Новый биосовместимый материал на основе модифицированного твердофазным методом хитозана для лазерной стереолитографии

В последние годы активно развиваются исследования и разработки в области биомедицинского материаловедения, направленные на решение задач регенеративной медицины. Их актуальность, по данным статистики ВОЗ, обусловлена ростом числа травм и повреждений, чья терапия связана с использованием замещающих имплантатов. Известно, что восстановление нормальных функций живой системы посредством стимулирования роста ткани значительно эффективнее подходов, связанных с применением замещающих структур (протезирование и др.) [1]. Для формирования трехмерных структур, содержащих биоактивные компоненты, используют несколько различных методов, в том числе метод трехмерной печати [2] и метод селективного лазерного спекания [3]. Весьма перспективным для этих целей является метод лазерной стереолитографии, основанный на инициировании локальных пространственных сшивок между реакционно-способными звеньями макромолекул под действием лазерного излучения в УФ-области спектра. Этот метод позволяет создавать структуры заданной архитектоники на базе трехмерной компьютерной модели, которая может быть разработана с использованием как специального программного обеспечения, так и данных, полученных методами анализа пространственной структуры объекта in vivo (например, МРТ-данных дефектов тканей при создании соответствующих полимерных имплантатов) [4]. Методом лазерной стереолитографии уже были получены разнообразные трехмерные матриксы-носители (скаффолды) на основе желатина [5], гиалуроновой кислоты [6], фибрина [7]. Для успешного применения указанного метода в регенеративной медицине необходима разработка широкой номенклатуры новых биосовместимых фотополимеризующихся композиций.

Цель исследования — разработка нового биодеградируемого материала на основе хитозана, синтезированного твердофазным способом, а также создание на его основе биосовместимых трехмерных матриц-носителей клеток методом лазерной стереолитографии.

Материалы и методы

Твердофазное модифицирование хитозана. Твер­до­фазный синтез непредельного простого эфира хитозана — аллилхитозана (ХТ-А) — осуществляли действием на хитозан бромистого аллила (99%; Sigma-Aldrich, Германия) в отсутствие жидкой дисперсионной среды в условиях сдвигового деформирования в двухшнековом экструдере BerstorffZE40 (Германия). Экструдер оснащен однонаправленно вращающимися силовыми элементами шнеков, которые обеспечивают сжатие и сдвиг материала в тонком слое. Химическое взаимодействие компонентов в состоянии вынужденного пластического течения в этих условиях приводит к образованию продуктов с высоким выходом [8]. В соответствии с работой [9] использовали хитозан, полученный методом твердофазного синтеза путем щелочного деацетилирования хитина панцирей краба («ВОСТОК-БОР», Россия). Содержание остаточных ацетамидных (хитиновых) звеньев в образце исходного хитозана составляло 10%, средняя степень полимеризации звеньев хитозана в макромолекуле была 360 (М_w=60 кДa). На одно звено хитозана брали 0,5 моля алкилирующего агента и проводили обработку реакционных смесей при температуре –5°С. Продукты промывали изопропанолом и сушили в вакуумном шкафу при 50°С для полного удаления непрореагировавшего мономера.

Приготовление фотоотверждаемой композиции. Для получения фоточувствительной композиции готовили 5% раствор ХТ-А в 4% уксусной кислоте. Нерастворимую фракцию (немодифицированный хитин с высокой степенью кристалличности) отделяли центрифугированием (40 мин, 14 500 об./мин), после чего раствор фильтровали через мембрану с размером пор 0,45 мкм. Далее 120 мл раствора помещали на 1 ч в испарительный бюкс (35°С; 0,2 МПа) для удаления части растворителя, после чего вносили диакрилат полиэтиленгликоля (ПЭГ-ДА, Sigma-Aldrich, Германия) 15% мас. и перемешивали при комнатной температуре 30 мин. В полученный гидрогель вносили фото­инициатор Irgacure 2959, 1% мас. (BASF Kaisten AG, Германия). Перемешивание системы проводили при комнатной температуре в течение 2 ч до получения гомогенного раствора.

Подготовка образцов для клеточных испытаний. Приготовленную композицию наносили на поверхность покровных стекол диаметром 12 мм (площадь поверхности образцов — 1,13 см²). Покровные стекла перед нанесением гидрогеля промывали водой, помещали на 6 ч в 5% водный раствор соляной кислоты, затем в течение 20 мин отмывали в ультразвуковой бане дистиллированной водой. УФ-индуцированную сшивку гидрогелей производили в течение 120 мин при воздействии УФ-ртутной лампы ДРШ-100 (Россия). Были приготовлены материалы двух типов — чистый ХТ-А и ХТ-А со сшивающим агентом ПЭГ-ДА.

Клеточные испытания. Все образцы материалов перед проведением тестов стерилизовали 70% спиртом в течение 3 мин, после чего промывали стерильной культуральной средой DМЕМ/F-12 с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Исследование биосовместимости в условиях in vitro проводили с использованием вытяжек и путем культивирования клеток на поверхности самих материалов.

Модельной средой для приготовления вытяжек являлась культуральная среда DМЕМ/F-12 с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Вытяжки получали с соблюдением асептики в течение 3 сут при 37°С, на каждый материал делали три пробы. Соотношение площади поверхности материала и объема модельной среды составляло 1,13 см²/1 мл среды. Цитотоксическое действие растворимых примесей, содержащихся в вытяжках материалов, на фибробласты линии NCTC L929 оценивали с помощью МТТ-теста согласно описанной процедуре [10].

Для определения адгезионных характеристик материалов и их взаимодействия с субстратзависимыми клетками были использованы мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из абортивного аутопсийного материала плодов человека по методике, разработанной ранее [11]. Культивирование клеток проводили в среде DMEM/F-12 (1:1, Life technologies, США), содержащей также: 10% FBS (Fetal Bovine Serum, HyClone, США), 2 ммоля L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, раствор витаминов («ПанЭко», Россия) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. По мере роста и достижения субконфлюентного состояния клетки обрабатывали 0,25% раствором трипсин-ЭДТА и производили их пересев (пассаж) в новые флаконы (клеточную массу одного флакона разделяли на два флакона). Для проведения исследований использовали клетки на 4-м пассаже.

Клетки высевали на поверхность исследуемых образцов с плотностью 50 тыс./см² и культивировали в течение 7 и 23 дней. Оценку морфологии и жизнеспособности клеток проводили на микроскопе Axiovert 200 (Karl Zeiss, Германия) с использованием флюоресцентного окрашивания набором красителей L-7007 LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Kit (Invitrogen, США).

По завершении культивирования проводили подготовку образцов для исследования с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), для чего образцы промывали в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) и фиксировали 12 ч при температуре 5°С в 2,5% забуференном растворе глутарового альдегида. После фиксации образцы геля промывали фосфатным буферным раствором (PBS) и дегидратировали при 4°С последовательно в батарее водного раствора этанола возрастающей концентрации: 50, 75, 80, 90% и в абсолютном этаноле на заключительном этапе. На каждой стадии образцы дважды погружали на 5 мин в соответствующий раствор этилового спирта. Для удаления спирта образцы переносили на 30 мин в гексаметилдисилазан (HMDS), после чего высушивали на воздухе.

Методика проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для выделения общей матричной РНК из клеток использовали набор «Выделение полноразмерной поли(А) мРНК на магнитных частицах» («Силекс», Москва). Полученную мРНК применяли для синтеза комплементарной ДНК с помощью набора «Синтез первой цепи кДНК (олиго(дТ)15)» («Силекс», Москва), а кДНК, полученную в результате реакции обратной транскрипции, — в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.

Реакцию ПЦР выполняли на приборе ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, США) в присутствии интеркалирующего красителя SybrGreen и референсного красителя ROX. Исследовали экспрессию 22 генов-маркеров, отображающих процесс дифференцировки по остеогенному пути (см. таблицу). Маркерные гены были выбраны из базы данных для PCR Arrays QIAGEN (Германия) для определения остеогенеза (http://www.sabiosciences.com, «human osteogenesis PCR Array» PAHS-026Z), а также базы данных Gene Ontology (ID: 000164) [12, 13]. Праймеры для каждого маркерного гена подбирали с помощью программы PrimerEpress (Applied Biosystems, США).

Гены, использовавшиеся для оценки уровня дифференцировки по остеогенному типу

Концентрация праймеров в реакциях по оптимизации составляла 0,05 пмоль/мкл, концентрация ионов Mg²⁺ — от 1,5 ммоль, концентрация фермента — 0,2 ед. на 20 мкл реакции. Длина праймеров составляла в среднем 24 нуклеотида. Температура отжига — 60°С, длина амплифицируемого фрагмента — 94–100 пар нуклеотидов. Для проверки специфичности реакции продукты амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозе, а также по кривым температурной диссоциации ампликонов.

Анализ данных, полученных с помощью ПЦР в режиме реального времени, производили по пороговой флюоресценции методом ΔΔС(Т) с помощью web-ресурса для анализа данных PCR Arrays QIAGEN (http://www.sabiosciences.com).

В качестве референса использовали экспрессию генов актина (ACT), большой субъединицы рибосомального белка (RPLP0) и глицеальдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH).

Обработка данных. Статистическую обработку результатов клеточных испытаний и набухания проводили с помощью программы Origin, за ошибку принимали среднеквадратичное отклонение от среднего значения, за достоверные данные принимали различия по U-критерию Манна–Уитни при р<0,05.

Лазерная стереолитография. Все образцы были изготовлены на экспериментальном макете лазерного стереолитографа ЛС-120 (ИПЛИТ РАН, Россия) с использованием HeCd-лазера (длина волны — 325 нм, мощность излучения — 15 мВт). Толщина слоя при выращивании образцов составляла 200 мкм. Скорость формирования слоя определяли исходя из мощности лазера и экспериментально установленных технологических параметров отверждения композиции: E_c=50 мДж/см² (параметр, характеризующий пороговое значение экспозиционной дозы облучения для начала формирования твердой полимерной пленки) и D_p=0,15 мм (параметр, характеризующий критическую толщину пленки).

Определение характеристик набухания. Характе­ристики набухания трехмерных структур изучали в соответствии с разработанным алгоритмом. Полученные трехмерные структуры (без предварительной осушки) по описанной выше методике помещали на 2 ч в этиловый спирт (ректификат) или 25% водный раствор аммиака. После этого образцы помещали в дистиллированную воду или PBS, в которых их выдерживали в течение 9 дней. За это время происходило набухание скаффолда до максимального значения содержания воды. В процессе набухания растворитель меняли каждые 48 ч для моделирования поведения структур in vivo. Перед взвешиванием структуры на 10 мин помещали на нетканый материал для удаления излишней влаги. Процедуру повторяли для трех идентичных образцов до постоянного значения массы. Степень набухания (SWR) определяли по формуле:

где W_d — масса матрицы после проведения процесса лиофильной сушки; W_s — масса набухшей матрицы.

Набухание также измеряли в фосфатно-солевом буфере и дистиллированной воде без использования дополнительных растворителей.

Результаты и обсуждение

Синтез реакционно-способных полимерных сис­тем на основе хитозана. Хитозан — катионный полисахарид, имеющий практически в каждом элементарном звене свободную первичную аминогруппу. Это определяет биологическую активность, а также делает его наиболее интересным объектом в ряду полисахаридов для проведения химического модифицирования. Для того чтобы повысить реакционную способность функциональных групп хитозана в процессах сшивания при воздействии лазерного излучения, в его структуру были введены непредельные группы путем взаимодействия с бромистым аллилом в условиях сдвиговых деформаций в экструдере. Твердофазный синтез, позволяющий проводить процессы химического модифицирования полимеров в отсутствие жидких дисперсионных сред, катализаторов и инициаторов процессов, был выбран как наиболее приемлемый метод для решения проблемы термодинамической несовместимости гидрофильного хитозана и гидрофобного модификатора. Аминогруппы хитозана намного реакционно-способнее его гидроксильных групп в некатализируемых реакциях нуклеофильного замещения, тогда как реакция в щелочной среде приводит к образованию смешанных O- и N-замещенных аллилпроизводных [14, 15]. В выбранных условиях проведения синтеза, по данным ядерно-магнитно-резонансной и ИК-фурье спектроскопии, замещение происходит в основном по аминогруппам хитозана согласно приведенной ниже схеме:

Анализ спектра протонного магнитного резонанса образца аллилхитозана в растворе D₂O с добавлением 1% HCl (полученного на спектрометре Bruker Avance II 300, Германия) показал, что содержание звеньев с аллильными фрагментами составляет 8–10%. Химический сдвиг углерода аллильной метиленовой группы (при 53 м.д.) в ¹³C–{¹H} APT (75,5 МГц) спектре образца свидетельствует о его связи с атомом азота и указывает на преимущественное N-алкилирование субстрата. При этом модифицированный гидрофобными ненасыщенными заместителями хитозан сохранил характерную для исходного полимера растворимость в кислых водных средах. Электронные спектры поглощения 1% растворов образцов исходного хитозана и аллилхитозана в 0,1 М HCl регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV 2501 PC (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см. Для полученных спектров было проведено математическое разделение полос, относящихся к поглощению и рэлеевскому рассеянию, а затем выполнено разложение спектров поглощения на отдельные полосы. Спектры поглощения аллилхитозана лежат в области 200–420 нм и содержат три интенсивные полосы с максимумами 264, 301 и 351 нм, соотношение высот которых составляет 0,3/1/0,1 (в спектре исходного хитозана присутствуют полосы 252, 299 и 346 нм с соотношением высот 1/1/0,4). Таким образом, в спектре продукта аллилирования преобладает компонент с максимумом 301 нм, причем его интенсивность увеличена в 2 раза по сравнению с исходным хитозаном, а интенсивность двух других полос значительно снижена. При разбавлении растворов хитозана и аллилхитозана форма спектров электронного поглощения не меняется, что свидетельст­вует об отсутствии агрегации в растворах обоих полимеров в диапазоне концентраций 0,125–1%.

Биосовместимость и биологическая активность композиции на основе хитозана. Исследование метаболической активности клеток линии NCTC L929 в присутствии вытяжек из материалов ХТ-А и ХТ-А с ПЭГ-ДА было проведено с использованием МТТ-теста, который основан на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, количество которого определяется фотометрически по оптической плотности раствора при облучении источником света с длиной волны 540 нм. Исследование показало отсутствие значимых различий с контролем у трехсуточных вытяжек из образцов, что свидетельствует об отсутствии водорастворимых токсических компонентов в разработанных композициях (рис. 1).

Рис. 1. Метаболическая активность клеток линии NCTC L929 по результатам МТТ-теста при инкубации 48 ч с трехсуточными вытяжками из материалов: 1 — аллилхитозан; 2 — аллилхитозан + ПЭГ-ДA; 3 — на поверхности покровного стекла

Для определения адгезионных характеристик материалов и их взаимодействия с субстратзависимыми клетками были использованы МСК человека. Исследование морфологических особенностей и жизнеспособности МСК человека, культивируемых на поверх­ности ХТ-А и ХТ-А с ПЭГ-ДА, показало, что клеточная гибель не превышает 1–2%. Клетки распластываются и пролиферируют на поверхности обоих исследуемых материалов. Морфология клеток не имеет существенных различий с контролем, однако плотность клеточного монослоя на покровном стекле на 7-е сутки значительно выше, чем на полимерных пленках (рис. 2–4). Для оценки влияния физико-химических характеристик материалов на дифференцировочную активность МСК человека был определен фенотипический профиль клеток на разных этапах культивирования. Поскольку для отображения процесса дифференцировки по остео­генному пути обычно используют анализ 22 основных генов-маркеров (см. таблицу) [12, 13], то в настоящей работе методом ПЦР в режиме реального времени изучали их экспрессию.

Рис. 2. Внешний вид мезенхимальных стволовых клеток человека при инкубации на поверхности аллилхитозана: 1-е сутки инкубации (а, б); 7-е сутки инкубации (в–е). Окраска клеток Syto 9 (а, в); окраска ядер мертвых клеток пропидий йодом (б, г); микрофотографии сканирующей электронной микроскопии (д, е)

Рис. 3. Внешний вид мезенхимальных стволовых клеток человека при инкубации на поверхности пленки аллилхитозана + ПЭГ-ДA: 1-е сутки инкубации (а, б); 7-е сутки инкубации (в–е). Окраска клеток Syto 9 (а, в); окраска ядер мертвых клеток пропидий йодом (б, г); микрофотографии сканирующей электронной микроскопии (д, е)

Рис. 4. Внешний вид мезенхимальных стволовых клеток человека при инкубации на поверхности покровного стекла (контроль): 1-е сутки инкубации (а, б); 7-е сутки инкубации (в–е). Окраска клеток Syto 9 (а, в); окраска ядер мертвых клеток пропидий йодом (б, г); микрофотографии сканирующей электронной микроскопии (д, е)

Уже на 7-е сутки культивирования клеток на стекле и исследуемых полимерах наблюдаются различия в степени активации экспрессии генов-маркеров дифференцировки по остеогенному пути (рис. 5, а). В контроле (культивирование на стекле) и на материале аллилхитозан происходит активация экспрессии и наблюдается повышенный уровень мРНК генов ALPL, FGFR1, TWIST, BMP1, IGFR1, VDR и TGFBR1. В то же время клетки, культивируемые на материале ХТ-А с ПЭГ-ДА, слабо экспрессируют исследуемые гены, в них только повышен уровень BGLAP и SMAD 5. На этом этапе культивирования на всех материалах в клетках не обнаруживается транскрипции гена BMP7.

Рис. 5. Уровни экспрессии генов в мезенхимальных стволовых клетках человека, культивируемых в течение 7 сут (а) и 23 сут (б) на поверхности материалов: S и S2 — ХТ-А; T и T2 — ХТ-А с ПЭГ-ДА; контроль — покровное стекло

Более длительное культивирование (23 дня) клеток на исследуемых материалах несколько меняет картину уровня транскрипции генов (рис. 5, б). У клеток на всех материалах исчезает экспрессия TNF. На образцах ХТ-А сохраняется высокий уровень экспрессии лишь небольшого числа генов, по сравнению с клетками, культивируемыми на стекле. В контрольной группе в целом сохраняется прежний паттерн транскрипции маркерных генов, но большинство генов его значительно усиливают. При этом количество мРНК генов IGFR1, VDR и TGFBR1 снижается. Культивирование клеток на образцах ХТ-А с ПЭГ-ДА стимулирует транскрипцию генов cнесколько другим паттерном, нежели в контроле. В этих клетках повышен уровень экспрессии BGLAP, FGF-2, SPP1, SMAD5, COL3A, TWIST1, появляется BMP7, а транскрипция генов IGF2, EGFRи VDR выражена слабо.

Таким образом, аллилхитозан уже на начальных этапах культивирования клеток индуцирует гены дифференцировки в остеогенном направлении, тогда как материал ХТ-А с ПЭГ-ДА проявляет это свойство только при длительном культивировании клеток.

Матриксы, полученные методом лазерной стереолитографии. Полученные методом лазерной стереолитографии матриксы на основе ХТ-А представляют собой структурно-однородный материал, образцы выполнены в виде скрещенных между собой спиралей (рис. 6) или двух наложенных друг на друга окружностей с лучами, направленными в центр, и отверстием (форма колеса). При слабых недлительных механических воздействиях исходные матриксы полностью восстанавливают свою прежнюю форму. При высыхании прочность образцов возрастает, однако уменьшается упругость и увеличивается хрупкость материала.

Рис. 6. Внешний вид структурированных матриксов; 1 деление линейки = 1 мм

Метод регулирования степени набухания разработанных трехмерных структур. Важной задачей при создании материалов для биомедицинских трехмерных структур является разработка композиций, позволяющих регулировать степень набухания матриц на их основе при использовании in vivo [16]. Проведение заместительной терапии при введении таких структур в поврежденные ткани при выполнении хирургической операции может не только стимулировать процесс заживления, но и снижать отечность, забирая из места травмы излишнюю биожидкость [17]. Для представленных в настоящей работе материалов и структур на их основе был разработан подход, позволяющий регулировать степень набухания скаффолдов в пределах от 490 до 630% мас.

Алгоритм исследования набухания представлен в разделе «Материалы и методы». Высокие значения степеней набухания (до 630%) были получены для матриксов, предварительно выдержанных в аммиаке и потом помещенных в дистиллированную воду. При использовании в качестве растворителя PBS для образцов, выдержанных 2 ч в этаноле, среднее значение степени набухания составляло 630%. Статистическая обработка результатов показывает, что эмпирические значения U_эмп данных образцов находятся в зоне незначимости (рис. 7, столбцы 1, 3, 4 соответственно).

Рис. 7. Степень набухания полимерных матриксов в различных растворителях: дистиллированной воде (1), воде после выдерживания в этаноле (2), воде после выдерживания в аммиаке (3), PBS (4), PBS после выдерживания в этаноле (5), PBS после выдерживания в аммиаке (6)

Для снижения степени набухания в буфере образец предварительно обрабатывали аммиаком. При этом хитозан переходил в основную форму. Отсутствие ацетатного противоиона на аминогруппе снижает сорбционную способность матриксов относительно жидкости, помогая тем самым убрать излишнее набухание.

Аналогичное значение SWR было получено для матриксов, набухших в дистиллированной воде после предварительной выдержки в этиловом спирте (рис. 7, столбцы 2 и 5), которая приводила к незначительному сжатию структуры (в сравнении с обработкой аммиаком). Это происходит вследствие вытеснения из полимера молекул «связанной» воды молекулами этанола. Трехмерные структуры, полученные на основе модифицированного хитозана, в том числе исходный образец, а также образцы после лиофильной сушки и предварительного выдерживания в PBS и NH₄OH представлены на рис. 8.

Рис. 8. Трехмерные структуры, полученные на основе модифицированного хитозана, в том числе: исходный образец (1), образцы после лиофильной сушки и предварительного выдерживания в PBS (2), NH4OH и PBS (3), C2Н5ОН и PBS (4); 1 деление линейки = 1 мм

Заключение. Созданы реакционно-способные производные хитозана в результате его взаимодействия с бромистым аллилом в условиях сдвиговых деформаций в экструдере при отсутствии растворителей. На основе полученных соединений в ходе проведения УФ-индуцированной сшивки в присутствии фотоинициатора и сшивающего агента сформирован ряд пленок. Исследование метаболической активности клеток линии NCTC L929 с использованием МТТ-теста показало, что рассматриваемые образцы не содержат токсичных для клеток млекопитающих водорастворимых компонентов. Новые материалы аллилхитозан и аллилхитозан с диакрилатом полиэтиленгликоля являются биосовместимыми, в равной степени поддерживают адгезию, распластывание и пролиферативную активность мезенхимальных стволовых клеток человека, но имеют существенные различия в степени и характере активации экспрессии генов-маркеров дифференцировки по остеогенному пути. На основе разработанного материала методом лазерной стереолитографии получены трехмерные матрицы с контролируемой степенью набухания в физиологическом растворе.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда — проект №15-13-00140 (в части лазерной стереолитографии и исследований цитотоксичности скаффолдов) и Российского фонда фундаментальных исследований — проект №14-29-07234-офи_м (в части синтеза модифицированного хитозана).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.