Роль энергетических субстратов в кальциевой активности астроцитов гиппокампа крыс раннего постнатального онтогенеза

Астроглия — самый многочисленный тип глиальных клеток — выполняет ряд важных функций в мозге. Астроциты участвуют в буферизации ионов калия, регулируют локальный кровоток, вызывая при этом вазоконстрикцию или вазодилатацию, в них экспрессируются трофические факторы, влияющие на рост нейронов и формирование новых синапсов. Важную роль астроциты играют в питании нейронов, поставляя им глюкозу и другие вещества, которые могут служить энергетическими субстратами для нейронов [1]. Они также служат основным депо гликогена в мозге [2].

Астроциты являются электрически неактивными клетками, но имеют свою сигнальную систему, представленную генерацией кальциевых ответов, длительность которых может составлять несколько секунд [3]. Недавние исследования [4] показали, что астро­циты играют немаловажную роль и в формировании памяти посредством поставки лактата к нейронам. При активной работе нейронов и при некоторых патологиях нервной системы в астроцитах интенсивно происходит синтез лактата, который служит источником энергии для нейронов. Поскольку нейрональная активность зависит от доступности энергетических субстратов, этот процесс также может рассматриваться как механизм регуляции астроцитами функционирования нейронов [5].

Лактат и пируват являются основными энергетическими субстратами в развивающемся мозге, а также во взрослом мозге, когда уровень глюкозы ограничен [6]. Кроме того, показано [7], что в качестве энергетического субстрата в мозге молодых животных могут выступать кетоновые тела. Они представляют собой группу органических соединений, являющихся промежуточными продуктами жирового, углеводного и белкового обмена, — ацетоуксусная кислота (ацетоацетат), β-оксимасляная кислота (β-оксибутират или D-3-гидр­оксибутират) и ацетон. В молоке крысы содержится большое количество жирных кислот, при расщеплении которых образуются кетоновые тела. По всей видимости, они оказывают влияние на активность нейронов в раннем постнатальном развитии [8]. Однако возрастные изменения кальциевой активности в астроцитах, а также влияние метаболических изменений мозга остаются недостаточно изученными.

Цель исследования — изучить влияние метаболических изменений мозга, таких как возраст постнатального развития животного, температурные условия и наличие специфических энергетических субстратов, на функциональную (кальциевую) активность астроцитов в гиппокампе крыс.

Материалы и методы. В работе использованы переживающие срезы гиппокампа крыс линии Wistar трех возрастных групп: 5–10 дней, 10–20 дней и более 20 дней постнатального развития животного. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в приказе Минздрава России №267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Исследование проведено в соответствии с принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.), и одобрено Этическим комитетом Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Животные были анестезированы эфиром и декапитированы, затем мозг закреплялся в специальной камере, заполненной модифицированным раствором Рингера при температуре, близкой к 0°C. Раствор постоянно насыщался карбогеном (5% СО₂ + 95% О₂). Состав раствора (в ммоль): NaCl — 124,0; KCl — 2,5; MgSO₄ — 8,48; NaH₂PO₄ — 1,24; NaHCO₃ — 26,2; CaCl₂ — 0,5; D-Glucose — 11,0. Приготовление срезов гиппокампа толщиной 350 мкм осуществляли с помощью вибратома Microm (Германия). До переноса в камеру срезы хранили в растворе с повышенным содержанием ионов магния, ослабляющего последст­вия резки. В состав раствора входили (в ммоль): NaCl — 124,0; KCl — 2,5; MgSO₄ — 1,3; NaH₂PO₄ — 1,0; NaHCO₃ — 26,2; CaCl₂ — 1,0; MgCl₂ — 1,6; D-Glucose — 11,0. Температуру раствора устанавливали в зависимости от условий эксперимента («комнатная» — 22–24°C или «близкая к физиологической» — 32–34°C). Регистрацию кальциевой динамики в астроцитах осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 510 (Германия). В качестве флюоресцентных красителей использовали кальциевый индикатор Oregon Green 488 (0,7 мкмоль) и специфичный маркер астроцитов Sulforhodamine 101 (5 мкмоль). Изменения интенсивности флюоресценции кальциевого индикатора, регистрируемые покадровыми записями (1 кадр в секунду в течение 20 мин), использовали для измерения кальциевой активности в астроцитах. Для количественной оценки кальциевой динамики учитывали два параметра: длительность и частоту кальциевых сигналов. Данные параметры анализировали с помощью специально разработанного программного пакета Astroman. Поскольку амплитуда флюоресцентных сигналов является комплексным параметром, зависящим не только от концентрации кальция, но и от концентрации красителя, а также от мощности излучения лазера, достигающего клетки в глубине ткани, этот параметр не учитывался в оценке кальциевой динамики в астроцитах. Значения представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего, n — число срезов. Достоверность статистических различий выборок проверяли с помощью непараметрического теста Манна–Уитни.

Результаты

Кальциевая активность астроцитов в процессе постнатального развития. Частота и длительность кальциевых сигналов были изучены в астроцитах трех возрастных групп крыс (рис. 1, a). Наименьшая частота кальциевых событий наблюдалась у тестовой группы животных в возрасте до 10 дней и составляла 0,153±0,009 событий/мин (рис. 1, б). У животных более позднего развития (10–20 дней постнатального развития) частота событий увеличивалась до 0,244±0,040 событий/мин (p=0,05 при сравнении с тестовой группой до 10 дней постнатального развития, тест Манна–Уитни) и далее статистически значимо не изменялась. У возрастной группы животных более 20 дней постнатального развития средняя частота кальциевых событий составила 0,194±0,017 событий/мин (p=0,01 при сравнении с возрастной группой животных до 10 дней и p=0,007 при сравнении с группой животных в возрасте 10–20 дней, тест Манна–Уитни).

---

Рис. 1. Спонтанная кальциевая активность в астроцитах в процессе постнатального развития:а — оригинальные записи кальциевых событий отдельных четырех астроцитов в разных срезах в трех возрастных группах животных, наименьшая частота событий наблюдается у животных в возрастной группе до 10 дней постнатального развития; б — средняя частота кальциевых событий в минуту в астроцитах гиппокампа крыс; в — средняя длительность кальциевых событий, к 20-му дню постнатального развития происходит статистически значимое уменьшение длительности кальциевых ответов в астроцитах. * — p<0,05, ** — p<0,001, Нд — отсутствие достоверности

---

Средняя длительность кальциевых событий составила 20,48±1,15 с у тестовой группы животных до 10 дней постнатального периода и 21,45±1,66 с — у животных от 10 до 20 дней (p=0,1 при сравнении с тестовой группой животных до 10 дней, тест Манна–Уитни), но к периоду более 20 дней уменьшалась до 15,43±0,91 с (p=0,008 при сравнении с тестовой группой животных до 10 дней и p=0,008 при сравнении с группой 10–20 дней постнатального развития, тест Манна–Уитни) (рис. 1, в).

Влияние температурных условий на спонтанную кальциевую динамику в астроцитах. Одним из вероятных механизмов изменения кальциевых событий в астроцитах при развитии мозга является изменение метаболической активности клеток. Изменение уровня метаболической активности в срезах может быть достигнуто при изменении температуры. Мы сравнили кальциевую динамику в астроцитах при температуре, близкой к физиологической (32–34°C), с событиями при комнатной температуре (22–24°C). Такое изменение температуры приводит к существенному снижению спонтанных синаптических событий. Однако оказалось, что данные температурные условия не влияют ни на частоту, ни на длительность кальциевых ответов в астроцитах ни в одной возрастной группе (рис. 2). Этот результат оказался неожиданным, так как традиционно считалось, что изменение уровня нейрональной активности служит сигналом для активации астроцитов. Возможно, что базовый уровень активности астроцитов в срезах является спонтанным и не зависит от нейрональной активности, так как температурное снижение нейрональной активности не оказывает влияния на кальциевую динамику в астроцитах.

---

Рис. 2. Температурные условия не оказывают влияния на спонтанную кальциевую динамику астроцитов: частота (а) и длительность (б) кальциевых событий астроцитов при двух температурных условиях. Оба параметра не изменяются, о чем свидетельствует отсутствие достоверности между выборками (Нд)

---

Влияние специфических энергетических субстратов на частоту кальциевых событий в астроцитах у животных в раннем постнатальном развитии. Данную часть исследования проводили путем изменения во внеклеточном растворе энергетических субстратов. В качестве контроля использовали раствор с глюкозой. При этом глюкоза не является основным субстратом в развивающемся мозге [9]. Мы предположили, что энергетические субстраты, используемые мозгом во время кормления материнским молоком, могут оказывать влияние на кальциевую активность в астроцитах. Для исследования частоты и длительности кальциевых событий в астроцитах в дополнение к глюкозе добавляли разные энергетические субстраты: контроль — глюкоза (10 ммоль); глюкоза (5 ммоль) + лактат (5 ммоль); глюкоза (5 ммоль) + пируват (5 ммоль); глюкоза (5 ммоль) + β-гидроксибутират (10 ммоль) (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют, что специфические энергетические субстраты статистически значимо увеличивают частоту кальциевых событий в астроцитах у животных в возрастной группе до 10 дней постнатального развития, но достоверно не изменяют исследуемые параметры кальциевой динамики астроцитов у животных последующих двух тестовых групп.

---

Рис. 3. Специфические энергетические субстраты увеличивают частоту кальциевых событий в астроцитах у животных в раннем постнатальном развитии: а — частота кальциевых событий в астроцитах при добавлении специфических энергетических субстратов (лактата, пирувата, β-гидроксибутирата); у животных в возрастной группе до 10 дней происходит статистически значимое увеличение частоты кальциевых событий в астроцитах; б — длительность кальциевых ответов в астроцитах при добавлении специфических энергетических субстратов статистически значимо не изменяется, но сохраняется возраст-зависимое снижение длительности ответов к 20-му дню постнатального периода. Нд — отсутствие достоверности; * — р<0,05

---

Обсуждение. В развивающемся мозге многие процессы способны оказывать влияние на активность астроцитов. Изменения кальциевой активности астроцита могут быть обусловлены разными уровнями экспрессии рецепторов и транспортеров в постнатальном развитии, изменением морфологии самого астроцита [10]. Наши данные свидетельствуют, что у животных до 10 дней постнатального развития частота кальциевых событий определяется не только периодом развития животного, но и поступлением в мозг специфических энергетических субстратов из материнского молока (пирувата, лактата, β-гидроксибутирата). Если срезы от таких животных перфузировать раствором на основе глюкозы (энергетический субстрат, не характерный для этого возраста), то частота кальциевых событий в астроцитах снижается. Добавление специфических энергетических субстратов увеличивает частоту кальциевых событий до уровня, характерного для более взрослых животных. Таким образом, для нормального функционирования мозга, в частности астроцитов, на ранних стадиях постнатального развития необходимо наличие энергетических субстратов, поступающих с материнским молоком. Это очень важно, потому что именно астроциты поставляют питательные вещества к нейронам и вследствие этого регулируют их активность. Таким образом, питание материнским молоком необходимо в этот период жизни для поддержания необходимого уровня астроцитарной активности и, вследствие этого, доставки питания к нейронам. Эти данные могут обосновать необходимость материнского молока для нормального развития головного мозга на ранних этапах.

Следует также отметить, что к 20-му дню постнатального развития происходит уменьшение длительности кальциевых событий. По всей вероятности, к этому периоду в клетках уже сформированы основные системы утилизации ионов кальция, что может послужить причиной такого уменьшения. Изменения параметров кальциевых ответов в астроцитах могут быть связаны с изменениями метаболизма в них. В этом случае понижение общего уровня метаболизма в мозге при снижении температуры должно оказывать влияние на кальциевую активность в астроцитах. Однако снижение температуры срезов от близкой к физиологической до комнатной не оказало влияния на кальциевую динамику в астроцитах. Кинетика многих биохимических реакций изменяется при повышении или понижении температуры. Так, например, ферменты, катализирующие большинство биохимических реакций, обладают термолабильностью — изменением своей активности при колебаниях температуры. При определенных оптимальных значениях температура может влиять на скорость образования фермент-субстратного комплекса, вызывая ее увеличение. Это пример одной из многих других температурно-зависимых реакций, которые оказывают влияние на метаболические реакции в клетке. Однако такие изменения происходят в диапазоне микросекунд. Длительность кальциевых сигналов регистрируется в диапазоне секунд и, возможно, именно из-за значительного различия временных шкал существенных изменений в кальциевой динамике астроцитов не наблюдается.

Регуляция активности астроцитов метаболическими процессами мозга является одним из важных вопросов в нейробиологии, который не изучен в достаточном объеме. Уже ясно, что специфические энергетические субстраты, необходимые клеткам мозга на ранних стадиях постнатального развития, должны присутствовать в питательных средах, поэтому так важно контролировать наличие таких энергетических субстратов в детском питании. Если младенцев очень рано перевести с материнского молока на искусственное питание, возможно снижение активности астроцитов, в результате чего может замедлиться развитие всего мозга.

Метаболизм мозга на более поздних стадиях постнатального развития (более 10 дней) практически не зависит от добавления специфических энергетических субстратов. Поэтому при голодании и физических нагрузках, которые также приводят к повышению в мозге кетоновых тел, активность астроцитов не должна меняться. Наши данные тоже могут пролить свет на события, происходящие в мозге при понижении температуры. Астроциты при этом выступают в роли регуляторов нормального функционирования мозга, не меняя динамики параметров основной сигнальной системы. Это важно учитывать при исследованиях процессов переохлаждения человека и в трансплантологии.

Заключение. Кальциевая динамика астроцитов в разные периоды постнатального развития может служить методом оценки функциональной активности глиальных систем при моделировании метаболических нарушений мозга.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы «Уникальная научная установка для исследования информационных процессов в головном мозге с использованием методов оптогенетики», уникальный идентификатор проекта RFMEFI59114X0004, соглашение о предоставлении субсидии от 01.12.2014 №14.591.21.0004 между Министерством образования и науки РФ и ННГУ с использованием оборудования уникальной научной установки.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.