Роль стресс-протективной терапии в течении хронической ишемии головного мозга

Согласованная и сбалансированная деятельность стрессогенной и стресс-лимитирующей систем обеспечивает устойчивость организма при воздействии повреждающих факторов в остром периоде адаптации [1–5]. С одной стороны, стресс является фактором риска развития ишемии мозга [6–9], с другой — недостаточность кровоснабжения мозга в качестве постоянно действующего стрессового фактора вызывает срыв адаптации и нарушение гомеостаза [10, 11]. В результате течения хронической ишемии головного мозга разворачивается комплекс компенсаторно-приспособительных реакций, направленных на восстановление нарушенного гомеостаза при срыве адаптации, обусловленном напряжением и дисбалансом между стрессовой и стресс-лимитирующей системами.

Известно, что стресс у животных характеризуется развитием различных гуморально-гормональных и свободнорадикальных реакций. В ряде исследований показано, что нейропротективная терапия повышает устойчивость к стрессу [12–14]. Экспериментальными исследованиями установлено, что значительно выраженной стресс-протективной активностью обладают синтетические аналоги нейропептидов и аминокислоты [15, 16]. Например, нейрохимическая организация лимбико-гипоталамо-ретикулярных структур у животных может быть изменена при дополнительном введении дельта-сон-индуцирующего пептида [17], который подавляет избыточное образование свободных радикалов и предупреждает гибель нейронов при стрессовых воздействиях [18].

Изучению постстрессовых изменений посвящено большое количество исследований, однако вопросы о роли стресса в прогрессировании хронической ишемии мозга остаются нерешенными. Практически не изучены особенности динамики постстрессовой реакции и морфофункциональные изменения в мозге, происходящие на различных стадиях хронической ишемии. Представленная работа посвящена решению этих вопросов.

Цель исследования — определить клиническую и патогенетическую значимость стресс-протективной терапии в течении экспериментальной хронической ишемии головного мозга.

Материалы и методы. Экспериментальная часть работы выполнена на базе ЦНИЛ и кафедры нормальной физиологии НижГМА (Н. Новгород). Исследования проводились на 120 половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 250–300 г в возрасте 3,5–4,0 мес. При этом неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Проведение исследования одобрено Этическим комитетом НижГМА. Содержание животных, хирургические вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с нормативами, представленными в руководстве «Guide for care and use of laboratory animals. ILAR publication, 1996, National Academy Press», и с требованиями приказа Минздрава РФ №267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Животные содержались в виварии при свободном доступе к пище и воде, в условиях естественной смены дня и ночи.

Локальную ишемию мозга моделировали путем окклюзии ветви левой средней мозговой артерии и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной внутренней сонной артерии. Объем очага инфаркта в группе животных, получавших физиологический раствор, составлял около 20% объема ипсилатерального полушария. Голову крысы фиксировали в боковом положении левой стороной кверху. После удаления шерстяного покрова и обработки операционного поля производили разрез кожи по ходу скуловой кости (около 2 см). Слюнную железу вместе с сосудистым сплетением отделяли от окружающих тканей, перемещали в задневерхний квадрат операционного поля и выполняли удаление скуловой кости. С помощью бормашины производили щадящий разрез нижнечелюстной кости по краю крепления к ней сухожилия височной мышцы. Затем поднимали крючками нижний край височной мышцы и обнажали височную ямку, дно которой образует крыловидная мышца с проходящим рядом нижнечелюстным нервом. С помощью ранорасширителя раздвигали крыловидную мышцу и открывали поверхность черепа между овальным отверстием и отверстием зрительного нерва. Под нижним краем височно-нижнечелюстного сустава сверлили отверстие диаметром около 2 мм и тем самым обнажали область средней мозговой артерии. Окклюзию левой ветви средней мозговой артерии производили проксимальнее участка разделения ее на лобную и теменную ветви. Таким же способом выполняли окклюзию рядом расположенной мозговой вены до пересечения ее с артерией. Окклюзия достигалась с помощью электрокоагуляции электрохирургическим высокочастотным аппаратом ФОТЕК Е81 (ФОТЕК, Россия). После коагуляции кровоток по средней мозговой артерии прекращался, что можно было наблюдать под микроскопом. Сразу после коагуляции перевязывали лигатуру, на которой находилась внутренняя сонная артерия. После операции рану обрабатывали калийной солью пенициллина, кожу ушивали, шов обрабатывали 2% раствором йода.

Все животные были разделены на группы по 20 крыс:

1-я группа — интактные животные, которые не подвергались никакому воздействию;

2-я группа — «ложнооперированные» животные, которым было произведено хирургическое вмешательст­во без окклюзии артерий мозга и без какого-либо лечения.

Животные с экспериментальной хронической ишемией получали различные варианты фармакотерапевтического воздействия, вследствие чего были разделены на четыре группы:

3-я группа — контрольная, животным интраназально или внутрибрюшинно вводили 0,9% раствор NaCl;

4-я группа — животные получали только базисную терапию (пирацетам по 200 мг/кг и винпоцетин по 0,7 мг/кг в сутки в течение 10 дней);

5-я группа — на фоне базисной терапии вводили внутрибрюшинно антиоксидант по 0,16 мл/кг в сутки в течение 10 дней;

6-я группа — животным совместно с базовой терапией интраназально вводили препарат стресс-лимитирующего действия, содержащий дельта-сон-индуцирующий пептид в дозе 150 мкг/кг в сутки в течение 10 дней.

Фармакологическое вмешательство начиналось на 10-е сутки после моделирования ишемии, поскольку в этот период происходила стабилизация функционального состояния с формированием хронической стадии ишемии мозга. Введение препаратов осуществлялось ежедневно в утренние часы.

Предварительная оценка устойчивости животных к стрессу не выполнялась, так как проведение необходимых тестов могло повлиять на динамику показателей стрессовой и компенсаторно-приспособительной реакций при дальнейшем лечении. Кроме того, использование в эксперименте животных линии Wistar, которые, как известно, являются малоустойчивыми к стрессу, допускает сопоставление экспериментального и клинического материала.

Через 10 сут после моделирования острой ишемии регистрировали параметры компенсаторно-приспособительных реакций, свидетельствующих о дезадаптации и развитии хронической ишемии мозга. Динамику морфофункциональных показателей оценивали во всех группах на 10, 30 и 60-е сутки. Дальнейшее наблюдение считали нецелесообразным в связи с возможным началом возрастных изменений головного мозга.

Анализировали следующие показатели: параметры поведенческой активности животных, состояние свободнорадикальных процессов, стрессовые реакции крови, морфологические изменения в ткани мозга в послеоперационном периоде (60-е сутки), выживаемость животных в отдаленном послеоперационном периоде (60-е сутки).

Кровь для биохимических анализов забирали в одно и то же время суток на 10-е и 60-е сутки.

Уровень тканевой гипоксии оценивали по содержанию лактата и пирувата в крови крыс. Количественное определение лактата проводили энзиматическим методом с использованием лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в глицин-гидрозиновом буфере. Методом индуцированной хемилюминесценции на хемилюминометре БХЛ-06 («Биофарм-автоматика», Россия) определяли интенсивность свободнорадикальных процессов в плазме крови крыс. Исследовали показатели лейкоцитарной формулы с подсчетом лейкоцитарного коэффициента и электрофоретическую подвижность эритроцитов (методом Харамоненко–Ракитянской). Проводили морфологическое исследование перифокальной области в пятом слое коры мозга, содержащем пирамидные нейроны, через 2 мес после моделирования ишемии. Образцы ткани мозга фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Срезы толщиной 7 мкм изготавливали на микротоме Leica SM 2000R (Leica, Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Нисслю. Подсчет нейронов и клеток нейроглии в исследуемых полях зрения проводили при помощи светового микроскопа DMLS (Leica, Германия) и программы визуализации. Количество клеток оценивали на 15 срезах мозга у каждого животного.

Статистическая обработка материала выполнена с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., USA). Различия, полученные при сравнительном анализе, считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Установлено, что экспериментальная хроническая ишемия мозга приводит к значительно выраженным нарушениям поведения у крыс, которые сохраняются в течение всего периода наблюдения. Выявлено повышение тревожности, увеличение времени реакции замирания, снижение двигательной активности и обучаемости (табл. 1), характеризующие стрессовую реакцию и уменьшение компенсаторно-приспособительных возможностей у животных. Отсутствие двигательных нарушений (парезов и параличей) указывает на восстановление неврологических функций в период хронической ишемии. Частичная компенсация функций связана с особенностями кровоснабжения головного мозга у крыс, в частности с более развитой системой коллатерального кровообращения.

---

Таблица 1. Показатели поведенческой активности экспериментальных животных в период хронической ишемии (M+SEM)

---

При исследовании лабораторных показателей выявлены повышение электрофоретической подвижности эритроцитов и лейкоцитарного коэффициента, а также уменьшение содержания лимфоцитов (табл. 2) и активация процессов перекисного окисления липидов.

---

Таблица 2. Показатели стрессовой и компенсаторной реакций в условиях экспериментальной хронической ишемии мозга (M+SEM)

---

В периоде экспериментальной хронической ишемии мозга наблюдалось изменение соотношения нейроглии и нейронов в пятом слое коры мозга (табл. 3). Показатель нейроглия/нейроны у животных с ишемией мозга был на 77% выше по сравнению с интактными животными. Общее количество нейронов двигательной коры уменьшилось, показатель соотношения ядерных и безъядерных нейронов снизился.

---

Таблица 3. Количество клеток нейроглии и нейронов в перифокальной области пятого слоя коры мозга крыс (60-е сутки ишемии мозга)

---

Выживаемость в группе экспериментальных животных с хронической ишемией мозга через 60 сут была ниже, чем в группах интактных и «ложнооперированных» животных, что свидетельствует о недостаточности компенсаторных процессов.

Таким образом, при моделировании хронической ишемии мозга сохраняется напряженность адаптационно-компенсаторных процессов, что проявляется изменением поведенческих и лабораторных показателей. Предполагается, что при таком длительно действующем стресс-факторе, как локальная ишемия, нарушен баланс в про- и антистрессовой системе, что снижает компенсаторные возможности у экспериментальных животных.

При анализе влияния нейропротективной и анти­стрессовой терапии на состояние головного мозга и компенсаторные возможности экспериментальных животных в условиях моделируемой ишемии мозга обнаружено, что применение любого из предложенных лечебных комплексов (группы 4–6) повышает выживаемость животных по сравнению с контрольной группой. Проведение курса базисной нейропротективной тера­пии повышает выживаемость экспериментальных животных при хронической ишемии мозга на 31%. Сочетание нейропротективной терапии с антиоксидантом обеспечивает выживаемость 75% животных и 100% — при сочетании со стресс-лимитирующим препаратом.

Три основных показателя поведения крыс: горизонтальная двигательная активность (ГДА), измеряемая количеством пересеченных квадратов в «открытом поле»; вертикальная двигательная активность (ВДА), определяемая количеством подъемов на задние лапы; и условная реакция пассивного избегания (УРПИ) — были проанализированы в динамике (табл. 4, 5).

---

Таблица 4. Динамика показателей двигательной активности при использовании различных лечебных комплексов

---

Таблица 5. Динамика показателей условной реакции пассивного избегания при использовании различных терапевтических комплексов

---

У всех оперированных животных показатели ВДА и ГДА были резко снижены на 10-е сутки ишемии мозга по сравнению с интактными животными. Показатели ВДА при использовании только базисной нейропротективной терапии повышались по сравнению с контрольной группой к 60-м суткам наблюдения. При включении в терапевтический комплекс антиоксиданта показатели снижались к 30-м суткам и оставались низкими до 60-х суток наблюдения, отличаясь от контрольной группы, а также от группы, получавшей только нейропротективную терапию.

В группе, получавшей стресс-лимитирующий препарат, показатель ВДА снижался к 30-м суткам, однако при последующем наблюдении отмечалось постепенное его повышение. Показатели ГДА в контрольной группе снижались в течение всего периода наблюдения, как и в группе, получавшей базисную в сочетании с антиоксидантной терапию. В группах, получавших только базисную терапию и базисную в сочетании со стресс-лимитирующей терапией, снижения ГДА не отмечено.

Таким образом, повышение ВДА и стабилизация ГДА к 60-м суткам при экспериментальной ишемии мозга наблюдались в случаях применения базисной терапии и базисной в сочетании со стресс-лимитирующей терапией.

Оценку обучаемости и памяти при использовании различных терапевтических комплексов проводили с помощью исследования УРПИ (см. табл. 5). Установлено, что у животных контрольной группы способность к обучению в отдаленном периоде ишемии мозга не восстанавливалась. При использовании только базисной терапии отмечали улучшение способности к обучению, однако показатели УРПИ оставались ниже, чем в группе интактных животных. Подобная динамика выявлена и в группе, получавшей базисную и антиоксидантную терапию. В группе, получавшей базисную и стресс-лимитирующую терапию, отмечено восстановление способности к обучению: к 30-м суткам время пребывания в светлом отсеке (показатель «воспроизведение») достигло уровня интактных животных и сохранялось до 60 сут. Время обучения уменьшалось, хотя и не достигало уровня интактных животных.

Для оценки состояния неспецифической стрессовой системы при использовании различных терапевтических комплексов проводили исследование электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) и лейкоцитарной формулы у крыс. В группе контроля ЭФПЭ (табл. 6) сохраняла повышенные значения с 10-х по 60-е сутки наблюдения. Аналогичная ситуация наблюдалась при включении в терапевтический комплекс антиоксиданта. В группе животных, получавших только базисную терапию, а также в группе, получавшей базисную и стресс-лимитирующую терапию, к 60-м суткам отмечено статистически значимое снижение ЭФПЭ, указывающее на приближение показателей стрессовых реакций к физиологическому уровню. Динамика была более выраженной в группе животных, получавших стресс-лимитирующую терапию.

---

Таблица 6. Динамика электрофоретической подвижности эритроцитов при использовании различных терапевтических комплексов, мкм·см В–1с–1

---

Динамика лейкоцитарной формулы в группах, получавших антиоксидантную и стресс-лимитирующую терапию, была однонаправленной: пониженный уровень лимфоцитов крови на 10-е сутки повышался к 60-м суткам до уровня у интактных животных. В группе, не получавшей лечения, уровень лимфоцитов к 60-м суткам не достигал нормальных значений. Динамика лейкоцитарного коэффициента, отличная от контрольной группы, отмечена у всех животных, получавших лечение. Снижение лейкоцитарного коэффициента свидетельствует об уменьшении стрессовой реакции в этих группах.

Исследование окислительных процессов заключалось в определении соотношения лактата и пирувата в артериальной крови животных и антиоксидантной активности плазмы крови. Способность субстратов крови тормозить окислительные процессы характеризовалась отношением Imax/S. Динамика показателей окислительных процессов при использовании различных терапевтических комплексов представлена в табл. 7.

---

Таблица 7. Динамика показателей окислительных процессов при использовании различных терапевтических комплексов

---

Преобладание анаэробных процессов со снижением утилизации пирувата в цикле Кребса в отдаленном периоде ишемии мозга отмечалось у всех экспериментальных животных по сравнению с интактными. В группе, получавшей базисную терапию, и в группе, получавшей базисную и стресс-лимитирующую терапию, не выявлено повышения соотношения лактата и пирувата в 60-е сутки по сравнению с 10-ми сутками. Более того, в группе, получавшей препарат стресс-лимитирующего действия, отмечалось снижение этого показателя к 60-м суткам.

На 10-е сутки антиоксидантная активность плазмы крови (Imax/S) была ниже у животных с ишемией мозга по сравнению с интактными. К 60-м суткам этот показатель в контрольной группе оставался низким. Напротив, во всех группах, получавших лечение, отмечено повышение антиоксидантной активности к 60-м суткам по сравнению с 10-ми сутками и с контрольной группой.

Результаты исследования двигательной коры в отдаленном периоде ишемии мозга представлены в табл. 3. У экспериментальных животных во всех группах, кроме крыс, получавших стресс-лимитирующую терапию, отмечено уменьшение количества нейронов и увеличение количества клеток нейроглии по сравнению с интактными животными. Увеличение количества клеток нейроглии было более выраженным в контрольной группе. Таким образом, применение антистрессовой терапии активизирует нейротрофические процессы в нервной ткани и улучшает показатели жизнеспособности нейронов и клеток нейроглии.

Заключение. При моделировании хронической ишемии головного мозга у экспериментальных животных, по всей вероятности, сохраняется дисбаланс в соотношении стресс-активирующих и стресс-лимитирующих систем в течение всего периода (до 60 сут) наблюдения, что проявляется изменением лабораторных показателей и приводит к недостаточности адаптационно-компенсаторных процессов у животных в условиях хронической ишемии мозга, снижению их выживаемости к 60-м суткам постишемического периода почти в 2 раза.

Проведение курса базисной нейропротективной терапии повышает выживаемость экспериментальных животных в отдаленном периоде хронической ишемии мозга на 31% и оказывает нейротрофическое дейст­вие. Сочетание базисной нейропротективной терапии с препаратами антистрессового действия обеспечивает выживаемость 75% животных при использовании антиоксиданта и 100% — в случае применения стресс-лимитирующего препарата. Включение стресс-лимитирующего препарата в терапевтический комплекс усиливает нейротрофический эффект.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.