и Hb на 15% (р=0,0197), а также повышали Нсt на 13% (р=0,018) по сравнению с кровопотерей без фармакокоррекции. В то же время они не влияли на эритроцитарные индексы по сравнению с патологическим фоном. При этом число эритроцитов и индекс МСН статистически значимо отличались от аналогичных показателей при введении референс-препарата: соответственно в сторону увеличения (р=0,0407) или уменьшения (р=0,012).

---

Таблица 2. Влияние наножидкости, содержащей наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП, на гематологические показатели животных после острой кровопотери, M±m

---

При кровопотере без фармакокоррекции через 3 ч содержание ретикулоцитов в крови оставалось таким же, как у интактных животных (рис. 2). Введение Феррум Лек способствовало повышению этого показателя (р=0,0428) по сравнению с патологическим фоном. При этом наножидкость не вызывала существенных изменений числа ретикулоцитов в крови по отношению к интактным животным, кровопотере без фармакокоррекции и кровопотере с введением референс-препарата.

---

Рис. 2. Содержание ретикулоцитов в крови животных через 3 (а) и 72 ч (б) после острой кровопотери с введением наножидкости, содержащей наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП; * — статистически значимая разница значений (р<0,05) по сравнению с интактными животными; + — с группой «кровопотеря + растворитель (без фармакокоррекции)»; v — с группой «кровопотеря + Феррум Лек»

---

Через 72 ч после кровопотери с введением растворителя (третья серия) значения RBC и Нсt продолжали оставаться сниженными соответственно на 18 и 16% (р=0,0001) по сравнению с интактными животными (см. табл. 2). Развитие компенсаторных реакций в этом периоде после кровопотери характеризовалось тенденцией к снижению RDW (р=0,088) при отсутст­вии изменений других эритроцитарных индексов. Использование референс-препарата Феррум Лек проявлялось тенденцией к повышению Нсt (р=0,095) без изменений RBC и Hb по сравнению с кровопотерей без фармакокоррекции. Влияние наножидкости на данном этапе компенсации острой кровопотери характеризовалось тенденцией к возрастанию RBC (р=0,0555) и статистически значимым увеличением Нсt (р=0,0287) при отсутствии изменений Hb по сравнению с патологическим фоном. При этом значения Hb при введении наножидкости были статистически значимо выше (р=0,022), чем при использовании Феррум Лек. И препарат сравнения, и наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП, в данный период наблюдений не влияли на состояние эритроцитарных индексов.

Через 72 ч после кровопотери с введением растворителя содержание ретикулоцитов в крови опытных животных было на 48% больше, чем у интактных (р=0,0048) (см. рис. 2). При кровопотере с введением Феррум Лек в это время число ретикулоцитов находилось на уровне модельной патологии без фармакокоррекции. В то же время после применения наножидкости оно увеличивалось на 41% по сравнению с кровопотерей без фармакокоррекции (р=0,0005), что было статистически значимо выше аналогичного показателя на фоне дейст­вия Феррум Лек (р=0,0012).

Обсуждение. Полученные результаты показали, что жидкость, содержащая наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП, стимулирует эритропоэз у интактных животных. Это проявляется уже через 3 ч после введения, сохраняется в пределах последующих 72 ч и характеризуется повышением значений RBC, Hb и Нсt, которые, однако, не выходят за пределы нормы [20]. Примечательно, что при подобии введенных доз железа эффект наножидкости в отношении числа эритроцитов и гематокрита был выражен сильнее, чем таковой при использовании Феррум Лек. Более высоким было через 3 ч после инъекции и содержание ретикулоцитов в крови животных, получавших наножидкость. Такое развитие процессов позволило предположить, что стабилизирующие агенты, и особенно Мексидол, сообщают изучаемым композитным наночастицам дополнительную способность стимулировать деление и созревание клеток эритроидного ростка костного мозга. Данное предположение согласуется с имеющимися в литературе сведениями о миелопротекторных свойст­вах Мексидола при облучении и его стимулирующем действии на эритропоэз при острой постгеморрагической анемии [21, 22]. Преобладающее увеличение числа эритроцитов при одинаковом уровне Hb в случае введения наножидкости интактным белым крысам также дает возможность объяснить тот факт, что насыщение эритроцитов гемоглобином в этом случае оказалось ниже, чем после применения Феррум Лек.

Моделирование острой кровопотери сопровождалось снижением уровня RBC, Hct и Hb без изменения эритроцитарных индексов, что свидетельствовало о нормохромном, нормоцитарном характере анемии и согласовывалось с данными литературы [23]. Типичным можно было считать отсутствие изменений содержания ретикулоцитов в крови животных через 3 ч после кровопотери, когда наблюдается гидремическая фаза компенсации кровопотери, и его увеличение через 72 ч, когда наступает костномозговая фаза компенсации [24].

При острой кровопотере действие наночастиц магнетита, стабилизированных Мексидолом и ПВП, как и действие эталонного препарата железа, было выражено сильнее через 3 ч от момента потери крови. При этом наножидкость вызывала более интенсивное восстановление уровня эритроцитов в крови по сравнению с Феррум Лек, что, очевидно, имеет ту же природу, что и подобные эффекты в системе эритрона интактных животных с введением стабилизированных наночастиц магнетита. В свете такого предположения противоречивым является тот факт, что в раннем сроке наблюдения наножидкость не вызывала увеличения числа ретикулоцитов в крови, как это наблюдалось в случае использования эталонного препарата железа. Исходя из темпов созревания клеток эритроидного ростка и его ускорения в условиях стресс-эритропоэза [25, 26], можно предположить, что наночастицы магнетита, стабилизированные Мексидолом и ПВП, ускоряют переход ретикулоцитов в эритроциты. Это создает иллюзию отсутствия изменений регенераторной реакции эритрона по сравнению с контрольной патологией. Не исключено также, что вещества, создающие покрытие наночастиц магнетита, способствуют выходу эритроцитов в циркуляцию, влияя на сосуды микроциркуляторного русла костного мозга и других депо, как то наблюдается под их действием в других тканях [27, 28].

Через 72 ч после кровопотери состояние основных показателей «красной» крови на фоне применяемых средств (за исключением гематокрита при введении наножидкости) не отличалось от такового при естест­венном развитии компенсаторных реакций и не достигало исходного уровня. Мы считаем, что это можно объяснить однократностью фармакологической коррекции и сравнительно низкой дозой введенного железа. В то же время следует отметить, что на фоне применения наночастиц магнетита, стабилизированных Мексидолом и ПВП, Hb был выше, чем при использовании Феррум Лек. Это может быть связано с их большей биодоступностью за счет наноразмерности, а также с присутст­вием в составе частиц сукцинатсодержащего производного 3-гидроксипиридина, способного участвовать в митохондриальных процессах [29], где происходит синтез гема [30]. Повышение через 72 ч содержания ретикулоцитов в крови животных, которым для коррекции кровопотери вводили наножидкость, указывает, что исследуемые наночастицы не только усиливают переход ретикулоцитов в зрелые эритроциты, как это предположено относительно предыдущего срока наблюдения, но и активируют регенераторную реакцию эритроидного ростка костного мозга на более ранних ее этапах.

Заключение. Наночастицы магнетита, стабилизированные в жидкой среде 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинатом (Мексидолом) и поливинилпирролидоном (ПВП), в дозе 1,35 мг Fe/кг массы тела стимулируют эритропоэз у интактных животных и активируют регенераторную реакцию эритрона при анемии, вызванной острой кровопотерей. Данные наночастицы действуют эффективнее, чем традиционный препарат железа Феррум Лек в сопоставимой дозе. Это преимущество, а также возможность использования в виде наножидкости открывают перспективы разработки новой лекарственной формы для коррекции анемических состояний.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Благодарности. Авторы выражают свою признательность заведующему отделом электронно-лучевой нанотехнологии Института электросварки им. Е.О. Патона (Киев, Украина) к.т.н. Ю.А. Курапову за предоставление исходного конденсата наночастиц магнетита и данных об его физико-химических характеристиках.