Биораспределение конъюгата аминоамидного производного хлорина е6 с наночастицей бора для задач бор-нейтронозахватной терапии

Бор-нейтронозахватная терапия (БНЗТ) — метод лучевой терапии злокачественных новообразований, характеризующийся чрезвычайно высокой биологической эффективностью за счет целенаправленной доставки энергии излучения непосредственно в опухолевые клетки. Данный метод основан на относительно избирательном накоплении в раковых клетках нерадиоактивного изотопа ¹⁰В и его последующей активации потоком тепловых нейтронов [1, 2]. Несмотря на высокую эффективность метода, продемонстрированную в эксперименте и клинике [3], до настоящего времени БНЗТ не может перешагнуть рамки клинических испытаний. Этому есть несколько причин, но одна из основных — отсутствие эффективных методов доставки бора в опухолевые клетки. Единственные разрешенные для клинического применения соединения (L-p-дигидроксиборилфенилаланин — BPA и динатриевая соль меркаптоундекагидро-клозо-додекабората — BSH) не обладают высокой селективностью накопления в опухолевой ткани [4–7].

Для решения задачи направленной доставки бора в опухолевые клетки предложены различные стратегии синтеза конъюгатов борсодержащих соединений с биологически активными молекулами, способными накапливаться в опухолевых клетках (предшественники нуклеиновых кислот, аминокислоты и пептиды, углеводы, акридины, различные полиамины, а также порфирины и фталоцианины) [1, 2, 8, 9]. Одним из наиболее перспективных направлений в области создания препаратов для БНЗТ является использование конъюгатов порфиринов с полиэдрическими соединениями бора. Изучение борированных порфиринов для БНЗТ впервые было проведено в 1988 г. G. Oenbrinkс соавт. Установлено, что порфирины и их борные производные способны накапливаться во многих солидных опухолях и представляют собой препараты «двойного назначения»: как агенты доставки бора и как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии [10]. Данный класс соединений представляет собой связанные через линкер хлорин и борный полиэдр [11]. Его представители эффективно накапливаются в опухолевых клетках, а использование карборанов в качестве борного элемента в молекуле дает возможность увеличить концентрацию изотопа в опухоли и обеспечивает стабильность борной части [12].

Необходимым этапом, предшествующим клиническим испытаниям, является исследование фармакокинетики борсодержащих порфиринов, оценка их способности накапливаться и задерживаться в опухоли в более высокой концентрации по сравнению с нормальными тканями, а затем выводиться из организма. Поскольку изотоп ¹⁰B не является радиоактивным, он не может быть использован в качестве радиоактивной метки и детектирован с помощью соответствующих методов. В этой ситуации ключевым преимуществом борсодержащих порфиринов является их способность флюоресцировать, что значительно облегчает анализ локализации и распределения препарата в клетках и живых организмах с использованием методов флюоресцентного имиджинга ex vivo и in vivo [13, 14]. Данные методы позволяют исследовать биораспределение флюорофора в организме, оценивая его накопление в опухоли и нормальных тканях.

Цель исследования — изучение биораспределения конъюгата аминоамидного производного хлорина е₆ с бис-дикарболлидом кобальта как потенциального транспортера бора для решения задач бор-нейтронозахватной терапии.

Материалы и методы

Исследуемое соединение, конъюгат аминоамидного производного хлорина е₆ с бис-дикарболлидом кобальта (длина аминоалкиламидного линкера n=6) (рис. 1, а), было синтезировано разработанным нами ранее способом [15].

Рис. 1. Структурная формула: черные шарики С-Н, белые шарики В-Н, серый шарик В (а), а также спектры поглощения ε и флюо­ресценции Iфл конъюгата аминоамидного производного хлорина е6 с бис-дикарболлидом кобальта (б)

Спектры поглощения и флюоресценции конъюгата оценивались на спектрофотометре-спектрофлюориметре Synergy MX (BD, США).

Животные и опухолевая модель. Эксперименты in vivo проводили в полном соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Исследование было одобрено Этическим комитетом Нижегородского государст­венного университета им. Н.И. Лобачевского. Анализ биораспределения борсодержащего конъюгата был выполнен на мышах линии Balb/c (самки, 18–20 г, n=9), полученных из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (Пущино Московской области). Животных содержали в стандартных условиях вивария при 12-часовом световом дне.

Для получения экспериментальных опухолей использовали линию мышиной карциномы толстой кишки CT-26 (номер CRL-2638 по каталогу ATCC^®). Культивирование клеток проводили в среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержащей 2 мM L-глутамина («ПанЭко», Россия) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), при 37°С и 5% СО₂, в культуральных флаконах площадью 75 см². На каждом этапе пассирования клетки обрабатывали 0,25% раствором трипсина и версена («ПанЭко», Россия). Субкультивирование выполняли через 2–3 сут по достижении культурой 80% конфлюентности [16].

Для выращивания экспериментальных опухолей животным (n=9) подкожно в область бедра вводили суспензию 1 млн клеток CT-26 в 100 мкл 10 мМ фосфатно-солевого буфера («ПанЭко», Россия). Эксперимент начинали на 9–10-й день после введения, когда диаметр опухолевого узла достигал 9 мм.

В исследовании использовали исходный раствор конъюгата в кремофоре с концентрацией активного вещества 2 мг/мл, который был разбавлен физиологическим раствором до концентрации 1 мг/мл. В контрольной группе (n=3) воздействие препаратом не проводилось. Трем мышам вводили исследуемое вещество в дозе 5 мг/кг массы тела, трем мышам — в дозе 10 мг/кг. Раствор вводили в кровоток через хвостовую вену. Объем инъекции составлял 100 мкл. Через 3 ч после введения борсодержащего конъюгата животных умерщвляли путем дислокации шейных позвонков. Для последующего микроскопического исследования получали образцы следующих органов и тканей: опухоли, поперечно-полосатой мышцы, кожи, печени, почки, селезенки, тонкого кишечника, легких.

Приготовление образцов и микроскопическое исследование. Опухоль целиком препарировали из окружающей ткани и рассекали по продольной оси в плоскости, перпендикулярной поверхности бедра. Разрез мышцы бедра производили вдоль направления волокон, разрез почки — по сагиттальной плоскости органа. Продольные срезы печени, легкого и селезенки делали в толще этих органов. Микроскопический анализ образцов выполняли непосредственно после их получения, без процедуры фиксации или заморозки. На протяжении исследования поддерживали влажность препаратов путем смачивания физиологическим раствором.

Изображения получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Axiovert 200M LSM510 META (Carl Zeiss, Германия) с использованием масло-иммерсионного объектива Plan-Apochromat с увеличением ×40 и числовой апертурой 1.3. Латеральное разрешение изображений составило 1024×1024 пикселя, размер пикселя — 0,22 мкм. Флюоресценцию конъюгата возбуждали при длине волны 514 нм, сигнал регистрировали с помощью спектрального модуля META в диапазоне 560–710 нм с шагом 10 нм. Спектральная информация позволяла идентифицировать сигнал наноконъюгата на фоне автофлюоресценции тканей. Все изображения получены при идентичных условиях.

Статистическая обработка данных. С помощью программного обеспечения микроскопа из полученного спектрального изображения выделяли канал, соответствующий принимаемому сигналу флюоресценции в диапазоне 650–693 нм. Используя программу ImageJ (версия 1.47v), определяли средний уровень сигнала по площади каждого изображения исследованных образцов опухоли и нормальных тканей. Для каждого образца нормальных тканей анализировали от 3 до 5 полей зрения. При изучении образцов опухолевой ткани случайным образом выбирали поля зрения из центральных и периферических участков опухолевого узла (не менее 5 полей зрения для каждого образца). Данные представлены как среднее значение сигнала в условных единицах ± стандартное отклонение для малых выборок. При сравнении значений использовали однофакторный дисперсионный анализ и критерий Даннета.

Результаты и обсуждение. Первым этапом исследования было изучение оптических свойств полученного конъюгата аминоамидного производного хлорина е₆ с бис-дикарболлидом кобальта. Соединение характеризовалось интенсивным поглощением света в видимой области спектра с пиками при 405, 500 и 665 нм, что близко по значениям к пикам хлорина е₆ (рис. 1, б). Максимум флюоресценции наблюдался при 670 нм. Эксперименты, проведенные ранее на клеточных культурах [14], показали интенсивное поглощение данного конъюгата опухолевыми клетками линии А549 с коэффициентом накопления клетки/среда ≈80. Это свойст­во позволяет предположить возможность достижения терапевтической дозы, необходимой для проведения БНЗТ, при большем контрасте с нормальной тканью и меньшей итоговой токсичности in vivo. Результаты, полученные in vitro, послужили основой для начала работы на опухолевых моделях in vivo. Выбор экспериментальной модели CT-26 был обусловлен высокой васкуляризацией формирующейся опухоли [17].

Изучение образцов опухолевой ткани выявило появление в ней интенсивного сигнала флюоресценции (рис. 2, а) при обеих исследованных дозах наноконъюгата через 3 ч после инъекции. Максимум флюоресценции наблюдался при 665–670 нм (рис. 2, б), что соответствует спектру исследуемого конъюгата.

Рис. 2. Изображения образцов ткани опухоли контрольного животного и животного после инъекции наноконъюгата (10 мг/кг, 3 ч после введения) (а), а также спектры флюоресценции Iфл участков, выделенных кружком (б). Размер изображений — 225×225 мкм

Характерной особенностью накопления флюорофора в опухоли была неравномерность его распределения в различных участках (рис. 3). Можно предположить, что данный феномен обусловлен так называемым EPR-эффектом (enhanced permeability and retention effect), т.е. особенностями cосудистого русла опухоли, в том числе неравномерностью и хаотичностью формирующихся сосудов [18].

Рис. 3. Изображение участков с различным накоплением наноконъюгата (1, 2) в ткани опухоли животного после инъекции препарата (10 мг/кг, 3 ч после введения), демонстрирующее неоднородность его распределения (а), а также спектры флюоресценции Iфл этих участков (б). Размер изображения — 125×125 мкм. Цветовая кодировка, как на рис. 2

Характеристичный пик флюоресценции конъюгата был обнаружен в большинстве исследованных органов, при этом была отмечена значительная избирательность накопления соединения (рис. 4). Высокий уровень накопления конъюгата зарегистрирован в печени, почках, селезенке и легочной ткани, что соответствует данным фармакокинетики, полученным для препаратов хлоринового ряда, и связано с морфофункциональными особенностями этих органов [19]. Сигнал конъюгата в скелетных мышцах, а также в мышечных стенках полых органов (желудок, кишечник, сердце) был существенно ниже. Кроме того, отмечено практически полное отсутствие накопления конъюгата в образцах кожи. Через 3 ч после инъекции значительное количество вещества оставалось в кровеносном русле и регистрировалось в крупных сосудах различных органов (для примера на рис. 4 показаны сосуды, питающие скелетную мышцу).

Рис. 4. Изображения образцов тканей животного через 3 ч после введения наноконъюгата (10 мг/кг). Размер изображений — 225×225 мкм. Цветовая кодировка, как на рис. 2

Количественный анализ уровня сигнала флюоресценции в образцах тканей позволил выявить зависимость накопления наноконъюгата от введенной дозы препарата. После введения препарата в дозе 5 мг/кг содержание его в опухоли практически не отличалось от содержания в мышечной ткани и коже; максимальное накопление препарата отмечалось в печени (рис. 5).

Рис. 5. Уровень сигнала флюоресценции Iфл образцов тканей у контрольных животных и животных с введением различных доз наноконъюгата. * — статистически значимое отличие от контроля

При повышении дозы до 10 мг/кг содержание наноконъюгата в опухоли оказалось сравнимым с его содержанием в печени, а отношение сигналов флюоресценции опухоль/мышца составило ~3. Необходимо отметить высокое значение стандартного отклонения уровня сигнала в опухоли при введении наноконъюгата в дозе 10 мг/кг, что соответствует результатам микроскопического исследования, когда в опухоли были выявлены участки как с очень высоким, так и со средним по величине сигналом (см. рис. 3).

Таким образом, предварительное исследование показало, что изученный борсодержащий конъюгат хлорина в достаточной мере отвечает тем требованиям, которые предъявляются к препаратам для БНЗТ [2]. В частности, соединение продемонстрировало способность к относительно селективному накоплению в опухоли с соотношением его содержания «опу­холь/нормальная ткань» как 3:1. Препарат продемонстрировал низкое накопление в коже, что позволяет предположить низкую фототоксичность и безопасность применения препарата на свету. Способность хлорина флюоресцировать дает возможность контроля содержания бора в тканях методами in vivo. Данные факты позволяют сделать вывод о перспективности использования борсодержащих конъюгатов в качестве агентов доставки бора для БНЗТ. Следующим этапом работы будет исследование фармакокинетики конъюгата, а также анализ содержания бора в опухоли и нормальных тканях с целью разработки оптимальных режимов введения препарата и последующего радиационного воздействия.

Заключение. Исследование биораспределения конъюгата фотосенсибилизатора (хлорина е₆) с бис-дикарболлидом кобальта продемонстрировало перспективность его использования в качестве средст­ва доставки бора в опухоль. Уровень накопления препарата в опухолевой ткани зависит от введенной дозы.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке проекта РФФИ №14-02-00715.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутст­вии конфликта интересов.