Биосовместимые синтетические матриксы трахеи на основе полимерных ультраволокнистых материалов, колонизированные мезенхимальными мультипотентными клетками

Поражения трахеи, возникающие вследствие злокачественных новообразований, травм и врожденных аномалий, часто требуют ее резекции. При этом формирование первичного анастомоза «конец-в-конец» возможно менее чем у 50% пациентов с данной патологией [1–3]. В остальных случаях для замещения значительных дефектов трахеи требуется использование имплантатов. В настоящее время отсутствуют применяемые в клинической практике протезы, соответствующие по своим биологическим, конфигуративным и механическим свойствам нативной трахее. Наиболее перспективным направлением для создания биоимплантатов трахеи считается использование тканеинженерных подходов [1–6]. Первая успешная трансплантация биоинженерной конструкции, созданной из децеллюляризированной донорской трахеи, заселенной клетками реципиента, была выполнена пациентке с терминальной стадией бронхомаляции в 2008 г. [7]. Поскольку использование донорской трахеи имеет ряд ограничений, а процедура децеллюляризации может приводить к нарушению механических свойств имплантата и достаточно трудоемка, в последние годы для этих целей используют различные синтетические матриксы на основе нанокомпозитных или ультраволокнистых материалов, способных заселяться мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками (ММСК) костного мозга [3, 8–10]. Несмотря на несомненный прогресс в данной области, пока не удалось создать конструкцию, сочетающую в себе оптимальные механические свойства, химическую стабильность и структуру, обеспечивающую колонизацию клетками реципиента и межклеточные взаимодействия. Поэтому актуальны дальнейшие исследования, которые направлены на создание гибридных синтетических и природных матриксов, сочетающих оптимальные механические свойства и стабильность с биосовместимостью.

Цель исследования — оценка биосовместимости, биодеградации и способности к колонизации клетками реципиента синтетических матриксов трахеи на основе ультраволокнистых полимерных материалов.

Материалы и методы. Синтетические матриксы трахеи для исследований на собаках были получены из нетканого материала методом электроспиннинга на оригинальной опытной однокапиллярной установке для электроспиннинга. В качестве полимера для нетканого материала использовали фторопласт 42В (сополимер тетрафторэтилена с винилиденфторидом) (ОАО «ХимКомбинат», Россия). Кольца, армирующие нетканый полимерный материал, получали методом терм­о­прессования, в качестве исходного материала использовали полиуретан марки Elastollan 1195 A (Elastogran, Германия) (рис. 1).

---

Рис. 1. Образец матрикса трахеи на основе полимерных ультраволокнистых материалов для экспериментов на собаках

---

Оценка механических свойств образцов проведена с помощью универсальной испытательной машины Instron 5965 (Instron, США) с компьютерной системой анализа данных в рабочем режиме.

Исследования выполнены на 6 собаках породы бигль (1 самка и 5 самцов) возрастом 4,0±1,2 года, со державшихся в условиях вивария и отделения экспериментальной терапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Все манипуляции с лабораторными животными выполнены в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложенными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.), требованиями Хельсинкской декларации (принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия)) и Всемирной медицин­ской ассоциации (2000).

Для улучшения биосовместимости и ускорения интеграции матриксы трахеи заселяли ММСК собак-реципиентов. ММСК генерировали из клеток костного мозга, полученных в результате стернальной пункции. Клетки костного мозга помещали в культуральные стерильные флаконы с питательной средой RPMI 1640 («ПанЭко», Россия), содержащей 10% эмбриональной фетальной сыворотки («ПанЭко», Россия). Проводили два пассажа, удаляя неадгезивные клетки. Анализ культуры ММСК осуществляли с использованием инвертоскопа Axiovert 40 (Carl Zeiss, Германия) в просвечивающем или фазово-контрастном режиме. Гистологическое исследование выполняли по стандартной методике, срезы окрашивали гематоксилин-эозином («ПанЭко», Россия), препараты просматривали и фотографировали с использованием светового микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия). Уровень экспрессии поверхностных маркеров ММСК определяли методом проточной цитометрии на цитофлюориметре BD FACS Canto II (Becton Dickinson, США) с помощью антител CD45, CD90, CD105, конъюгированных с флюорохромами (Becton Dickinson, США).

Заселение стерильных матриксов осуществляли посредством их инкубации со взвесью ММСК в питательной среде при 37°С и 4,5% СО₂ в течение 7 сут, периодически встряхивая культуральный флакон. Контроль колонизации матрикса ММСК выполняли посредством снятия отпечатков с поверхности фрагментов имплантата на предметное стекло, покрытое полилизином (Thermo Scientific, США), и последующего окрашивания по Романовскому–Гимзе [11].

Гетеротопная имплантация матриксов трахеи, заселенных аутологичными ММСК, ex vivo проведена 6 собакам породы бигль: матриксы имплантировали в межмышечное пространство бедренной складки. С этой целью у собак формировали межмышечный карман, в который помещали образец матрикса, а затем послойно сшивали края раны с наложением прерывистых хирургических швов и финишной обработкой внешнего шва и окружающего участка кожи антисептиками. Операции проводили под общей анестезией с соблюдением требований асептики и антисептики в условиях операционного блока отделения экспериментальной терапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина.

Наблюдение за животными осуществляли в течение 1 мес. В этот период проводили ежедневный визуальный осмотр области операции, выполняли регулярный анализ гематологических показателей с использованием анализатора (ProCyte Dx, Нидерланды), специально откалиброванного для исследования крови собак. Собак-реципиентов исследовали на компьютерном томографе SOMATOM Sensation 64 (Siemens, Германия). Послойный анализ осуществляли в различных плоскостях пояснично-крестцовой области с захватом области мечевидного отростка грудины. Через 30–35 сут после имплантации образцов матрикса их изымали под общей анестезией для микроскопического и гистологического исследования.

Для установления степени значимости выявленных изменений был проведен анализ множества связанных индивидуализированных выборок с использованием критерия Фридмана, модуля «Непараметрическая статистика» программы Statistica 6.0 (StatSoft). Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение. Образцы синтетических матриксов трахеи имели трубчатую форму и по своим размерным характеристикам и механическим свойст­вам существенно не отличались от нативной трахеи собак. Различия не превышали 30% (табл. 1, 2).

---

Таблица 1. Средние значения размерных характеристик нативной трахеи собак и матриксов, мм

---

Таблица 2. Упругость фрагментов матрикса, армированного полукольцами на основе полиуретана, и нативной трахеи

---

Перед имплантацией животным стерильные матриксы колонизировали ex vivo ММСК, полученными из клеток костного мозга реципиентов посредством кокультивирования в питательных средах. Целевые клетки были представлены преимущественно крупными клетками полигональной или веретеновидной формы с длинными отростками, контактирующими между собой. Ядра клеток — умеренно оксифильные, округлой или овальной формы с центрально расположенными ядрышками. Вся площадь дна флакона была покрыта относительно равномерным конфлюэнтным клеточным монослоем (рис. 2). Анализ иммунофенотипа клеток 2-го пассажа позволил установить, что субпопуляция CD45^–CD90⁺CD105⁺-клеток составляла не менее 65%.

---

Рис. 2. Морфология ММСК собак в культуре: а — живая культура, ×200; б — окраска клеток по Романовскому–Гимзе, ×900

---

Проведенные морфологические исследования и оценка иммунофенотипа полученных клеток позволили характеризовать их как ММСК.

Анализ отпечатков с поверхностей матриксов позволил охарактеризовать обнаруженные ММСК: они отличаются увеличенными ядрами и формируют очаги колониеобразования, что указывает на сохранение пролиферативного потенциала ММСК в матриксе трахеи (рис. 3).

---

Рис. 3. Клеточный состав поверхности матрикса: а — ×200; б — ×900. Окраска клеток по Романовскому–Гимзе

---

Заселенные ММСК матриксы трахеи гетеротопно имплантировали собакам в сформированный межмышечный карман в паховой области (рис. 4).

---

Рис. 4. Основные этапы гетеротопной трансплантации собаке образцов матрикса, нагруженных ММСК: а — формирование межмышечного кармана; б — имплантированный образец матрикса трахеи

---

После гетеротопной имплантации экспериментальных образцов с целью контроля за возможным развитием системной реакции отторжения имплантата или воспаления периодически проводили клинический анализ крови собак. Оценивали лейкоцитарную формулу и абсолютное содержание лейкоцитов, поскольку изменение именно этих гематологических показателей прямо коррелирует с развитием каскада клеточных реакций, реализующих отторжение трансплантата [12, 13]. Полученные данные показали, что в течение месяца после имплантации гематологические показатели у животных-реципиентов колебались в пределах физиологической нормы (табл. 3). В частности, у собак не наблюдали лейкоцитоза, моно- или нейтрофилеза, что свидетельствует об отсутствии признаков системной реакции отторжения.

---

Таблица 3. Статистический анализ динамики гематологических показателей собак после гетеротопной трансплантации образцов матрикса трахеи, нагруженных аутологичными ММСК

---

Через 20–25 сут после операции животным под общей анестезией проводили процедуру КТ. Полученные данные позволяют заключить, что экспериментальные образцы в организме животного не потеряли таких важнейших признаков функциональности, как сохранение каркасности матрикса, обеспечивающего внутренний просвет в форме, близкой к окружности, а также физическую целостность (рис. 5).

---

Рис. 5. Данные КТ матрикса трахеи на основе ультраволокнистого фторопласта на 25-й день после гетеротопной трансплантации собаке (краниокаудальная проекция)

---

При визуальном осмотре области имплантации в течение всего периода наблюдения не выявлено местных реакций отторжения: отека, нагноения, покраснения, появления свищей, массированного разрастания фиброзной ткани в области имплантации (рис. 6, а).

---

Рис. 6. Синтетический матрикс трахеи, колонизированный ММСК, через 35 сут после гетеротопной трансплантации: а — паховая область собаки-реципиента через 35 сут после трансплантации образца матрикса; б — общий вид синтетического матрикса трахеи после извлечения из тканей организма реципиента. Стрелкой отмечена соединительнотканная капсула, покрывающая матрикс трахеи

---

Извлеченный из паховой складки через 1 мес после имплантации матрикс трахеи сохранил форму, а также каркасные свойства и был покрыт интимно связанной с тканью матрикса соединительнотканной капсулой (рис. 6, б). Морфологическое обследование окружающей ткани в области имплантации не выявило воспалительного экссудата. Не обнаружено признаков воспалительной лейкоцитарной инфильтрации, которая в случае развития острого отторжения формирует «клеточный вал отторжения», реализуя клеточную деструкцию чужеродного импланта­та [13].

В извлеченном матриксе трахеи наряду с сохранением ультраволокнистой структуры обнаружена мощная колонизация клетками реципиента, с формированием сосудов и соединительнотканных волокон, распространяющаяся с поверхности в глубь имплантата (рис. 7). Данные КТ и макро-, микроморфологического исследования свидетельствуют о сохранении формы, каркасности и составных элементов (неразрушенные волокна фторопласта и полиуретановые полукольца) синтетических матриксов и об отсутствии признаков биодеградации испытанных экспериментальных образцов.

---

Рис. 7. Активная колонизация волокон слоя нетканого матрикса трахеи клетками ре­ципиента

---

Заключение. Исследование образцов синтетических матриксов трахеи на основе полимерных ультраволокнистых материалов, колонизированных мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, свидетельствует о сохранении физических свойств (размер, конструкционные особенности, целостность), функциональных характеристик (каркасность, прочность, упругость), исходной структуры (упорядоченные волокна основы матрикса, армированные полукольцами) и отсутствии местных и системных признаков отторжения при гетеротопной имплантации их в течение 1 мес. Образцы матриксов сохраняли также целостность и просвет, обеспечивали колонизацию их клетками реципиента, не обладали общетоксическим эффектом и не подвергались биодеградации под воздействием внутренней среды организма. Эти данные позволяют сделать вывод об оптимальной биосовместимости разработанных матриксов и перспективности их использования в качестве биоимплантатов для замещения дефектов трахеи.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (Соглашение №14.604.21.0023 от 17.06.2014 г. о предоставлении субсидии, уникальный идентификатор прикладных научных исследований RFMEFI60414X0023).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.