Возможности современных методов изучения окислительного стресса и иммунного профиля в выявлении предикторов развития хронического воспалительного процесса в бронхах молодых начинающих курильщиков

Курение сигарет является одним из ведущих механизмов экзогенного повреждения дыхательной системы, приводящих к развитию хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), эмфиземы, рака легких [1, 2]. Патогенный потенциал табачного дыма представляют до 4700 различных токсических веществ, способствующих системному повреждению организма и формированию патологического процесса в бронхолегочной системе [3–6]. Курение способствует активации свободнорадикальных процессов, под действием которых с течением времени в дыхательных путях развивается хронический воспалительный процесс [1, 4, 7, 8], в том числе с участием микробной флоры [1, 4].

Одним из главных механизмов поддержания гомео­стаза в организме является функционирование системы оксиданты–антиоксиданты. Через оксидативные механизмы развиваются бронхоконстрикция и вазоконстрикция. Оксиданты участвуют в деградации ДНК, снижении активности сурфактанта, повышении проницаемости эндотелия и эпителия, вызывают развитие эмфиземы и пневмосклероза [7, 9].

Одним из конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) является малоновый диальдегид (МДА), по скорости образования которого можно судить об активации реакций, ведущих к образованию свободных радикалов. С другой стороны, белки и ферменты антиоксидантной системы, такие как каталаза, супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза и др., защищают клетки организма от повреждающего действия окислительного стресса.

Нарушение равновесия в системе прооксиданты–антиоксиданты лежит в основе развития заболеваний дыхательной системы (ХОБЛ, бронхиальной астмы, легочного фиброза, рака легких), атеросклероза, ишемической болезни сердца и др. [10–12].

Окислительный стресс в легких индуцирует модификацию белков плазмы крови, активацию макрофагов и рекрутирование нейтрофилов в центральных и периферических воздухоносных путях, аккумуляцию токсичных продуктов ПОЛ в мембранах легких и крови, увеличение содержания в выдыхаемом воздухе продуктов ПОЛ, пероксида водорода, нитрозотиолов и нитратов [13]. Кроме того, по последним данным, он провоцирует гиперплазию слизистых оболочек желез и апоптоз эпителиальных клеток воздухоносных путей [8].

Механизмы развития воспаления во многом связаны с процессами, протекающими в иммунной системе. Клетки, участвующие в иммунном ответе и в развитии воспалительного процесса при ХОБЛ, имеют разнообразные мембранные антигены, которые характеризуют направление их дифференцировки [14, 15]. У мембранных белков клеток иммунной системы могут быть растворимые формы, которые обнаруживаются в биологических жидкостях (сыворотка крови, синовиальная жидкость и др.) и, как правило, сохраняют свои биологические возможности, регулируя разные этапы иммунного ответа [14, 15]. По мнению авторитетных исследователей, содержание данных молекулярных маркеров может рассматриваться в качестве дополнительных критериев активации воспаления и тяжести ХОБЛ [3].

Выделено три основные группы мембранных белков клеток иммунной системы, имеющих растворимые формы [14, 15]:

молекулы главного комплекса гистосовместимости (HLA) I и II класса;

рецепторы цитокинов, такие как антиген CD25 — рецептор интерлейкина-2 (ИЛ-2 Rα);

разнообразные антигены, участвующие в созревании клеток иммунной системы и выполнении ими эффекторных функций: CD95 (Fas/Apo-1) опосредует апоптоз, CD50 и CD54 являются молекулами межклеточной адгезии ICAM (intercellular adhesion molecules), CD38 участвует в процессах адгезии, трансдукции сигнала и активации клеток, CD8 служит корецептором Т-клеточного рецептора и антигеном цитолитических лимфоцитов.

Одной из 12 наиболее актуальных научных проблем ХОБЛ, обозначенных Европейским респираторным обществом, является изучение механизмов формирования ХОБЛ на начальных стадиях и разработка методов ранней диагностики данного заболевания [16]. K.W. Carey и соавт. [5] обнаружили в выдыхаемом конденсате у молодых «практически здоровых» курильщиков повышение хемотаксической активности нейтрофилов в сочетании с другими признаками воспаления, индуцированного табачным дымом. В литературе нет четких данных, как скоро на фоне курения могут появляться первые признаки ХОБЛ. Вероятно, уже на ранних стадиях табачной зависимости можно предполагать наличие воспалительного процесса в бронхах, активацию иммунных механизмов, а также дестабилизацию баланса антиоксидантов и оксидантов. В связи с этим нам представляется весьма интересным с помощью анализа динамики ПОЛ и активности антиоксидантных систем, а также уровня растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы отследить у молодых начинающих курильщиков начало развития хронического воспалительного процесса.

Цель исследования — оценить возможности современных методов изучения окислительного стресса и иммунного профиля в выявлении предикторов развития хронического воспалительного процесса в бронхах у молодых начинающих курильщиков.

Материалы и методы. Исследование проведено на базе кафедры пропедевтики внутренних болезней Нижегородской государственной медицинской академии. Обследовано 85 студентов I–III курсов лечебного и педиатрического факультетов (средний возраст — 19,5+0,7 года; 48 юношей и 37 девушек). 30 некурящих студентов вошли в 1-ю группу, 55 человек, приверженных к курению (30 юношей, 25 девушек), составили 2-ю группу. С целью исключения бронхообструктивного синдрома и другой патологии органов дыхания анализировали данные рентгенографии грудной клетки и функции внешнего дыхания (ФВД): объем форсированного выдоха за 1 с, индекс Тиффно, пиковую объемную скорость, мгновенную объемную скорость при 25, 50, 75% выдоха. Студенты, имевшие патологические отклонения, в исследование не включались.

Интенсивность свободнорадикальных процессов определяли методом индуцированной хемилюминесценции с помощью биохемилюминометра БХЛ-07 (Россия). Для оценки ПОЛ использовали показатель максимальной интенсивности свечения (Imax), отражающий потенциальную способность биологических тканей к свободнорадикальному окислению. О высокой активности ПОЛ и снижении антиоксидантной защиты может говорить также повышение светосуммы S, являющейся интегральным показателем неферментативной антиоксидантной активности (АОА) плазмы и находящейся в обратной зависимости от нее. Также изучали концентрацию МДА в плазме крови и активность СОД и каталазы эритроцитов.

Критериями интенсивности ПОЛ считали уровень Imax и содержание МДА. Состояние антиоксидантной защиты оценивалось по активности СОД, каталазы и светосуммы S.

Состояние иммунной системы изучали по уровню ингибитора апоптоза sCD95 (суммарной и олигомерной фракции), маркеров активации иммунных клеток (sCD38, sCD25, sCD8), молекул межклеточной адгезии sCD54 (ICAM-1), суммарной и олигомерной фракции и sCD50 (ICAM-3), а также молекул гистосовместимости HLA-I и HLA-DR.

Концентрацию растворимых форм мембранных антигенов определяли с помощью прибора для иммуноферментного анализа Stat Fax 2100 (США) с длиной волны 450 и 630 нм, полученные данные выражали в условных единицах (U/ml).

Исследование растворимых форм лейкоцитарных дифференцировочных антигенов проводили на базе НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского, а исследование ПОЛ и АОА — на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории НижГМА.

Статистическую обработку материала выполняли с помощью программ Statistica 7.0 и Minitab 16. Результаты представлены в виде средней величины и стандартного отклонения (M+SD). В зависимости от правильности распределения признака для сравнения несвязанных групп использовали Т-тест и критерий Манна–Уитни. Критерием достоверности считали уровень значимости р<0,05. При 0,05<р≤0,1 выносилось суждение о наличии статистической тенденции.

Результаты и обсуждение. Все обследованные нами студенты независимо от наличия табачной зависимости имели одинаково хорошие показатели ФВД (табл. 1). Кроме того, у них отсутствовали клинические признаки воспалительного повреждения бронхов.

Таблица 1. Основные спирометрические параметры у молодых курильщиков и некурящих относительно здоровых студентов, % (M±SD)

При сравнении показателей ПОЛ и антиоксидантных ферментов плазмы крови и гемолизата эритроцитов в нашем исследовании выявлены существенные различия между курящими и некурящими студентами. Для молодых курильщиков была характерна активация антиоксидантной системы (табл. 2, рисунок). Так, уровень СОД эритроцитов во 2-й группе был статистически значимо более высоким, чем в 1-й (р=0,0001). Следует отметить, что высокий уровень антиоксидантов (СОД и глутатиона) у здоровых курильщиков, находящийся в зависимости от интенсивности курения, был обнаружен и другими авторами [17]. Увеличение средних значений каталазы эритроцитов во 2-й группе по сравнению с 1-й находилось на уровне статистической тенденции (р=0,067). Уровень МДА у курящих и некурящих студентов оказался примерно одинаковым. По данным авторитетных исследователей, этот показатель не изменяется и при тяжелом течении ХОБЛ [18].

Таблица 2. Сравнительная характеристика показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантных ферментов у курящих и некурящих студентов (M±SD)

Значения параметров перекисного окисления липидов у курящих и некурящих студентов

С другой стороны, во 2-й группе выявлено статистически значимое снижение показателя максимальной интенсивности свечения Imax, отражающего потенциальную способность биологических тканей к свободнорадикальному окислению (р=0,005), а также значения светосуммы S (р=0,032).

В настоящее время активно изучается состояние иммунитета при многих заболеваниях, в том числе и при ХОБЛ. Весьма интересным представляется изучение уровня растворимых дифференцировочных молекул и молекул гистосовместимости в сыворотке у курящих и некурящих студентов.

В нашем исследовании (табл. 3) студенты-курильщики характеризовались статистически значимым повышением уровня ингибитора апоптоза sCD95, причем как суммарной (sCD95s), так и олигомерной (sCD95ol) фракции (р=0,011 и р=0,010 соответственно). Эти результаты согласуются с полученными ранее экспериментальными данными, показавшими, что экстракт сигаретного дыма вызывает внутриклеточную аккумуляцию активных форм кислорода и индуцирует Fas/Apo-1-ассоциированный апоптоз альвеолярного эпителия [19].

Таблица 3. Содержание растворимых дифференцировочных молекул и молекул гистосовместимости в сыворотке у курящих и некурящих студентов (Me [25; 75])

Кроме того, у молодых курильщиков статистически значимо нарастала активность иммунных клеток, о чем свидетельствовали изменения уровней sCD8 и sCD25 (в группе курильщиков они оказались статистически значимо более высокими — р=0,029 и р=0,0001 соответственно), а также уровень суммарной фракции молекул адгезии sCD54 (р=0,025). При этом значения олигомерной фракции были, наоборот, несколько повышены у некурящих (р=0,05).

Другие авторы также свидетельствуют о повышении как клеточной экспрессии, так и сывороточного уровня растворимых молекул адгезии под влиянием активного и пассивного курения [20]. Не так давно было показано, что экстракт сигаретного дыма и медиаторы лаважной жидкости, полученной из дистальных бронхов курильщиков, повышают экспрессию ICAM-1 и адгезивные свойства нейтрофилов, а также индуцируют провоспалительные BLT2-рецепторы, запуская механизмы повреждения тканей [21]. В опубликованных результатах 10-летнего мультиэтнического исследования (MESA Lung Study), включавшего 1865 участников, также отмечено, что в генеральной популяции высокий уровень sICAM-1 служит независимым маркером прогрессирования эмфиземы легких [22].

Ранее нашей рабочей группой [23] было установлено, что длительное курение и прогрессирование ХОБЛ ассоциируются с низким уровнем растворимых антигенов адгезии, что коррелирует с более высокой микробной колонизацией нижних дыхательных путей. Выявленное снижение сывороточного содержания обсуждаемых молекул может свидетельствовать о неблагоприятном влиянии антибиотиков и системных глюкокортикостероидов на состояние иммунитета в процессе стационарного лечения обострений бронхообструктивных заболеваний.

В последнее время активно обсуждаются взаимоотношения между молекулами адгезии, воспалением и оксидативным стрессом. На культуре клеток ретинального пигментного эпителия показано, что воспалительные эффекты TNF-α опосредуются индукцией активных форм кислорода и повышением экспрессии ICAM-1 [24]. В свою очередь антиоксиданты (α-токоферол) в эксперименте на мышах повышают устойчивость к бактериальной пневмонии, модулируя рекрутирование нейтрофилов в легкие путем нарушения экспрессии антигена ICAM-1, его лиганда и других молекул адгезии [25]. Полученные нами данные поддерживают представления о существовании взаимосвязей между индуцированным курением оксидативным стрессом и молекулами адгезии, а также растворимыми формами лейкоцитарных антигенов, участвующих в регуляции апоптоза и активации иммунных клеток. Это подтверждается и работами других авторов. Так, анализ образцов легочной ткани курильщиков показал, что Т-клеточное воспаление с преобладанием цитолитических CD8⁺ лимфоцитов является основным ответом на антигенные стимулы и индуцировано табачным дымом, а патогенез эмфиземы у них связан с активацией CD95-зависимого апоптоза [26].

Средние значения молекул гистосовместимости HLA-I и HLA-DR статистически значимо нарастали у курящих студентов (р=0,003 и р=0,002 соответственно). Последнее может свидетельствовать об активации гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа, реализуемого с участием CD4⁺ Т-лимфоцитов, у молодых начинающих курильщиков. По данным других исследователей, молекулы гистосовместимости I класса принимают большое участие в патогенезе ХОБЛ и их уровень может выступать в качестве показателя тяжести течения этого заболевания [27].

Проведенные ранее исследования [28] показывают, что курящие студенты I–VI курсов уже могут иметь легкие бронхообструктивные нарушения. Настоящая работа убедительно демонстрирует, что этим изменениям у курильщиков предшествуют существенные адаптивные процессы, затрагивающие многие звенья, к которым относятся как активация антиоксидантных процессов, так и адаптивные иммунные сдвиги. Таким образом, данные современных методов исследования системы оксиданты–антиоксиданты, а также уровней дифференцировочных молекул и молекул гистосовместимости могут играть важную роль в понимании тонких механизмов влияния курения на дыхательную систему в «дообструктивную» фазу и в выявлении предикторов развития хронического воспаления бронхов.

Заключение. У начинающих курильщиков курение сопровождается компенсаторными реакциями в организме, направленными на активацию антиоксидантной системы и снижение интенсивности ПОЛ. У них повышается уровень СОД эритроцитов, достоверно снижаются показатели максимальной интенсивности свечения Imax и светосуммы S.

Первые годы табакокурения ассоциируются с активацией защитных механизмов в организме: повышением уровня ингибитора апоптоза sCD95, нарастанием активности иммунных клеток, а также уровня суммарной фракции молекул адгезии sCD54. Кроме того, выявляется повышение значений молекул гистосовместимости HLA-I и HLA-DR, что может свидетельствовать об активации гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа.

Современные методы исследования системы оксиданты–антиоксиданты, а также уровней дифференцировочных молекул и молекул гистосовместимости позволяют изучить тонкие механизмы влияния курения на дыхательную систему в «дообструктивную» фазу и выявить предикторы развития хронического воспаления бронхов.

Финансирование исследования. Исследование выполнено в рамках проектной части государственного задания в сфере научной деятельности (проект №20.223.2014/К).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.