Нейротропное действие нейротрофического фактора BDNF на разных этапах развития культур диссоциированных клеток гиппокампа in vitro
Цель исследования — оценить нейротропное действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro.
Материалы и методы. Материалом для исследований служили культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученные от эмбрионов мыши линии C57BL/6 18-го дня гестации. Культивирование первичных культур выполняли на мультиэлектродных матрицах MED64 (Alpha Med Science, Япония). Аппликацию нейротрофического фактора в концентрации 0,1; 1; 10 нг/мл в среду культивирования осуществляли на 7, 14 и 21-й дни развития культур in vitro. Регистрация базового уровня спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур проводилась в течение 10 мин до аппликации вещества. После добавления нейротрофина регистрация активности осуществлялась непрерывно в течение 35 мин. Повторная 10-минутная регистрация выполнялась через 2 и 24 ч после добавления нейротрофина.
Результаты. Показано, что нейротрофический фактор BDNF модулирует спонтанную биоэлектрическую активность культур диссоциированных клеток гиппокампа начиная с 14-го дня развития in vitro. Эффект проявляется в увеличении длительности сетевой пачки и реструктуризации паттерна спонтанной сетевой активности при отсутствии изменений в количестве спайков в пачке. Нейротропный эффект BDNF наблюдается через 10–15 мин после аппликации с продолжительностью действия не менее 2 ч.
Заключение. Применение нейротрофического фактора BDNF в концентрации 0,1; 1 и 10 нг/мл оказывает транзиторный нейротропный эффект на спонтанную биоэлектрическую активность зрелых нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа начиная с 14-го дня развития in vitro. Изучение механизмов участия BDNF в синаптической передаче позволит прояснить роль нейротрофина в таких высших функциях ЦНС, как научение и память.
Изучение механизмов регуляции биологических процессов, наблюдаемых в центральной нервной системе (ЦНС), является одной из значимых задач современной биологии и медицины. Нейротрофины — одни из важнейших регуляторных белков, обеспечивающих основные процессы жизнедеятельности человека и животных [1]. Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) является ключевым представителем данного семейства белков, функции которого непосредственно связаны с работой ЦНС. Основную роль данный нейротрофин играет на стадии пренатального развития, принимая участие в процессах нейрогенеза, обеспечивая активную дифференцировку и пролиферацию нейронов различного фенотипа и локализации. Однако особый интерес представляет действие BDNF на функционирование ЦНС в постнатальный период [2]. Недавними исследованиями [3] показана возможность модулирования нейротрофическим фактором синаптической передачи в гиппокампе и некоторых отделах коры головного мозга. В результате взаимодействия BDNF с высокоаффинным тирозинкиназным рецептором В (TrkB) происходит запуск нескольких сигнальных механизмов, обеспечивающих действие нейротрофического фактора на пресинаптическую и постсинаптическую передачу сигнала в клетке. BDNF способен активировать потенциалзависимые натриевые, калиевые каналы, повышать уровень экспрессии GABAА-рецепторов, а также фосфорилирования NR1- и NR2B-субъединиц NMDA-рецепторов, тем самым влияя на эффективность синаптической передачи. Кроме того, BDNF принимает участие в формировании синаптической пластичности и в процессах обучения и памяти [4, 5]. Однако в связи с недостаточностью знаний о роли и механизмах действия BDNF на функционирование нейронов на сетевом уровне в процессе их развития, а также об участии нейротрофина в гомеостатической пластичности очевидна необходимость дальнейшего исследования.
Цель исследования — оценить нейротропное действие нейротрофического фактора головного мозга на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro.
Материалы и методы
Культивирование диссоциированных клеток гиппокампа. Материалом для исследований служили культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученных от 18-дневных эмбрионов мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в приказе Минздрава России №267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации».
С целью регистрации основных электрофизиологических показателей активности нейронных сетей культивирование клеток проводилось на мультиэлектродных матрицах MED64 (Alfa Med Science, Япония).
Ферментативную диссоциацию клеток эмбрионального гиппокампа выполняли при помощи обработки гиппокампа 0,25% раствором трипсина (Gibco, США). Культивирование первичных культур осуществляли в нейробазальной среде NeurobasalTM (Invitrogen, США) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen, США), L-глутамином (Invitrogen, США), эмбриональной телячьей сывороткой («ПанЭко», Россия) согласно ранее разработанному протоколу [6] в течение 30 дней in vitro на мультиэлектродной матрице. Перед посадкой клеток мультиэлектродные матрицы обрабатывали положительно заряженным гидрофильным веществом — полиэтиленимином (Sigma, Германия) для повышения адгезии клеток на их поверхность. Исходная плотность культуры на матрице составляла 9000 кл./мм2. Жизнеспособность культур поддерживалась в условиях СО2-инкубатора (MCO-18AIC, Sanyo, Япония) при температуре 35,5°С и газовой смеси, содержащей 5% СО2 [7].
Схема эксперимента. BDNF апплицировали на 7-, 14- и 21-й дни развития культур in vitro. В 1-й группе культур BDNF добавляли в культуральную среду в концентрации 0,1 нг/мл, во 2-й группе — 1 нг/мл, в 3-й группе — 10 нг/мл. В качестве контроля использовали соответствующие концентрации раствора альбумина в фосфатно-солевом буфере PBS (phosphate buffered saline).
Регистрация базового уровня спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур проводилась в течение 10 мин до аппликации вещества. После добавления нейротрофина регистрация активности осуществлялась непрерывно в течение 35 мин. Повторная 10-минутная регистрация проводилась через 2 и 24 ч после добавления нейротрофина (рис. 1).
 Рис. 1. Схема регистрации спонтанной биоэлектрической активности культур диссоциированных клеток гиппокампа на разных стадиях развития in vitro
|
Для получения данных и их первичного анализа использовали набор программного обеспечения ConductorTM (Alpha Med Science, Япония). Анализ сетевой активности нейронов проводили с помощью разработанного в программной среде MATLAB оригинального пакета алгоритмов MEAMAN (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2012611190).
Детектирование спайков (внеклеточных потенциалов действия) осуществляли по следующему алгоритму: выбиралась граница, равная 8σ, где σ — среднеквадратичное число. При условии превышения амплитудой спонтанной активности данного порога событие считалось спайком, без превышения активности распознавалось как шум и не учитывалась при анализе данных. Исследовались основные характеристики спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети: количество малых сетевых пачек в записи; количество спайков в пачке; длительность малой пачки импульсов в секундах. Критерием малой сетевой пачки являлось наличие спайков минимум на четырех различных электродах матрицы с межспайковым интервалом не более 100 мс [8].
Анализ паттерна активации нейронной сети. Дополнительно для характеристики функциональной структуры сетевой активности был выполнен анализ последовательности спайков внутри вызванной пачки, обусловленных сложной сетевой динамикой, которая способна варьироваться в разных пачках. Для анализа функциональных характеристик всех регистрируемых клеток был проведен следующий анализ паттернов активации. Для каждой пачки был определен 64-мерный паттерн активации — времена первого спайка на каждом электроде после временнόй точки, равной времени начала пачки.
Статистический анализ данных. Полученные результаты подвергались статистической обработке с помощью пакета прикладных программ SigmaPlot 11.0 с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Данные представлены в форме «среднее значение ± стандартная ошибка среднего». Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Результаты. Исследование влияния нейротрофического фактора BDNF на функциональную биоэлектрическую активность первичных клеток гиппокампа проведено на 7-, 14- и 21-й дни культивирования. Согласно ранее полученным данным [9–12], эти сроки развития являются ключевыми этапами формирования нейронных сетей диссоциированных культур in vitro. Добавление различных концентраций альбумина в PBS не вызвало статистически значимых изменений в спонтанной биоэлектрической активности на всех сроках развития культур диссоциированных клеток гиппокампа, что дало основание усреднить значения контрольных групп для каждого этапа проведения исследования.
Установлено, что в ответ на аппликацию BDNF (0,1 и 1 нг/мл) на 7-й день развития культур in vitro спонтанная биоэлектрическая активность статистически значимо не изменялась ни по одному из исследуемых параметров (количество малых сетевых пачек, количество спайков в пачке, длительность малой сетевой пачки). Однако следует отметить, что после добавления в среду культивирования BDNF отмечалось увеличение синхронизации работы нейронов, формирующих сетевую пачку импульсов (рис. 2, б, в). Данный эффект наблюдался в течение суток (рис. 2, г).
 |
Рис. 2. Пример записи спонтанной биоэлектрической активности на 7-й день развития культуры in vitro, регистрируемой с 4 (1–4) электродов мультиэлектродной матрицы MED64 (Alfa MED Science, Япония): а — до добавления BDNF, 1 нг/мл; б — через 20 мин после добавления BDNF, 1 нг/мл; в — через 2 ч после добавления BDNF, 1 нг/мл; г — через 24 ч после добавления BDNF, 1 нг/мл |
При исследовании влияния BDNF на 14-й день развития культур in vitro обнаружены изменения спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур. Наиболее значимые события были выявлены при анализе длительности малой сетевой пачки импульсов. Так, во временнόм промежутке 15–20 мин после добавления в среду культивирования BDNF в концентрации 0,1 нг/мл длительность малой сетевой пачки статистически значимо (p<0,05) увеличивалась по сравнению с исходным уровнем в среднем на 70% (от 0,65±0,16 до 1,11±0,19 с). Кроме того, также (p<0,05) возрастала длительность малой сетевой пачки относительно активности контрольных культур. Однако нейротропный эффект носил транзиторный характер (не менее 20 мин), и через 2 ч после аппликации BDNF спонтанная биоэлектрическая активность возвращалась к исходным значениям и не отличалась от активности контрольных культур (рис. 3, а).
Схожая динамика изменений спонтанной биоэлектрической активности наблюдалась в группе культур с добавлением BDNF в концентрации 1 нг/мл. Однако эффект действия нейротрофина в этом случае был более выражен по сравнению с культурами, получавшими BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. Через 10–15 мин длительность малой сетевой пачки была статистически значимо больше (p<0,05) как относительно исходной активности, так и активности культур с аппликацией BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. На 20-й минуте регистрации длительность пачки в среднем (p<0,05) превысила исходные значения на 83% (с 0,698±0,09 до 1,286±0,21 с), но уже не отличалась от значений, полученных в группе с меньшей концентрацией BDNF. Через 2 и 24 ч после добавления нейротрофина спонтанная биоэлектрическая активность группы культур с BDNF в концентрации 1 нг/мл не отличалась от исходных значений.
При оценке длительности малой сетевой пачки в группе с добавлением в среду культивирования BDNF в концентрации 10 нг/мл (рис. 2, а) обнаружено, что к 10–15-й минуте наблюдения статистически значимо (p<0,05) увеличивается длительность малой сетевой пачки как относительно исходных значений, так и значений группы с BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. Достоверных различий с группой BDNF в концентрации 1 нг/мл не зафиксировано.
Таким образом, нами обнаружен нейротропный эффект концентраций BDNF 1 и 10 нг/мл и не выявлен выраженный эффект BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. Нейротропный эффект BDNF длился кратковременно, и через 2 ч после добавления нейротрофического фактора активность нейронных сетей возвращалась к исходному уровню, статистически значимых различий относительно исходных значений не обнаружено.
Кроме того, аппликация различных концентраций нейротрофического фактора приводила к разным изменениям функциональных характеристик сетевой пачки импульсов, отражающих индивидуальную структуру нейронной сети диссоциированных культур клеток гиппокампа (рис. 3, б–д). Нейротропный эффект BDNF может быть связан с повышением эффективности синаптической передачи, что, в свою очередь, приводит к увеличению количества нейронов с временем активации не более 50 мс. Подобная синхронизация нейронов в сети наблюдалась через 24 ч после аппликации. Следует отметить, что степень синхронизации спайков зависела от концентрации добавляемого нейротрофического фактора. Наибольший эффект отмечен в случае применения BDNF с концентрацией 10 нг/мл, на большинстве электродов время появления спайков в сетевой пачке составляло не более 15 мс.
Исследования, проведенные на 21-й день развития культур in vitro, показали, что аппликация BDNF в концентрации 1 нг/мл приводит к активации спонтанной биоэлектрической активности культур диссоциированных клеток гиппокампа. Достоверные изменения длительности малой сетевой пачки регистрировались через 20 мин после добавления нейротрофина. Применение более низких концентраций BDNF (0,1 нг/мл) не вызывало статистически значимых изменений биоэлектрической активности (рис. 4).
 |
Рис. 4. Влияние нейротрофического фактора BDNF на длительность малой cетевой пачки импульсов на 21-й день развития in vitro; * — статистическая значимость различий значений с исходным уровнем; # — с контрольной группой, p<0,05 (критерий Манна–Уитни) |
Через 20 мин после аппликации BDNF в концентрации 1 нг/мл наблюдалось статистически значимое (p<0,05) увеличение длительности пачки импульсов относительно исходной активности и активности контрольных культур, длящееся в течение последующих 2 ч (контрольные значения были превышены в среднем на 62%). Однако эффект был транзиторный и через 24 ч после добавления нейротрофического фактора длительность пачки не отличалась от первоначальных и контрольных показателей.
Анализ функциональных характеристик сетевой пачки импульсов, отражающих индивидуальную структуру нейронной сети, показал, что добавление в среду культивирования контрольного раствора (альбумина в PBS) не повлияло на паттерн сетевой пачки диссоциированных культур. В отличие от контрольной группы добавление в культуральную среду BDNF в концентрации 0,1 и 1 нг/мл привело к сокращению времени появления первого спайка в сетевой пачке, что говорит о повышении синхронизации работы нейронов. Данный эффект сохранялся в течение 24 ч после аппликации нейротрофина, также как и на 14-й день развития нейронных сетей первичных культур гиппокампа.
Обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что нейротрофический фактор BDNF модулирует спонтанную биоэлектрическую активность культур диссоциированных клеток гиппокампа. Изменение спонтанной биоэлектрической активности нейронов на сетевом уровне выражалось в увеличении длительности малой сетевой пачки импульсов, сокращении времени появления первых спайков в пачке, что изменяло структуру как паттерна активации, так и всей пачки импульсов, являющейся функциональной характеристикой сети. Проявление наблюдаемых изменений зависело от концентрации добавляемого нейротрофина и от стадии развития диссоциированных культур in vitro.
Аппликация BDNF на 7-й день развития культур in vitro не влияла на спонтанную биоэлектрическую активность культур диссоциированных клеток гиппокампа, в то время как на 14-й и 21-й дни культивирования модулировала биоэлектрическую активность нейронных сетей. Эффект в ответ на добавление нейротрофина проявлялся в увеличении длительности малой сетевой пачки импульсов и развивался на временнόм промежутке 10–20 мин. Важно отметить, что характерным проявлением нейротропного действия BDNF служили также повышение эффективности синаптической передачи в нейронной сети гиппокампа и усиление синхронизации нейронов при их включении в сетевую активность.
Можно предположить, что полученный нейротропный эффект в ответ на добавление нейротрофического фактора связан с метаболическими процессами, опосредованными запуском сигнальных каскадов при взаимодействии BDNF с рецептором TrkB [3, 13–15]. Для реализации данных реакций необходимо наличие сформированных зрелых синаптических контактов в нейронной сети [4, 5, 16]. Этим объясняется отсутствие изменений в спонтанной активности диссоциированных культур при добавлении нейротрофина на 7-й день развития культур in vitro, поскольку в данный период развития нейронная сеть находится на стадии формирования с преобладанием электрических синапсов и отсутствием полноценных химических синаптических контактов [9–12]. Более поздние сроки развития диссоциированных культур характеризуются наличием сформированных нейронных сетей, в структуре которых преобладают химические синапсы, обеспечивающие пластичность диссоциированных культур [9, 10] и необходимые для реализации нейротропного эффекта BDNF.
Таким образом, BDNF может выступать в роли нейромодулятора спонтанной биоэлектрической активности нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа. Раскрытие механизмов участия BDNF в синаптической передаче позволит прояснить роль нейротрофина в таких высших функциях ЦНС, как научение и память.
Заключение. Нейротрофический фактор головного мозга BDNF в концентрациях 0,1; 1; и 10 нг/мл оказывает транзиторный нейротропный эффект на спонтанную биоэлектрическую активность только зрелых нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа начиная с 14-го дня развития in vitro.
Финансирование исследования. Работа поддержана грантами РФФИ №13-04-01871, №13-04-12067, №14-04-31601, грантом (соглашение от 27 августа 2013 г. №02.В.49.21.0003 между Министерством образования и науки РФ и Нижегородским государственным университетом им. Н.И. Лобачевского). Публикация частично подготовлена в рамках выполнения государственной работы «Обеспечение проведения научных исследований».
Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.
Литература
- Гомазков О.А. Нейротрофическая регуляция и стволовые клетки мозга. М: Икар; 2006; 331 с.
- Martin J.L., Finsterwald C. Cooperation between BDNF and glutamate in the regulation of synaptic transmission and neuronal development. Commun Integr Biol 2011; 4(1): 14–16, http://dx.doi.org/10.4161/cib.13761.
- Rose C.R., Blum R., Kafitz K.W., Kovalchuk Y., Konnerth A. From modulator to mediator: rapid effects of BDNF on ion channels. BioEssays 2004; 26(11): 1185–1194, http://dx.doi.org/10.1002/bies.20118.
- Aptowicz C.O., Kunkler P.E., Kraig R.P. Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression. Brain Res 2004; 998(2): 115–163, http://dx.doi.org/10.1016/j.brainres.2003.11.035.
- Сunha C., Brambilla R., Tomas K.L. A simple role for BDNF in learning and memory? Front Mol Neurosci 2010; 3: 1, http://dx.doi.org/10.3389/neuro.02.001.2010.
- Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г., Захаров Ю.Н., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Коротченко С.А., Корягина Е.А. Мультиэлектродные матрицы — новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети. Современные технологии в медицине 2009; 1: 8–15.
- Vedunova M., Sakharnova T., Mitroshina E., Perminova M., Pimashkin A., Zakharov Y., Dityatev A., Mukhina I. Seizure-like activity in hyaluronidase-treated dissociated hippocampal cultures. Front Cell Neurosci 2013; 7(149), http://dx.doi.org/10.3389/fncel.2013.00149.
- Pimashkin A., Kastalskiy I., Simonov A., Koryagina E., Mukhina I., Kazantsev V. Spiking signatures of spontaneous activity bursts in hippocampal cultures. Front Comput Neurosci 2011; 5(46), http://dx.doi.org/10.3389/fncom.2011.00046.
- Широкова О.М., Фрумкина Л.Е., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Захаров Ю.Н., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Морфофункциональные закономерности развития нейронных сетей диссоциированных культур гиппокампа in vitro. Современные технологии в медицине 2013; 2: 6–13.
- Агрба Е.А., Мухина И.В. Пространственно-временная характеристика нейросетевой активности первичных культур гиппокампа. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2013; 4(1): 139–144.
- Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Широкова О.М., Захаров Ю.Н., Калинцева Я.И., Мухина И.В. Оценка динамики функционального состояния диссоциированной культуры гиппокампа in vitro. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2011; 2(2): 283–286.
- Гладков А.А., Ведунова М.В., Коротченко С.А., Захаров Ю.Н., Балашова А.Н., Мухина И.В. Развитие пространственно-временной структуры нейрональной сети гиппокампа in vitro. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2011; 2(2): 243–248.
- Caldeira M.V., Melo C.V., Pereira D.B., Carvalho R.F., Carvalho A.L., Duarte C.B. BDNF regulates the expression and traffic of NMDA receptors in cultured hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci 2007; 35(2): 208–219, http://dx.doi.org/10.1016/j.mcn.2007.02.019.
- Porcher C., Hatchett C., Longbottom R.E., McAinch K., Sihra T.S., Moss S.J., Thomson A.M., Jovanovic J.N. Positive feedback regulation between gamma-aminobutyric acid type A (GABA(A)) receptor signaling and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) release in developing neurons. J Biol Chem 2011; 286(24): 21667–21677, http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M110.201582.
- Patapoutian A., Reichardt L.F. Trk receptors: mediators of neurotrophin action. Curr Opin Neurobiol 2001; 11(3): 272–280, http://dx.doi.org/10.1016/S0959-4388(00)00208-7.
- Sakharnova T.A., Vedunova M.V., Mukhina I.V. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its role in the functioning of the central nervous system. Neurochem J 2012; 6(4): 251–259, http://dx.doi.org/10.1134/s1819712412030129
