Мультимодальная оптическая когерентная томография как метод визуализации состояния нервной ткани при глиальных опухолях головного мозга (экспериментальное исследование)

Операции на головном мозге сопровождаются рисками появления неврологического дефицита, особенно при манипуляциях в функционально значимых зонах. Кроме того, при инфильтративно растущих новообразованиях хирург сталкивается с трудностями определения их границ и соблюдения баланса между радикальностью и физиологической дозволенностью. Все это обусловливает внедрение в нейрохирургию технологических решений для точного планирования операции как до разреза кожи путем нейронавигации, так и непосредственно по его ходу путем использования различных методов интраоперационной диагностики уточнения границ и локализации опухоли (флюоресцентной навигации, ультразвукового сканирования, видеоангиографии и т.д.), что позволяет проводить вмешательства с максимальной точностью и с минимальной травматизацией мозговых структур [1]. В то же время ни один из этих методов не удовлетворяет полностью требованиям нейрохирурга. Так, в частности, получившая наибольшее распространение в хирургии злокачественных глиом 5-ALA-навигация дает как ложно-положительные, так и ложно-отрицательные результаты, поскольку информация о границах опухоли опосредована и реализуется через особенности ее метаболизма. И потому обоснован поиск новых путей интраоперационного уточнения границ опухоли на основе получения прямой информации о строении нормальной и патологически измененной ткани мозга. В настоящее время наиболее перспективными в этом отношении выглядят инструменты оптической диагностики, в частности мультимодальная оптическая когерентная томография (ММ ОКТ).

Оптическая когерентная томография — новый и активно развивающийся метод прижизненной диагностики в нейрохирургии, который имеет высокий потенциал в качестве инструмента определения состояния нервной ткани в ходе оперативных вмешательств. Используемая в данной работе установка для ММ ОКТ сконструирована с учетом предыдущего опыта построения подобных систем и существенно расширяет набор получаемых данных. Это стало возможным потому, что стандартный режим ОКТ (детекция обратного рассеяния, зондирующего излучения тканями), который направлен на оценку ткани опухоли в масштабе ~10 мкм, дополнен поляризационной модой и динамической микроангиографией. Внедрение ММ ОКТ-исследования в клиническую практику потенциально может позволить получить широкий набор данных о состоянии ткани мозга в ходе нейрохирургических вмешательств. Но для этого необходимо проведение экспериментальных исследований на опухолевых моделях животных для отработки методики ММ ОКТ-исследования и выработки алгоритма оценки получаемой информации. В связи с этим работа проведена на модели глиальной опухоли мозга крысы в условиях, максимально приближенных к стандартным нейрохирургическим процедурам.

Цель исследования — изучение возможностей мультимодальной ОКТ в дифференциации нормальной и патологически измененной ткани головного мозга на примере экспериментальной модели глиобластомы.

Материалы и методы. Исследования выполнены на экспериментальной установке скоростной спектральной ММ ОКТ (рис. 1), разработанной в ИПФ РАН (Н. Новгород, Россия) и включающей два режима исследования: кросс-поляризационную ОКТ (КП ОКТ) и спектральную микроангиографическую ОКТ (МА ОКТ).

Рис. 1. Система для получения ММ ОКТ-изображений: а — устройство мультимодальной ОКТ; б — зонд с торцевым окном

Характеристики установки. В основе работы прибора лежит спектральный принцип приема сигнала [2–6]. В режиме КП ОКТ установка имеет активную систему управления для поддержания круговой поляризации на выходе из зонда, что решает проблему взаимной ориентации зонда и ткани [7]. Получаемое КП ОКТ-изображение включает в себя верхнее — в ко-поляризации и нижнее — в кросс-поляризации, которые получены путем раздельной регистрации рассеянного излучения в двух каналах, соответственно параллельном и перпендикулярном поляризации зондирующего излучения. Специальные программные приложения позволяют создавать объемные (3D) изображения и на основе оригинального подхода [8] рассчитывать изображения микрососудистой сети.

Технические характеристики установки ММ ОКТ

Стандартный режим — получение интенсивностного изображения (ко-поляризация):

длина волны — 1310 нм;

скорость — 20 000 А-сканов в секунду;

мощность источника — 15 мВт;

поперечное разрешение — 20 мкм;

разрешение по глубине — 10–15 мкм;

сканирование по глубине в воздухе — 2 мм;

тип сканирования — бесконтактное;

максимальный размер получаемого изображения — 4×2 мм.

Дополнительные режимы:

кросс-поляризация (КП ОКТ) — построение в реальном масштабе времени изображения в кросс-поляризационном режиме размером до 4×2 мм;

3D КП ОКТ — построение в реальном масштабе времени объемных изображений в ко- и кросс-поляризациях, каждое из которых объемом 4×4×2 мм (планарные размеры × глу­бина);

микроангиографическая ОКТ — запись данных для последующего построения en face проекции микроциркуляторного русла площадью 2×2 мм [8].

Физический принцип выделения сосудистой сетки (МА ОКТ) основан на определении временнόй изменчивости полного комплексного сигнала в каждом элементе изображения, формирующего спекл-структуру. В тех местах, где рассеивающие элементы подвижны, фаза и амплитуда комплексного сигнала спекловых пятен изменяются от скана к скану значительно быстрее по сравнению с окружающей тканью, что позволяет судить о наличии текущей крови в таких местах. Обработка основана на пространственно-временнόй фильтрации последовательно записанных сильно перекрытых А-сканов при медленном латеральном сканировании (так называемый режим M-Mode like OCT) [8]. Для выделения потоков частота отсечки фильтра верх­них частот выбрана равной 96 Гц. При данном параметре фильтрации визуализируются места с наличием кровотока (места, где кровь находится в стационарном состоянии, не визуализируются).

Экспериментальные опухолевые модели. Учитывая необходимость исследования возможностей ММ ОКТ в визуализации и дифференциальной диагностике неизмененной нервной ткани и опухоли, выбор экспериментальной модели злокачественной опухоли основывался на следующих критериях: 1) опухоль должна происходить из глиальных клеток; 2) опухолевый рост и возникшие в результате него изменения должны быть предсказуемыми и репродуцируемыми; 3) по своим свойствам опухоль должна иметь характеристики, подобные характеристикам глиом человека при интрацеребральном росте: неоваскуляризацию, нарушение гематоэнцефалического барьера, отсутст­вие капсулы и инвазивный характер роста. Этим критериям удовлетворяют химически индуцируемые модели глиом [9, 10].

В качестве объекта исследования была выбрана модель глиобластомы крысы 101.8, привитая и поддер­живаемая в НИИ морфологии человека (Россия). Первоначально опухоль получена в 1967 г. в результате имплантации 7,12-диметил-(а)-бензантрацена в правую гемисферу мозжечка крысы-самки линии Wistar. В процессе серийного интрацеребрального пассирования начиная с 14-го пассажа произошло формирование злокачественной опухоли по гистобиологическим свойствам, близким анапластической астроцитоме, а затем опухоль приобрела однородное строение глио­бластомы, которое устойчиво сохраняется на протяжении последующей работы с данной моделью [9].

Работа выполнена на 5 самках крыс линии Wistar с привитой глиобластомой крысы 101.8. Трансплантация опухоли была проведена в Институте морфологии человека следующим методом: в правой теменной области латеральнее сагиттального шва на 2 мм и кзади от коронарных швов на 2 мм зубоврачебным бором наложено фрезевое отверстие диаметром 2 мм. Твердую мозговую оболочку вскрывали инъекционной подкожной иглой. Опухолевые клетки в количестве 10⁵–10⁶ введены в указанную зону троакаром.

Исследование проводили на 7-е сутки после прививки глиобластомы крысы 101.8, когда опухоль достигала размеров ~0,7 см и распространялась на кору головного мозга.

Оперативное вмешательство выполняли по общим правилам, описанным в ряде работ [11–14]. Запись сигнала КП ОКТ с формированием ко- и кросс-поляризационных изображений проводили in vivo после трепанации черепа и ex vivo на извлеченном после декапитации головном мозге. Для верификации структуры нервной ткани на КП ОКТ-изображениях образцы головного мозга с опухолями забирались для параллельного гистологического анализа. Образцы фиксировали в 10% формалине в течение 48 ч, делали несколько срезов из центральной области, совпадающей с плоскостью получения КП ОКТ-изображения и окрашивали гематоксилином и эозином. Срезы описывались морфологом и фотографировались в проходящем свете с помощью микроскопа Leica DM2500 DFC (Leica Microsystems, Германия), оснащенного цифровой камерой.

Построение изображений сосудистого русла с помощью МА ОКТ производили на основании обработки сигналов, полученных in vivo. Данные сопоставляли с соответствующими изображениями сосудистой сети, полученными при помощи флюоресцентной стереомикроскопии Axio Zoom.V16 (Carl Zeiss, Германия).

При работе с животными руководствовались Пра­ви­лами для проведения работ с использованием экс­периментальных животных [15] и Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных [16], неукоснительно соблюдали этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Работа одобрена Этическим комитетом НижГМА.

Результаты и обсуждение. ММ ОКТ исследование проведено на всем протяжении коры пораженного полушария. Полученные КП ОКТ-изображения представлены на рисунках 2 и 3, где отчетливо визуализируются три области, различающиеся между собой по характеру сигнала.

Рис. 2. КП ОКТ-визуализация мозга крысы с привитой глиомой 101.8: а — изображение в ко-поляризации; б — изображение в кросс-поляризации: синий пунктир — область деструкции коры опухолевым узлом; зеленый пунктир — перитуморальная область; желтый пунктир — область неизмененной коры; изображения а и б состоят из нескольких КП ОКТ-изображений, длина каждого — 13,5 мм; в–з — трехмерные (3D) построения участков коры в ко- (в, г, д) и кросс-поляризациях (е, ж, з): в, е — область деструкции коры опухолевым узлом; г, ж — перитуморальная область; д, з — область неизмененной коры

Рис. 3. Гистотомографическое сопоставление КП ОКТ-изображения мозга крысы с участком деструкции глиобластомой 101.8, приведенной на рис. 2: а — изображение в ко-поляризации; б — изображение в кросс-поляризации; в — гистологический препарат того же участка головного мозга (окраска гематоксилином и эозином, 12,0×3,0 мм): синий пунктир — область прорастания опухоли (деструкции коры опухолевым узлом); зеленый пунктир — перитуморальная область; желтый пунктир — область неизмененной коры; г–ж: отдельные участки гистологического препарата, размер 0,49×0,65 мм; г — опухоль с участками влажного некроза; д — участок кровоизлияния в опухоли; е — распространение опухоли в коре головного мозга в виде отдельных тяжей опухолевых клеток; ж — участок неизмененной коры

В области неизмененной коры (рис. 2, а, б и 3, а, б; область внутри желтого пунктира) на КП ОКТ-изображениях в ко-поляризации наблюдается однородный сигнал, глубина проникновения зондирующего излучения при этом максимальна. Неизмененная кора в этой области содержит 6 слоев клеток и волокон, отличающихся пространственно упорядоченным расположением (рис. 3, ж). Такое хорошо ориентированное горизонтально-вертикальное распределение структурных элементов формирует однородный ОКТ-сигнал.

В перитуморальной области (рис. 2, а, б и 3, а, б; область внутри зеленого пунктира) ОКТ-сигнал становится менее однородным, при этом глубина проникновения зондирующего излучения уменьшается. Гистотомографическое сопоставление демонстрирует снижение глубины проникновения зондирующего излучения на КП ОКТ-изображении в области, соответст­вующей контурам перитуморальной зоны на гистологическом препарате (рис. 3, е, 3, а и б; области внутри зеленого пунктира). На гистологическом препарате (рис. 3, в, е) видна инфильтрация области коры группами опухолевых клеток с локальным повышением клеточной плотности, что приводит к формированию гетерогенного (неоднородного) сигнала с участками повышения интенсивности сигнала в ко-поляризации.

В области прорастания опухоли — деструкции опухолевым узлом коры головного мозга — сигнал становится резко неоднородным, при этом глубина проникновения зондирующего излучения сильно варьирует по поперечной координате (рис. 2, а, б и 3, а, б; область внутри синего пунктира). На соответствующем участке гистологического препарата (рис. 3, в, г, д) определяется плохо организованная опухолевая ткань, характеризующаяся участками сплошного скопления опухолевых клеток, мозаично расположенными некрозами, мелкими кровоизлияниями. Такие инородные включения изменяют оптические свойства нервной ткани и деформируют характерный для структурно организованной коры гомогенный сигнал (рис. 2, а, б и 3, а, б; внутри желтого пунктира). Различия между описанными областями также отчетливо видны на трехмерных построениях в ко- и кросс-поляризациях (рис. 2, в–з).

Визуально определяемые различия в характере КП ОКТ-сигнала между нормальной тканью головного мозга и опухолью позволяют рассматривать КП ОКТ как перспективный метод интраоперационного определения границ инфильтративно растущих глиальных опухолей, что является необходимым условием достижения максимально возможной резекции опухоли, статистически значимо коррелирующей с продолжительностью жизни пациентов [17–23].

В мировой науке предприняты первые попытки определения точных критериев дифференциальной диагностики опухоли и непораженной ткани мозга по характеру ОКТ-сигнала в обычной поляризации. Так, H.Y. Bohringer и соавт. на основании качественного анализа полученных при помощи ОКТ во временной области (time-domain OCT) изображений глиальных опухолей различной степени злокачественности (42 биопсии) выделили в качестве дифференциального критерия степень гомогенности сигнала, при этом опухолевая ткань и перитуморальная зона (зона инфильтрации) отличались гетерогенным характером сигнала, а неизмененная мозговая ткань — гомогенным [24, 25]. Обнаружена высокая корреляционная зависимость между характером ОКТ-сигнала и гистологическим данными (χ² test; r=0,99) [25]. C. Kut и соавт. предпринята попытка более объективной количественной оценки сигнала с определением коэффициентов рассеяния в качестве дифференциального критерия [26]. В ходе исследования выявлены следующие коэффициенты рассеяния: для нормальной мозговой ткани — 6,2±0,8 мм^–1; для глиом высокой степени злокачественности — 3,9±1,6 мм^–1, в зоне инфильтрации — 7,1±1,0 мм^–1; для глиом низкой степени злокачественности — 4,0±1,4 мм^–1, в зоне инфильтрации — 2,7±1,0 мм^–1. В той же работе на основании ОКТ-данных от 16 пациентов оценивалась диагностическая точность ОКТ в качестве метода определения границ удаленной опухоли. Показана высокая чувствительность (92–100%) и специфичность (80–100%) по расчету коэффициента рассеяния. Рядом исследователей предложены первые технологические решения интраоперационного использования ОКТ в нейрохирургии, например в качестве модуля в составе микроскопа для микронейрохирургии [27–29].

Нами впервые получены ОКТ-изображения глиальной опухоли и неизмененной мозговой ткани в режиме кросс-поляризации. При этом характер сигнала в обоих случаях в целом соответствует сигналу в ко-поляризации (рис. 2, а, 3, а) и общему морфологическому строению препарата (рис. 3, в).

J.M. Schmitt с соавт. установили, что сигнал в кросс-изображении является следствием когерентного кросс-рассеяния и двулучепреломления в исследуемой биоткани [30]. В ряде работ Н.Д. Гладковой с соавт. показано, что использование поляризованного излучения может увеличить информативность метода, например, при прижизненном разделении патофизиологических процессов (воспаления, фиброза и неоплазии), связанных с изменением пространственной и структурной организации коллагеновых волокон слизистых оболочек внутренних органов [31–34]. В частности, установлено, что добавление изображения в кросс-поляризации к традиционному ОКТ-изображению существенно улучшает эффективность диагностики поверхностного рака мочевого пузыря [32]. При анализе ОКТ-изображений в кросс-поляризации продемонстрированы чувствительность 93,7% (против 81,2% при анализе ОКТ-изображений в исходной поляризации, р<0,0001), специфичность — 84% (против 70,0%, р<0,001) и точность — 85,3% (против 71,5%, р<0,001) в обнаружении плоских злокачественных поражений мочевого пузыря [32]. Однако особенности и источники формирования кросс-поляризационного сигнала от нервной ткани в норме и при патологии в настоящий момент не изучены.

Выявленная способность ОКТ дифференцировать опухолевую ткань позволяет рассматривать ее как потенциальный метод оптической экспресс-биопсии при стереотаксической биопсии глубинных новообразований головного мозга и для интраоперационного определения границ инфильтративно растущих опухолей головного мозга. Второй режим используемой установки — спектральная МА ОКТ — позволяет визуализировать изменения формы и размеров сосудов головного мозга в норме и при патологии.

Полученные нами результаты МА ОКТ демонстрируются на рис. 4. Наглядно видно, что опухолевые сосуды глиобластомы крысы 101.8 (рис. 4, б) имеют в отличие от неизмененных сосудов головного мозга (рис. 4, в) иную форму: они извитые, с неровными контурами просвета (рис. 4, б).

Рис. 4. Состояние микроциркуляторного русла глио­бластомы крысы 101.8 и неизмененной коры мозга около опухолевого узла по данным ОКТ-микроангио­графии: а — изображение микроциркуляции, полученное при помощи стереомикроскопа Axio Zoom.V16; б — ОКТ- микроангиограмма участка неизмененной коры головного мозга на удалении от опухолевого узла; в — ОКТ-микроангиограмма глиобластомы крысы 101.8. Стрелки указывают на соответствующие сосуды. Изображения б и в получены с двух участков, соответствующих зонам внутри синего и желтого пунк­тира на КП ОКТ-изображении, представленном на рис. 2, а, б

Есть все основания предполагать, что высокое пространственное разрешение ОКТ и возможность количественной оценки микроциркуляторного русла позволят получать уникальную информацию о церебральной гемодинамике и метаболизме и соответственной им функциональной активности головного мозга и его дисфункции [35–40]. Например, методом ОКТ удалось показать влияние кокаина на мозговой кровоток, проявляющееся в выраженном вазоспазме и очагах ишемии [41]. Наши результаты использования МА ОКТ в эксперименте позволяют говорить о возможности ее клинического применения. Считаем, что в перспективе возможен периодический контроль состояния микроциркуляторного русла коры головного мозга в ходе нейрохирургических вмешательств для предотвращения ишемических осложнений и, соответственно, возникновения неврологического дефицита в послеоперационном периоде.

Таким образом, на примере модели глиобластомы крысы 101.8 установлено, что характер КП ОКТ-изображений участков ткани головного мозга отражает их различную морфологическую структуру. МА ОКТ позволяет достоверно визуализировать опухолевые и нормальные мозговые сосуды, различая характерные признаки сосудов опухоли (извитость, неровность контура и т.д.).

Заключение. Мультимодальная ОКТ, включающая кросс-поляризационный и микроангиографический ОКТ-режимы, является перспективным методом интраоперационной диагностики при глиальных опухолях головного мозга. Возможность сочетать несколько режимов исследования позволяет одновременно получать информацию как о структуре ткани, так и о состоянии микроциркуляторного русла. Используемая в данной работе модификация ММ ОКТ имеет высокий потенциал в качестве метода определения границ инфильтративно растущих глиальных опухолей головного мозга, основанного на оценке структуры ткани и особенностей строения микрососудистой сети и ее элементов.

Благодарность. Коллектив авторов выражает большую благодарность за помощь в организации исследования и непосредственно в выборе оптимальной экспериментальной модели опухоли для изучения возможностей мультимодальной ОКТ в диагностике состояния нервной ткани при глиальных опухолях директору НИИ морфологии человека Макаровой Ольге Васильевне.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Правительства Российской Федерации, Министерства образования и науки Российской Федерации, договор №14.B25.31.0015 (КММ, МЛА, ЕВВ, КСС, ЕБК, НДГ) и грантов РФФИ №16-34-00995 мол_а (КММ, МЛА, ЕВВ) и №15-42-02513 р_поволжье_а (МЛА).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.