Влияние Мексидола на мозговой натрийуретический пептид кардиомиоцитов в постреперфузионном периоде в эксперименте

Мозговой натрийуретический пептид (МНП), открытый в 1988 г., входит в систему натрийуретических пептидов, способных снижать артериальное давление и поддерживать водно-солевой баланс путем стимуляции диуреза и натрийуреза [1]. МНП является антагонистом ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [1, 2]. Ранее считалось, что сердце — это основной источник МНП: сначала пептид был выявлен в желудочках, позднее — в секреторных гранулах предсердий. По последним данным, МНП обнаружили в фибробластах и эндотелиоцитах сети коронарных артерий [3, 4].

В настоящее время МНП активно изучается в связи с его прогностической значимостью в клинической практике в качестве эффективного маркера таких заболеваний, как инфаркт миокарда, ишемия, аритмия, острая декомпенсированная сердечная недостаточность, атеросклероз [5–8]. Исследуются возможности его терапевтического применения [9–14]. В связи с этим изучение синтеза и выброса МНП в условиях сердечно-сосудистой патологии является актуальной проблемой.

В терапии постреанимационных осложнений применяют так называемые антигипоксанты метаболического типа, действия которых направлены на коррекцию внутриклеточных нарушений в условиях гипоксии. Среди таких фармакологических средств широкое распространение получил отечественный препарат Мексидол (сукцинатсодержащее производное 3-оксипиридина) [15, 16]. В клинике и в экспериментальных исследованиях показано нейро- и кардиопротекторное действие Мексидола в постреперфузионном периоде (ПРП) [15–17]. Ранее нами было изучено влияние Мексидола на предсердный натрийуретический пептид (ПНП) в изолированном перфузируемом сердце и в условиях целостного организма через час после ПРП. Установлено выраженное положительное влияние на процессы образования и выведения пептида [18, 19]. Считается, что МНП и ПНП имеют большое сходство: активируют одинаковые рецепторы органов-мишеней, которые через каскад цГМФ-зависимых клеточных реакций реализуют их физиологические эффекты. На синтез обоих пептидов влияют практически одни и те же факторы: повышение артериального давления, гипоксия, активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и т.д. [1].

Различие между ПНП и МНП состоит в том, что ПНП начинает выбрасываться в кровь в ответ на кратковременное повышение артериального давления и быстро инактивируется эндопептидазой. Для МНП необходимо более длительное воздействие, и время циркуляции его в крови больше, вследствие чего этот пептид получил широкое распространение в клинике в качестве прогностического агента [20].

Все вышесказанное способствовало возникновению научного интереса к исследованию воздействия Мексидола на синтез и выведение МНП.

Цель исследования — оценить влияние Мексидола на процессы накопления и выброса мозгового натрий­уретического пептида в гранулах кардиомиоцитов в постреперфузионном периоде у крыс.

Материалы и методы. Экспериментальное исследование проводили на 25 аутбредных крысах-самцах массой 220–250 г. в соответствии с правилами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Тотальную ишемию по В.Г. Корпачеву моделировали 10-минутным пережатием сердечно-сосудистого пучка [21]. Всех животных разделили на 5 групп:

1-я группа (n=5) — интактные животные;

2-я группа (n=5) — контрольная, 60 мин ПРП;

3-я группа (n=5) — 60 мин ПРП + Мексидол;

4-я группа (n=5) — контрольная, 60 сут ПРП;

5-я группа (n=5) — 60 сут ПРП + Мексидол.

В 3-й и 5-й группах Мексидол вводили после реанимации внутрибрюшинно в течение первого часа дробно в дозе 25 мг/кг массы тела через каждые 20 мин. Как известно, терапевтические эффекты Мексидола выявляются в диапазоне доз от 10 до 300 мг/кг: препарат в дозе 25 мг/кг оказывает выраженное вазопротекторное и кардиопротекторное действие [16].

Электронно-микроскопический анализ образцов ткани правого предсердия проводили по стандартной методике [22]. Иммуноцитохимические реакции для выявления локализации МНП осуществляли на ультратонких срезах с помощью поликлональных антител Rabbit anti-Brain Natriuretic Peptide-32 (Rat) Serum (Peninsula Laboratories Inc., США) и антител Protein-A/Gold (15 nm) (EM Grade, Electron Microscopy Sciences, США). Срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца и анализировали в электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI, США). По классификации гранул секреторных кардиомиоцитов выделяли два типа гранул: А-тип — зрелые, запасающие и В-тип, растворяющиеся [23]. Гранулы считали в полях зрения (38×38 мкм). Статистическую обработку проводили с использованием программы Statistica 10.0, применяли критерий Манна–Уитни (р<0,05).

Результаты

Через 60 мин ПРП количественный анализ гранул секреторных кардиомиоцитов правого предсердия животных 3-й группы (60 мин ПРП + Мексидол), содержащих МНП-иммунореактивный материал, выявил статистически значимое увеличение гранул А-типа на 93%, В-типа — на 147% по сравнению с интактными животными (рис. 1). Во 2-й группе (60 мин ПРП) достоверных изменений не обнаружено.

---

Рис. 1. Количественное распределение гранул с мозговым натрийуретическим пептидом у интактных и экспериментальных животных

---

В этот период в 3-й группе изменение ультраструктуры секреторных кардиомиоцитов проявлялось в незначительном просветлении матрикса митохондрий и расширении цистерн саркоплазматического ретикулума. Ядра содержали эухроматин, в саркоплазме находилось значительное количество цито­плазматических гранул (рис. 2). Во 2-й группе преобладали митохондрии в набухшем состоянии, содержание цитоплазматических гранул визуально было меньше, чем в 3-й группе, а саркоплазматический ретикулум был расширен в большей степени (рис. 3).

---

Рис. 2. Ультраструктура кардиомиоцита правого предсердия крысы через 60 мин постреперфузионного периода с применением Мексидола: Мх — митохондрии; ЦГ — цито­плазматические гранулы; ×28 000

---

Рис. 3. Ультраструктура кардиомиоцита правого предсердия крысы через 60 мин постреперфузионного периода: Мх   — митохондрии; СПР — саркоплазматический ретикулум; ×14 000

---

Через 60 сут ПРП количественный анализ гранул кардиомиоцитов в 5-й группе (60 сут ПРП + Мексидол) показал увеличение всех типов гранул, содержащих МНП, по сравнению с показателями остальных групп. Количество гранул А-типа возросло по сравнению с группой интактных животных более чем в 3 раза, В-типа — почти в 4,5 раза (см. рис. 1). В 4-й группе (60 сут ПРП) содержание секреторных гранул было повышенным: на 33% — гранул А-типа и на 51% — гранул В-типа.

По сравнению с результатами 3-й группы (60 мин ПРП + Мексидол) количество гранул в 5-й группе увеличилось более чем в 2 раза: число гранул А-типа — на 118%, гранул В-типа — на 119%. Интересно отметить, что в 4-й группе число А-гранул с МНП также возросло относительно раннего ПРП (2-я группа) на 35%, при этом количество В-гранул достоверно не изменилось.

В этот период в миокарде правого предсердия животных 5-й группы отмечалась выраженная синтетическая активность секреторных кардиомиоцитов: большое количество гранул с пептидом, гипертрофия комплекса Гольджи (рис. 4). В большинстве клеток ядра содержали эухроматин и ядрышки; цитоплазматических гранул было визуально меньше, чем у животных 3-й группы (60 мин ПРП + Мексидол). В межклеточном пространст­ве выявлено незначительное количество коллагеновых волокон.

---

Рис. 4. Ультраструктура кардиомиоцита правого предсердия крысы через 60 сут постреперфузионного периода с применением Мексидола: КГ — комплекс Гольджи; Мх — митохондрии; Я — ядро; ×18 000

---

В миокарде животных 4-й группы среди кардиомио­цитов встречались клетки как в состоянии некроза, так и апоптоза. В некоторых кардиомиоцитах выявлено расхождение вставочных дисков, имели место набухание митохондрий, образование вакуолей, содержание цитоплазматических гранул было меньше, чем у животных 5-й группы (рис. 5). В межклеточном пространст­ве отмечалось значительное увеличение компонентов соединительной ткани.

---

Рис. 5. Ультраструктура кардиомиоцита правого предсердия крысы через 60 сут постреперфузионного периода: В — вакуоли; ВД — вставочный диск; К — коллагеновые волокна; ×5600

---

Обсуждение. Через 60 мин ПРП в 3-й группе с введением Мексидола увеличение зрелых и растворяющихся форм гранул с МНП свидетельствовало об его активном накоплении и высвобождении. В то же время совпадение количественных показателей с контрольной серией, без введения препарата, указывало на отсутствие влияния Мексидола на синтез и выброс пептида в этот период. По-видимому, факторы ишемии и реперфузии через активацию HIF (hypoxia inducible factors) воздействовали на МНП в условиях раннего ПРП и оставались основными как в контрольной, так и в опытной группах животных. Установлено, что HIF-1α запускает промотор в последовательности, кодирующей МНП, и стимулирует транскрипцию его мРНК [24–26]. По данным T. Ogawa, A. De Bold [1] известно, что ответ МНП на воздействие различных патологических факторов и динамика его плазменной концентрации во многом близки с реакцией ПНП. В ранее проведенных нами исследованиях [19] было установлено выраженное влияние Мексидола на синтез и секрецию ПНП через 60 мин после восстановления кровообращения в аналогичных условиях. С одной стороны, это может свидетельствовать о значительных отличиях в механизмах запуска образования и выброса обоих пептидов. С другой стороны, не противоречит данным авторов [1], показывающих более медленный ответ МНП на различные факторы и необходимость более длительного их воздействия. Морфологическая картина отражала вазопротекторное и цитопротекторное действия Мексидола на миокард, что согласовывалось с данными других исследователей [17]. Отсутствие агрегации эритроцитов, сохранение ультраструктуры кардиомиоцитов (незначительное расширение цистерн саркоплазматического ретикулума, энергизованное состояние митохондрий, большое количество цитоплазматических гранул) были обусловлены антиоксидантной активностью 3-оксипиридинов и антигипоксическим свойством янтарной кислоты. Сукцинат, поступая во внутриклеточное пространство, окислялся дыхательной цепью в условиях гипоксии; производные 3-оксипиридинов снижали микровязкость мембран, стабилизируя липидный компонент, ингибировали процессы перекисного окисления липидов и оказывали влияние на активность мембраносвязанных ферментов [16]. Интересно отметить, что похожая морфологическая картина выявлена нами в кардиомиоцитах изолированного по Лангендорфу сердца крысы с введением Мексидола такой же дозы — 25 мг/кг [18]. В нашем эксперименте на крысах было доказано функ­ционирование сердца на интракардиальном уровне в раннем ПРП [27]. По-видимому, действие препарата в условиях целостного организма в этот период осуществлялось непосредственно на внутриорганном и внутриклеточном уровнях [18].

Через 60 сут после эксперимента большое количество гранул обоих типов в правом предсердии 5-й группы животных (введение Мексидола) и статистически значимое отличие от показателей всех остальных групп свидетельствовали о выраженном стимулирующем эффекте препарата на накопление и выброс МНП в условиях отдаленного ПРП. Можно предположить, что Мексидол, введенный животным после реанимации, влияет на МНП двумя путями. С одной стороны, препарат оказывает прямое пролонгированное действие на синтетический аппарат сердца, о чем свидетельствует гипертрофия комплекса Гольджи и значительное количество гранул. С другой стороны, низкое по сравнению с контрольной серией содержание коллагеновых волокон в межклеточном пространстве и отсутствие некротически измененных кардиомиоцитов указывают на выраженный кардиопротекторный эффект Мексидола на миокард, который также может способствовать усилению процессов синтеза и секреции МНП. Ранее в наших работах по исследованию ПНП [28] выявлено значительное увеличение всех типов гранул с пептидом в миокарде крыс в условиях отдаленного ПРП. Увеличение накопления и выброса ПНП происходило на фоне высокой синтетической и пролиферативной активности фибробластов, обсуждался кардиопротекторный эффект пептида, способствующий снижению степени развития кардиосклероза. Обнаруженное в контрольной серии без введения Мексидола большое количество гранул с МНП наводит на мысль о сходстве действий ПНП и МНП в этих условиях. По данным авторов [29], МНП играет важную роль в процессах ремоделирования миокарда у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Экспериментально доказано [30], что МНП ингибирует синтез коллагена, усиливает действие металлопротеиназ, подавляет пролиферацию кардиальных фибробластов. Сниженное количество соединительнотканного компонента в миокарде 5-й группы животных с введенным ранее Мексидолом на фоне повышенного содержания гранул с МНП подтверждает важную роль пептида в ремоделировании миокарда в качестве антифиброзного фактора.

Таким образом, экспериментальное исследование МНП в раннем и отдаленном ПРП на уровне целостного организма с помощью метода количественного анализа иммуномеченых гранул предсердных миоцитов позволило выявить пролонгированный положительный эффект Мексидола в дозе 25 мг/кг массы тела на синтез и выброс МНП и подтвердить кардиопротекторные свойства данного препарата. Полученные результаты вносят определенный вклад в изучение взаимодейст­вия МНП с лекарственными средствами в условиях сердечно-сосудистой патологии, что, несомненно, имеет научную и практическую значимость.

Заключение. Мексидол оказывает пролонгированное влияние на мозговой натрийуретический пептид, значительно усиливая его накопление и выведение в предсердных кардиомиоцитах крысы в отдаленном постреперфузионном периоде, что вызывает дополнительный кардиопротекторный эффект, уменьшая развитие кардиосклероза.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках ведомственной НИР «Системные и молекулярные механизмы регуляции физиологических функ­ций в норме и патологии» (2015–2017 гг.).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.