Разработка методики наблюдения экспериментальных опухолей с помощью многофункциональной оптической когерентной томографии: выбор оптимальной модели опухоли

Основной тенденцией современной экспериментальной и клинической онкологии является индивидуализация лечения, т.е. назначение и коррекция противоопухолевой терапии в соответствии с индивидуальными биологическими свойствами опухоли и ее первичным ответом на лечение. В клинической практике для определения схемы лечения врач-онколог учитывает ряд прогностических факторов: состояние/стадию процесса, рецепторный статус опухоли, возраст и пол пациента, наличие и степень выраженности сопутствующей патологии, предыдущий клинический опыт лечения пациентов с подобными видами рака и т.д. Однако опухоли, имеющие сходные клинические и биологические характеристики, часто ведут себя по-разному в каждом конкретном случае и могут существенно различаться как по чувствительности и ответу на различные виды противоопухолевой терапии (лучевая терапия — ЛТ, химиолучевая терапия — ХЛТ, фотодинамическая терапия — ФДТ), так и по прогнозу [1].

Современные возможности предсказания ответа опухоли на лечение достаточно ограничены. В последние годы в качестве методов, позволяющих оценить изменение биологической активности опухолевого процесса на фоне проводимого лечения, активно используются методы биофотоники. Они позволяют, к примеру, неинвазивно, быстро и относительно дешево определить кислородный статус опухоли, который рассматривается в настоящее время как один из ключевых факторов, определяющих прогноз заболевания и эффективность лечебных воздействий [2].

На сегодняшний день очевидно существование важ­ной и неудовлетворенной потребности в доклинических и клинических in vivo методах визуализации для определения раннего ответа опухоли на проводимое лечение [3]. Разработка чувствительного оптического инструмента визуализации ранних изменений в опухолевых тканях, подверженных цитотоксическому лечению, является актуальной задачей.

Оптическая когерентная томография (ОКТ) — раз­вивающийся многообещающий метод, который спо­собен обнаружить динамику структурных и функ­циональных изменений ткани опухоли в ответ на те­рапию [4, 5].

Используемая в данной работе установка для многофункциональной ОКТ (МФ ОКТ) сконструирована с учетом предыдущего опыта построения различных систем оптической когерентной томографии. Ис­пользование многофункциональной ОКТ предполагает выявление различных изменений опухоли в ответ на проводимую терапию: клеточного компонента (опухолевые клетки), стромы опухоли (соединительная ткань и внеклеточный матрикс) и микроциркуляторного русла. Ответ разных компонентов опухоли на лечение не одинаков, но в конечном итоге измерим и поддается количественной оценке [6, 7].

Проведение МФ ОКТ-исследования до и после опухолевой терапии (ФДТ, ЛТ и ХЛТ) позволит получить новые знания и сделать шаг в направлении индивидуализации лечения. Это возможно потому, что основной режим ОКТ (детекция обратного рассеяния зондирующего излучения тканями) направлен на оценку ткани опухоли в масштабе ~10 мкм; поляризационная мода выявляет изменения стромы; оценка сосудов опухоли с помощью такой функции ОКТ, как микроангиография в динамике, может рассматриваться как потенциальный критерий эффективности проведенной терапии.

Необходимый этап успешного применения метода МФ ОКТ в клинической практике — проведение экспериментальных исследований на опухолевых моделях животных для разработки методики МФ ОКТ-исследования и выявления ранних прогностических признаков ответа опухоли на лечение. Главным требованием к объекту исследования методом МФ ОКТ является поверхностная локализация — кожные покровы и слизистые оболочки. При выборе экспериментальной модели руководствовались тем, что в клинических исследованиях было запланировано изучение колоректального рака. В связи с этим остановились на экспериментальной мышиной модели рака кишечника Colo-26. Согласно литературным данным, опухоль Colo-26 отвечает на ФДТ, ЛТ и ХЛТ [8–10].

Известен опыт использования ОКТ для исследования опухоли на бедре, на ухе, в «окне» (a dorsal skinfold window chamber model). Так, A.M. Gobin и соавт. [11] наблюдали изменение ОКТ-сигнала обратного рассеяния при накоплении наночастиц в опухоли, имплантированной на бедре. Благодаря наночастицам, рассеивающим лазерное излучение, глубина визуализации значительно увеличивалась, поэтому кожа над опухолью не препятствовала ее исследованию. В работе H.-W. Song и соавт. [12] использована модель опухоли на ухе для наблюдения формирования опухолевого узла после инъекции клеток. Модель опухоли в «окне» применяется для визуализации кровеносных сосудов [13].

Цель исследования — изучение особенностей трансплантации, роста и визуализации экспериментальных опухолей животных с помощью многофункциональной ОКТ для разработки методики оценки индивидуального ответа опухоли на противоопухолевую терапию.

Материалы и методы. Исследования выполнены на экспериментальной установке скоростной спектральной МФ ОКТ (рис. 1), разработанной в ИПФ РАН (Н. Новгород, Россия).

Рис. 1. Система для получения ОКТ-изображений: а — устройство многофункциональной ОКТ; б, в — ОКТ-зонд с торцевым окном

Технические характеристики установки МФ ОКТ. МФ ОКТ-установка построена с использованием спектрального принципа приема сигнала [14–18] и обеспечивает скорость получения информации 20 000 А-сканов в секунду. Для исследования объекта используется широкополосный свет ближнего инфракрасного диапазона (1,3 мкм) мощностью около 15 мВт. Установка оснащена двухкоординатным зондом, осуществляющим сканирование объекта лучом в диапазоне 4×4 мм. Сканирование может выполняться по произвольному закону, что позволяет реализовывать различные режимы получения информации. Установка обеспечивает пространственное разрешение 25×25 мкм в поперечном направлении и около 10 мкм — в глубину. Установка снабжена модулем приема кросс-поляризационного изображения [19]. Программные средства позволяют кроме визуализации ОКТ-изображений в режиме реального времени представлять объемные (3D) изображения и на основе оригинального подхода рассчитывать изображения микрососудистой сети [20]. Физический принцип выделения сосудистой сетки основан на определении временнόй изменчивости полного комплексного сигнала в каждом элементе изображения, формирующего спекл-структуру. В тех местах, где рассеивающие элементы подвижны, фаза и амплитуда комплексного сигнала спекловых пятен изменяется от скана к скану значительно быстрее по сравнению с окружающей тканью, что позволяет судить о наличии текущей крови в таких местах. Обработка основана на пространственно-временнόй фильтрации последовательно записанных сильно перекрытых А-сканов при медленном латеральном сканировании (так называемый режим «M-ModelikeOCT») [20].

При оптимизации опухолевых моделей проводилась оценка кросс-поляризационных изображений (КП ОКТ) в исходной и ортогональной поляризациях и микроангиографических ОКТ-изображений (МА ОКТ).

Экспериментальные опухолевые модели. В нашем эксперименте опухолевой моделью служила недифференцированная колоректальная аденокарцинома мышей Colo-26. Опухоль трансплантируется подкожной или внутрикожной инъекцией суспензии культуры опухолевых клеток мышам линии BALB/с. В данной работе в сравнительном аспекте исследовали подкожную и внутрикожную инъекцию в бедро, внутрикожную инъекцию в ушную раковину мыши и так называемую модель опухоли в «окне» в складке кожи спины. Прививочная доза во всех случаях составляла 200 тыс. клеток. При трансплантации в бедро в случае глубокого подкожного залегания опухолевого узла использовали технологию открытого кожного лоскута. Внутрикожную инъекцию на ухе проводили согласно работе [12], рост опухоли в «окне» моделировали по схеме, описанной в работе [21].

Для верификации структуры опухоли на ОКТ-изображениях и глубины локализации осуществляли параллельное сопоставление с соответствующими гистологическими препаратами, окрашенными по стандартной методике гематоксилином и эозином.

При работе с животными руководствовались «Правилами для проведения работ с использованием экспериментальных животных» [22] и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [23], а также неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). На проведение экспериментальных исследований на животных получено разрешение Этического комитета НижГМА (протокол №14 от 10 декабря 2013 г.).

Результаты и обсуждение. Морфологический анализ препаратов опухоли Colo-26 свидетельствует, что она представлена опухолевыми клетками, образующими комплексы и тяжи. Опухоль бедна соединительной тканью, однако имеет хорошо развитую сосудистую сеть (рис. 2, в, г).

Рис. 2. Исследование опухоли Colo-26 на бедре: а — ОКТ-изображение подкожного узла; б — ОКТ-изображение внутрикожного узла; в — гистологический препарат подкожного узла (окраска гематоксилином и эозином, размер кадра 936×702 мкм, бар — 50 мкм); г — гистологический препарат внутрикожного узла (окраска гематоксилином и эозином, размер кадра 936×702 мкм, бар — 50 мкм). Здесь и далее: верхнее ОКТ-изображение — исходная поляризация, размер 2,7×1,7 мм; нижнее — ортогональная поляризация, размер — 2,7×1,7 мм; бар — 1 мм. Стрелками показана опухоль

При подкожной трансплантации опухоли Colo-26 в область бедра глубина залегания опухолевого узла составляет 130–200 мкм (рис. 2, в). При этом на ОКТ-изображениях опухоль не визуализируется под сильно рассеивающими эпидермисом и дермой (рис. 2, а). Подобная подкожная модель непригодна для мониторинговых ОКТ-исследований.

В случае использования тонких игл 31G (0,26 мм) удается обеспечить поверхностную инъекцию клеточной культуры Colo-26 и формирование на 5–7-й день одиночных внутрикожных опухолевых узлов размером 3–5 мм (рис. 2, б, г). По морфологическим данным, опухолевый узел формируется на глубине 40–100 мкм от поверхности эпидермиса (рис. 2, г). Однако на КП ОКТ-изображении глубина проникновения сигнала не превышает 350–380 мкм (рис. 2, б). Ввиду того, что оптический сигнал быстро затухает с глубиной, особенно в ортогональной поляризации, исследование внутрикожной опухоли также нецелесообразно.

Бóльшую глубину визуализации опухоли (до 800–900 мкм) можно получить при «открывании» опухоли, другими словами, при работе на открытом кожном лоскуте (рис. 3). На ОКТ-изображении опухоль не имеет структуры, однако наличие сигнала в исходной и ортогональной поляризации позволяет использовать различные подходы к количественной оценке ОКТ-сигнала [24, 25]. При работе с «открытой» опухолью удается избежать раздражений на поверхности кожи над опухолью, возникающих вследствие депиляции волосяного покрова и/или в результате некроза кожи при прорастании опухоли. Однако существенный недостаток, ограничивающий применение этой техники, — отсутст­вие возможности ежедневного мониторинга состояния опухолевого узла.

Рис. 3. Пример ОКТ-изображений «открытой» опухоли Colo-26 с применением технологии открытого кожного лоскута; бар — 1 мм. Стрелкой показана опухоль

Перспективной альтернативой «открытой» опухоли является моделирование опухоли в «окне» в складке кожи спины. По существу, опухолевый узел остается открытым, при этом рост под стеклом дает возможность проводить динамическое наблюдение процесса (рис. 4) от момента инъекции опухолевых клеток до формирования опухоли размером 5–6 мм. Немаловажным преимуществом этой модели служит удобство наблюдения кровеносных сосудов опухоли и изучение процесса ангиогенеза.

Рис. 4. Модель опухоли Colo-26 в «окне» в складке кожи спины: а — КП ОКТ-изображение на 3-и сутки после инъекции культуры клеток, бар — 1 мм; б — гистологический препарат, окраска гематоксилином и эозином, размер кадра — 3741×2809 мкм, бар — 50 мкм; в — фотография модели опухоли в «окне»; г — МА ОКТ на 3-и сутки после инъекции клеток, размер изображения — 2×2 мм. Стрелками показана опухоль

В ходе эксперимента установлено, что длительность проведения исследования опухоли в «окне» на мышах линии BALB/с ограничена размером 5–7 мм. При дальнейшем росте узла он выходит за пределы «окна» за счет недостаточной эластичности кожи мышей данной линии. Модель опухоли в «окне» прекрасно подходит для визуализации сосудов, в том числе методом ОКТ (рис. 4, г). Однако у мышей с данной моделью в отдельных случаях мы наблюдали воспаление и отек в области опухоли, что затрудняет МА ОКТ-исследования.

Группой Алекса Виткина в модели опухоли в «окне» для наблюдения МА ОКТ использовались бестимусные мыши (athymic nude mice) [26, 27]. Преимуществом этой линии мышей является высокая эластичность кожи, которая позволяет наблюдать рост опухоли в «окне» длительное время. Однако малодоступность в России и высокая цена данной линии мышей ограничивают их использование в экспериментах.

Поверхностная опухоль может быть моделирована при трансплантации опухоли на внешнюю поверхность ушной раковины мыши. Важным достоинством такой прививки является гарантированный поверхностный рост узла. Это главное условие для проведения ОКТ-исследования. Особенность прививки на ухо — малый объем вводимой жидкости — 10–20 мкл (для примера, в бедро вводят по 50 мкл суспензии клеток), что, возможно, сказывается на относительно низкой прививаемости опухоли (60–80% по сравнению со 100% на бедре) и большим разбросом срока появления узлов у различных особей: от 3–4 до 11 дней. Несмотря на эти особенности (которые можно учесть при планировании эксперимента), модель опухоли на ухе является оптимальной для ОКТ-исследования. Прививка на ухо не требует проведения депиляции перед началом исследования. Это исключает возможность раздражения кожи над опухолью, которое мешает ОКТ-визуализации.

На ранних стадиях формирования узла глубина КП ОКТ-визуализации позволяет наблюдать весь опухолевый узел целиком как в исходной, так и в ортогональной поляризации (рис. 5, а). На ОКТ-изображении отчетливо видны тканевые слои, в том числе хрящ с надхрящницей, собственные сосуды дермы, характерные для ушной раковины и подтвержденные морфологическим исследованием (рис. 5, в). Развитие опухолевого узла характеризуется размыванием слоев, характерных для нормальной структуры уха, и снижением интенсивности оптического сигнала, особенно в ортогональной поляризации (рис. 5, б).

Рис. 5. Модель опухоли Colo-26 на ухе: а, б — КП ОКТ-изображения на 5-е и 11-е сутки после трансплантации, бар — 1 мм; в — гистологический препарат, окраска гематоксилином и эозином, размер кадра — 3745×2809 мкм, бар — 50 мкм; г, д — МА ОКТ-изображения на 5-е и 11-е сутки после трансплантации, размер изображения — 2×2 мм

По морфологическим данным по мере роста опухолевый узел может располагаться либо на глубине от эпидермиса, либо вплотную подрастать к эпидермису (без инвазивного роста в него). Глубина залегания узла варьирует от 20 до 65 мкм (рис. 5, в). Установлено, что опухоль, трансплантированная на ухо, является наиболее поверхностной и легко доступной для ОКТ-наблюдения, в том числе в динамике. Опухоль доступна для ОКТ-исследования на всю глубину, если ее размер не превышает 1,5 мм (рис. 5, а, б).

В таблице представлены сравнительные данные о моделях опухоли Colo-26, трансплантированной на бедро, ухо и в «окно» мышам линии BALB/с.

Характеристика моделей опухоли Colo-26 на мышах линии BALB/с

Заключение. При изучении в сравнительном аспекте особенностей трансплантации, роста и визуализации методом многофункциональной ОКТ экспериментальной опухолевой модели Colo-26 у мышей линии BALB/с, трансплантированной на бедро (в том числе «открытая» опухоль), ушную раковину, складку кожи спины (так называемая модель опухоли в «окне»), установлено, что оптимальной опухолевой моделью для динамического МФ ОКТ-наблюдения является опухоль на ушной раковине. Она, в отличие от модели на бедре, характеризуется поверхностным залеганием узла, хорошо доступным для визуализации. Опухоль, развивающуюся на ухе, можно изучать в динамике, что невозможно сделать на «открытой» опухоли. Опухоль в «окне» также может быть использована для МФ ОКТ, однако мониторинг роста ограничен ее размером — 5–7 мм — ввиду выхода узла за пределы «окна» за счет недостаточной эластичности кожи мышей данной линии.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Правительства Российской Федерации, Министерства образования и науки Российской Федерации (договор №14.B25.31.0015). Исследования по совершенствованию методики получения МА ОКТ-изображений выполнены при частичной поддержке гранта РФФИ 15-42-02513 и контракта 02.B49.21.0003 между Министерством образования и науки Российской Федерации и Нижегородским государственным университетом.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.