Микрокапсулы из поли(3-гидроксибутирата) для пролонгированного высвобождения белка

В настоящее время поли(3-гидроксибутират) (ПГБ), а также его сополимеры, получаемые биотехнологическим путем, привлекают большое внимание в качест­ве биосовместимых и биодеградируемых материалов. ПГБ применяется для разработки широкого спектра полимерных изделий биомедицинского назначения, таких как сосудистые стенты, хирургические нити, пародонтологические мембраны [1–3]. Помимо медицинских изделий ПГБ может быть использован для разработки лекарственных препаратов с возможностью пролонгированного высвобождения посредством включения в полимерные микрочастицы различных лекарственных веществ: низкомолекулярных соединений [4–6], высокомолекулярных белков [7] и неорганических наночастиц [8].

Наиболее перспективным направлением в современной биофармакологии является создание белковых систем пролонгированного высвобождения. Применение таких систем, основанных на использовании биополимерных микрочастиц, может устранить большинство недостатков традиционных лекарственных средств: высокую токсичность, неэффективность действующего начала, нестабильность вещества, неудобство введения и т.д. Однако для инкапсуляции белков в полимерные микрочастицы необходимо использовать относительно сложные методы, причем одним из наиболее эффективных является метод двухэтапного эмульгирования. Он применяется для получения микрокапсул и микрочастиц, загруженных белком, так как в данном случае белок не растворяется в том же растворителе, что и биополимер. Существует несколько модификаций этого метода, различающихся по последовательности эмульгирования в различных фазах и по составу этих фаз [9].

Важным свойством для полимерных систем пролонгированного высвобождения является их биосовместимость. Для ее оценки существует ряд методов, как in vitro, так и in vivo. Первые представляют собой ряд моделей, основанных на культурах клеток [10], в то время как вторые подразумевают подкожную [11] или внутримышечную [12] имплантацию полимерного изделия лабораторным животным с последующим исследованием гистологическими методами.

Цель исследования — разработка новой системы пролонгированного высвобождения белков, в основе которой лежит использование микрокапсул поли(3-гидроксибутирата), загружаемых бычьим сывороточным альбумином.

Материалы и методы. Для создания системы применяли ПГБ с молекулярной массой 826 кДа, полученный в лаборатории азотфиксации микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха микробиологическим путем при помощи культивирования штамма Azotobacter chroococcum 7Б [13]; хлористый метилен (дихлорметан CH₂Cl₂, «Экос-1», Россия); бычий сывороточный альбумин (БСА) (SigmaAldrich, Германия); бычий сывороточный альбумин, меченный флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (SigmaAldrich, Германия); поливиниловый спирт (MERK, 72 000 Да); калий-фосфатный буфер однозамещенный («Химмед», Россия); азид натрия (NaN₃) (SigmaAldrich, Германия); краситель Кумасси бриллиантовый синий G-250 («Астра», Россия); фосфорная кислота (Н₃РО₄, «Химмед», Россия); этиловый спирт (С₂Н₅ОН, «Химмед», Россия); диэтиловый эфир (С₄Н₁₀О, «Химмед», Россия).

Получение микрокапсул. Микрокапсулы получали при помощи метода двухэтапного эмульгирования «водная фаза/масляная фаза/водная фаза» (В/М/В) [14]. Метод заключается 1) в эмульгировании водного раствора лекарственного вещества в растворе полимера в органическом растворителе; 2) в эмульгировании полученной эмульсии в водной фазе. Конечный эмульгатор удаляют с помощью дистиллированной воды и выделяют микросферы [9].

Эмульсию водного раствора белка в количестве 10 мг в растворе полимера с концентрацией в органическом растворителе 10 мг/мл и молекулярной массой 826 кДа в общем объеме 4 мл постепенно добавляли к 50 мл раствора поливинилового спирта с концентрацией 1,5%. Перемешивали с помощью верхнеприводной мешалки R2R 2021 (Heidolph, Германия) при 2000 об./мин. После полного испарения органического растворителя микрокапсулы отделяли центрифугированием (10 мин при 4400 об./мин) с использованием центрифуги 5707R (Eppendorf, Германия), а затем 3 раза промывали дистиллированной водой для полного удаления эмульгатора. Потом микрокапсулы лиофилизировали, используя лиофильную сушку (New brinswick scientific, США), предварительно заморозив их в жидком азоте. Процент включения белка определяли путем подсчета массы белка в процессе исследования динамики его высвобождения из полимера.

Морфология микрокапсул. Исследование морфологии микрокапсул проводили с помощью сканирующей электронно-ионной микроскопии без напыления на приборе Quanta 200 3D (FEI Company, США). Для получения нормального распределения микрочастиц по размерам изображения обрабатывали с помощью программы ImageJ. Изображения, показывающие характер включений белка в структуры, были исследованы с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 META (Германия), объектив C-Apochromat 63x/1.2 Wcorr. Возбуждение флюорересценции проводили лазером с длиной волны 488 нм, радиус конфокальной диафрагмы был равен 1 диску Эри (112 мкм). Использовали фильтр LP 505 нм. Аналогичным способом были исследованы микрочастицы после окончания эксперимента пролонгированного высвобождения [14].

Исследование пролонгированного высвобождения БСА из полимерных микроструктур in vitro. Пролонгированное высвобождение белка из микроструктур проводили при 37°С в термостате ТС 1/20 (Россия) в 25 мМ калий-фосфатном буфере (рН=7,4) с добавлением антибактериального агента азида натрия с концентрацией 0,004%: по 10 мг микрокапсул в 1 мл буфера перемешивали при 350 об./мин на шейкере OS-10 (BIOSAN, Латвия). При исследовании кинетики выделения БСА через заданные интервалы времени микрокапсулы отделяли от буфера центрифугированием при 10 000 об./мин на центрифуге 5702 R (Eppendorf, Германия), отбирали супернатант и добавляли 1 мл свежего буфера. В отобранных пробах определяли количество содержащегося белка.

Спектрофотометрическое определение содержания БСА в полученных образцах. Содержание БСА в полученных образцах выявляли спектрофотометрически с окрашиванием по Бредфорду, а также методом определения концентрации белка в растворе при длине волны 280 нм. Измерения проводились на спектрофотометре UV-1601PC (Shimadzu, Япония) при λ=595 нм и λ=280 нм [14].

Исследование биосовместимости полученных микрочастиц in vivo. Исследование биосовместимости микрокапсул in vivo выполняли на 18 крысах-самцах линии Wistar массой 500±50 г. Животные содержались в виварии ЦНИИЛ НижГМА при 15-часовом световом дне при температуре +22°С, все манипуляции проводились в соответствии с приказом Минздравсоцразвития №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики». Под наркозом (золетил 5 мг/кг) внутримышечно были введены микрочастицы в виде суспензии в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСР) (50 мг/мл) в количестве 1 мл в заднюю лапу лабораторного животного. На 7, 20 и 60-й дни после инъекции животных выводили из эксперимента (по 6 животных), после чего были отобраны образцы мышечной ткани, содержащие микрокапсулы. Далее исследуемые материалы фиксиро­вали в 4% растворе формальдегида в ФСР в течение 24 ч. Затем полученные образцы биопсии промывали водой, обезвоживали в серии градуированных растворов этанола (50, 60, 70, 80, 96% и абсолютный этанол в течение 1,5 ч в каждой концентрации), промывали хлороформом в течение 40 мин, погружали в 45% раствор парафина в хлороформе (37°С, 12 ч) и заливали в форму. Срезы толщиной 6 мкм вырезали из парафиновых блоков с помощью микротома МС 2 («Точмедприбор», Украина), депарафинизировали, окрашивали гематоксилином и эозином с последующим исследованием с помощью световой микроскопии.

Анализ изображений проводили на микроскопе «Биомед 1» («Биомед», Россия) и открытого програм много обеспечения Zeiss LSM Image Browser 4.2.0 (Carl Zeiss MicroImaging, Германия).

Результаты и обсуждение

Морфология микрокапсул. С использованием методики В/М/В были получены микрокапсулы из ПГБ 826 кДа, загруженные модельным белком БСА. На микрофотографии полученных полимерных микрокапсул (рис. 1) хорошо заметна их шероховатая поверхность с множеством тяжей, обусловленная, по-видимому, конденсацией полимерных цепей друг на друга при испарении растворителя, как это описано в ряде работ по установлению морфологии полимерной укладки полигидроксиалканоатов и других частично кристаллических полимеров [15]. Следует обратить внимание, что микрокапсулы представляют собой полые частицы, внутрь которых помещен белок. Это хорошо видно при рассмотрении частицы, рассеченной пучком ионов, на микроскопе Quanta 200 3D (рис. 2): полость внутри частицы ограничена монолитной стенкой, в которой и находится белок. Распределение по размерам (рис. 3) показывает характерный размер частиц — от 5 до 30 мкм со средним диаметром 17 мкм.

Рис. 1. Микрофотография микрокапсул из поли(3-гидроксибутирата) с инкапсулированным белком

Рис. 3. Распределение микрокапсул из поли(3-гидроксибутирата) с инкапсулированным белком по размерам

Включение белка в микрокапсулы. Для изучения характера включений белка в полимерную матрицу был выбран метод конфокальной микроскопии. Для этого были изготовлены частицы с ФИТЦ-меченым БСА. На изображениях (рис. 4 и 5) хорошо видно диффузное расположение белка внутри микрокапсул, в то время как на поверхности микрочастиц находятся скопления адсорбированного белка. Белок, адсорбированный на поверхности частиц, высвобождается в первую очередь, тогда как инкапсулированный БСА обеспечивает пролонгированное высвобождение. Данное явление будет подробно описано ниже при исследовании пролонгированного высвобождения белка из частиц в опыте in vitro.

Рис. 4. Микрофотография отдельных микрокапсул, приготовленных из поли(3-гидроксибутирата) с белком ФИТЦ, меченным бычьим сывороточным альбумином, по методике В/М/В, полученная на конфокальном микроскопе. Зеленым показано распределение белка в структурах

Рис. 5. Реконструкция 3D-модели отдельных микрокапсул, приготовленных из поли(3-гидроксибутирата) с белком ФИТЦ, меченным бычьим сывороточным альбумином, по методике В/М/В, полученная с помощью конфокального микроскопа. Стрелками показаны участки скопления белка

Высвобождение белка in vitro. Полученные частицы ПГБ с загруженным белком были использованы в опыте по высвобождению БСА in vitro (рис. 6). Он проводился в течение более чем 190 ч (8 сут) в условно-физиологических условиях до того момента, когда выходящий белок перестал фиксироваться. При этом из-за невозможности расчета всего инкапсулированного белка (по причине того, что при необратимой адсорбции белка ПГБ и БСА образуют конгломерат, не растворимый ни в воде, ни в хлороформе) за 100% был принят весь высвободившийся белок. Иными словами, нас интересовал только так называемый полезный белок, обратимо адсорбированный на полимер, а затем высвободившийся из полимерных структур. Денатурированным, необратимо адсорбированным БСА мы пренебрегали.

Рис. 6. Кинетический профиль высвобождения белка из микрокапсул поли(3-гидроксибутирата)

По данным опыта были рассчитаны параметры инкапсулирования БСА:

эффективность инкапсулирования — 1,92±0,51%;

выход (продукция) микрокапсул — 46,62±5,9%;

величина первичного «взрывного» эффекта — 49,94±3,50%.

Как видно, эффективность инкапсулирования является довольно низкой — около 1,9%. Это обусловлено особенностями методики, в которой белок, изначально находящийся в виде раствора, подвергается сильным воздействиям. Именно поэтому данная методика может быть в дальнейшем применена лишь для белковых препаратов, получение которых относительно дешево и просто, таких как лизоцим, инсулин и другие. Остальные параметры частиц являются довольно приемлемыми. Значение первичного «взрывного» эффекта, характеризующего начальное взрывное высвобождение белка из полученных частиц, находящееся в районе 50%, означает, что частицы смогут обеспечить как целевую первичную доставку препарата в требуемой дозе, так и последующее длительное поддержание постоянной терапевтической концентрации в окружающей среде [16]. Значение выхода полимерных микроструктур также является приемлемым.

На рис. 6 отчетливо видно, что кинетический профиль высвобождения можно разделить на два этапа. На первом этапе высвобождения (от 0 до 5 ч) определяется «взрывной» эффект, характеризующийся сильным начальным выбросом белка. Предположительно в это время происходит десорбция вещества с поверхности частиц, охарактеризованная ранее. Затем (5–190 ч) наблюдается продолжительное высвобождение белка. Этот временной промежуток представляет собой наибольший интерес, так как процессы, происходящие в нем, и обеспечивают пролонгированное высвобождение БСА из полимерных микрокапсул. Для понимания механизма высвобождения были проведены различные морфологические исследования инкубированных частиц.

Определение механизма длительного высвобождения белка. Итак, как установлено с помощью конфокальной микроскопии, на этапе начального «взрывного» высвобождения белка происходит десорбция несвязанного белка с поверхности капсул. Следующим шагом нашего исследования стало изучение морфологии инкубированных частиц методами сканирующей электронной (рис. 7) и конфокальной (рис. 8) микроскопии. Для этого после завершения опыта по высвобождению белка in vitro образцы частиц были заморожены, а затем лиофилизированы.

Рис. 7. Образцы микрокапсул из поли(3-гидроксибутирата) с инкапсулированным белком после проведения опыта in vitro в течение 200 ч по данным сканирующей электронной микроскопии

Рис. 8. Микрофотография и ортогональные проекции отдельной микрокапсулы по данным конфокальной микроскопии

Как показано на изображениях, механизм высвобождения белка из микроструктур, полученных с помощью предлагаемой методики, представляет собой разрыв полимерных стенок с дальнейшим выходом белка из него. При этом белок легко выходит в окружающую среду. Более интересны данные, полученные с помощью конфокального микроскопа. На рис. 8 видно отверстие, через которое начал высвобождаться ФИТЦ, меченный БСА. Однако флюоресценция в месте разрыва полимерной оболочки гораздо выше, чем внутри частицы. Это связано, по-видимому, с возникновением дефектов материала, имеющего, как известно, полукристаллическую структуру. В связи с изменением укладки цепей ПГБ адсорбция выходящего белка на материал локально повышается и возникает картина, представленная на микрофотографии, а также на ортогональных проекциях данной микрочастицы. Подобный процесс пока подробно не описан и требует дополнительного изучения.

Определение биосовместимости полученных микрочастиц in vivo. Имплантация микрокапсул крысам не вызвала развития у них значительного воспаления или септических очагов. На 7-й день наблюдали увеличение кровоснабжения в месте имплантации и образование соединительнотканной капсулы вокруг микрочастиц.

На гистологических срезах (рис. 9) хорошо заметно формирование капсулы, имеющей толщину 100–150 мкм, которая достигает окончательного размера через 60 дней имплантации. Отмечено также прорастание окружающей ткани между микрочастицами. Присутствие лейкоцитов и фибробластов вокруг микрочастиц говорит об умеренном воспалении и является нормальной реакцией на имплантат, замещающийся тканью организма, а также обусловлено процессом деградации полимера [12]. Также к 60-му дню становится хорошо заметно сглаживание поверхности микрокапсул, что говорит о значительной биорезорбции ПГБ. Это хорошо согласуется с результатами, полученными ранее в нашей лаборатории [11].

Рис. 9. Микрофотографии участков мышечной ткани непосредственно в месте имплантации микрокапсул спустя 7 дней (а), 21 день (б), 60 дней (в)

Таким образом, микрокапсулы из поли(3-гидроксибутирата), в которые инкапсулирован модельный белок, представляют собой удачный пример создания пролонгированной формы препарата белковой природы. При этом микрокапсулы показали достаточно хорошие результаты в опытах по биосовместимости in vivo. Детальное изучение таких полимерных частиц будет способствовать глубокому осмыслению процесса вы свобождения белков из них, лучшему пониманию реакции организма на систему высвобождения модельного белка, а также позволит выбрать правильное направление дальнейшего развития исследований по данной тематике.

Заключение. Разработанная система пролонгированного высвобождения белков, основанная на использовании в качестве микрокапсул нового биоразлагаемого полимера — поли(3-гидроксибутирата), а в качестве модельного белка — бычьего сывороточного альбумина, может служить основой для создания новых лекарственных форм терапевтических белков.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда, соглашение №15-15-10014 от 01.06.2015 г.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.