Молекулярно-эпидемиологический анализ штаммов Acinetobacter baumannii, выделенных у пациентов с ожоговой травмой

Среди возбудителей инфекций, вызывающих осложнения, в том числе у пациентов ожоговых отделений, в последние годы все более устойчивые позиции занимают грамотрицательные неферментирующие бактерии. Отмечается постоянный рост частоты инфекций, вызванных Acinetobacter spp., особенно A. baumannii [1–3].

Acinetobacter spp. — свободно живущие в окружающей среде неферментирующие бактерии, способные сохраняться и размножаться в госпитальных условиях, используя в качестве субстрата почти все природные органические соединения. Они контаминируют самые разнообразные растворы, в том числе и некоторые из дезинфектантов (фурацилин, риванол и др.), а также медицинский инструментарий и оборудование, особенно в местах скопления жидкости. Основными особенностями ацинетобактеров являются резистентность ко многим группам антибактериальных химиопрепаратов; способность к формированию биопленок (как на тканях живого организма, так и на полимерных материалах, используемых в медицине); наличие сигнальной системы «кворум-сенсинг», что позволяет усиливать защиту бактерий от антибиотиков, дезинфектантов, иммунной системы человека. Главные факторы вирулентности: полисахаридная капсула, пили, фермент, который разрушает липиды тканей макроорганизма, токсин, вызывающий гибель лейкоцитов [1, 4, 5].

Микробиологический мониторинг формирования антибиотикорезистентности является важным методом оценки эффективности антибиотикотерапии и возможности эмпирического назначения антибактериальных химиопрепаратов [6]. Устойчивость A. baumannii к карбапенемам все больше распространяется в стационарах по всему миру. Наиболее важный механизм устойчивости к этому классу антибиотиков — действие карбапенемаз и оксациллиназ. У ацинетобактеров описано несколько классов оксациллиназ, но, по данным некоторых исследований [7–9], наибольшее значение имеет OXA-23 и встречается она чаще всего у мультирезистентных штаммов. Инсерционный элемент ISAba1 содержит промоторы, которые играют важную роль в экспрессии генов, кодирующих OXA-23, что приводит к нарастанию устойчивости к антибиотикам в условиях среды стационара. Этот инсерционный элемент можно считать эпидемиологически значимым маркером лекарственно-резистентных госпитальных штаммов A. baumannii.

Белок, кодируемый геном tonB-зависимого рецептора, входит в состав наружной мембраны бактериальной клетки, отвечает за усвоение железа и является важным фактором вирулентности, поскольку необходим для выживания бактерий в крови и легких. Клоны, имеющие данный ген, способны вызвать бактериемию у пациентов в короткие сроки [10]. СsuE — это один из генов, участвующих в регуляции формирования биопленок. Он отвечает за наличие пилей у бактериальных клеток [11]. Для идентификации штаммов A. baumannii используют полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) или ПЦР-мультиплекс с конститутивными генами trpE, adk, mutY, ppa, которые присутствуют всегда, поскольку необходимы для основных процессов жизнедеятельности бактериальной клетки [12].

Ожоговым отделениям свойственна более высокая частота появления госпитальных штаммов ацинетобактеров и их длительная циркуляция в условиях стационара [13]. Результаты исследований, проводимых в европейских странах, показывают, что происходит появление и быстрое распространение «эпидемических» клонов A. baumannii с высокой степенью родства, т.е. госпитальных штаммов [14]. Работ отечественных авторов по данному направлению явно недостаточно, представлены данные только по некоторым регионам европейской части России [15], в Дальневосточном регионе подобных исследований не проводилось.

Для эффективного эпидемиологического контроля необходима идентификация возбудителя по штаммам и слежение за генетической структурой госпитальной популяции, что в полной мере возможно лишь при использовании молекулярно-генетических методов. В настоящей работе проведен генотипический анализ штаммов, полученных в ожоговом отделении Дальневосточного окружного медицинского центра ФМБА России (Владивосток).

В настоящее время в мире «золотым стандартом» для генотипического анализа является метод МЛСТ (мультилокусное сиквенс-типирование, MLST). Для ацинетобактеров используются две схемы: института Пастера (Pasteur’s MLST) [16] и Оксфордская (PubMLST) [17]. Несмотря на неоспоримые преимущества этого метода, такие как большая разрешающая способность и стандартизация условий, проведение МЛСТ доступно очень ограниченному числу лабораторий из-за высокой стоимости оборудования и расходных материалов. Предлагаемый метод ПЦР гораздо более доступен.

Цель исследования — при помощи молекулярно-генетических методов оценить характер распространения эпидемически значимых штаммов Acinetobacter baumannii, выявить преобладающий генотип, определить наличие госпитальных штаммов.

Материалы и методы. Исследовано 60 штаммов A. baumannii, выделенных в 2011–2013 гг. у пациентов ожогового отделения Дальневосточного окружного медицинского центра ФМБА России (Владивосток). Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили микробиологическими методами [18] и с помощью молекулярно-генетического анализа [19]. ДНК выделяли методом кипячения: петлю суточной культуры переносили в 1,5 мл пробирку Эппендорфа со 100 мкл очищенной от нуклеаз воды, кипятили в течение 5 мин на водяной бане, после чего центрифугировали при скорости 12 000 об./мин в течение 3 мин. Надосадочную жидкость (супернатант) переносили автоматической микропипеткой в стерильные пробирки и использовали для анализа.

Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклере ThermalCycler С 1000^TM (Bio-Rad, США). Используемые в работе праймеры представлены в табл. 1.

---

Таблица 1. Праймеры, используемые для генотипирования изолятов A. baumannii

---

Рабочая смесь содержала 1 единицу Taq ДНК-полимеразы («СибЭнзим», Россия), 1×буфер (10×: 600 ммоль Tris-HCl; 250 ммоль KCl; 15 ммоль MgCl2; 100 ммоль 2-меркаптоэтанол; 1% Тритон X-100, pH=8,5), 0,8 ммоль смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (по 0,2 ммоль каждого), 0,25 мкмоль каждого праймера и 50 нг ДНК.

Амплификацию гена OXA-23 проводили при следующих условиях: предварительная денатурация при 94°С — 5 мин; последующие 35 циклов при 94°С — 30 с, при 52°С — 40 с, при 72°С — 50 с и окончательная достройка цепей при 72°С — 5 мин. Для амплификации остальных генов использовали такие условия: предварительная денатурация при 95°С — 5 мин, 8 циклов при 95°С — 30 с, начиная с 48°С при каждом цикле температуру отжига повышали на 0,9°С, при 72°С — 20 с, последующие 36 циклов при 95°С — 15 с, при 56°С — 20 с, при 72°С — 20 с и окончательная достройка цепей при 72°С — 5 мин. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 2,0% агарозном геле (Agarose Biotechnology Grade, Amresco, США) с окраской ДНК этидиум бромидом. Маркером молекулярной массы служил стандартный набор фрагментов ДНК, кратных 100 парам нуклеотидов (п.н.) («СибЭнзим», Россия). Для определения размеров амплифицированных фрагментов использовали программу TotalLab v. 2.01.

Присутствие или отсутствие ампликонов рассматривалось как бинарный признак, в соответствии с чем для всех исследуемых изолятов A. baumannii и всех используемых праймерных последовательностей была создана бинарная матрица. Впоследствии каждый изолят типировался по всем парам праймеров, в результате чего были получены комбинированные генотипы. Полиморфизм генотипов оценивали с помощью теста χ-квадратов [20] для каждой пары изолятов в программе ARLEQUIN v. 3.5 [21]. Поиск оптимальной дендрограммы максимальной экономии МР (Maximum Parsimony tree) выполняли по алгоритму PENNY [22] в пакете программ PHYLIP (Phylogeny Inference Package) v. 3.67 [23]. Устойчивость кластеризации оценивали в 1000 итераций бутстреп-анализа [24]. Графическое изображение дендрограммы получено в программе TreeView (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html).

Результаты и обсуждение. Гены adk, mutY, ppa и trpE амплифицировались у всех исследуемых штаммов A. baumannii. Гены OXA-23 и ISAba1 амплифицировались в 70 и 80% случаев соответственно, что указывает на наличие резистентности к карбапенемам. Ген csuЕ определен у 40% штаммов. Он имеет 4 модификации с разной молекулярной массой. Есть основания полагать, что это обусловлено мутациями в гене, являющемся одним из показателей склонности бактерий к формированию биопленок. Это свойственно многим госпитальным штаммам. Ген tonB, кодирующий свойст­ва бактерий, позволяющие вызвать бактериемию в короткие сроки, определен у 15% штаммов. В ходе анализа для каждого штамма объединяли все полученные данные по присутствию/отсутствию признака, получая таким образом комбинированный генотип, соответствующий определенному набору генов и являющийся генетической характеристикой данного штамма. По исследуемым генам, кодирующим антибиотикорезистентность и факторы вирулентности, было выделено 9 комбинированных генотипов. Наиболее часто встречался генотип А (в 50% случаев). Генотипы F и I встречались в 10%, остальные — в 5% случаев (табл. 2).

---

Таблица 2. Генотипирование изолятов A. baumannii по результатам ПЦР-анализа

---

Оценки генетических различий генотипов A. baumannii, полученные с помощью теста χ-квадратов для каждой пары изолятов, показали, что только генотипы F и I достоверно отличаются при 95% уровне значимости (табл. 3). Существенных различий между другими генотипами не выявлено. На основании анализа генетического полиморфизма изолятов A. baumannii построена MP-дендрограмма (см. рисунок). Также как и данные генетической дифференциации исследуемых изолятов (см. табл. 3), дендрограмма указывает на их тесную генетическую близость, о чем свидетельствуют низкие значения (не более 50%) бутстреп-поддержек.

---

Таблица 3. Генетическая дифференциация изолятов A. baumannii

---

МР-дендрограмма, построенная на основании анализа полиморфизма генов OXA-23, ISAba1, csuE, tonB штаммов A. baumannii. Цифрами показаны оценки бутстреп-поддержки (процент от 1000 реплик)

---

Таким образом, исследование генетической структуры 60 изолятов A. baumannii с помощью ПЦР-анализа генов OXA-23, ISAba1, csuE, tonB свидетельствует о незначительном уровне их генетической дифференциации. Полученные данные указывают на длительное существование госпитальных штаммов в среде стационара и на высокую частоту внутрибольничного экзогенного инфицирования пациентов, поскольку эндогенное инфицирование разными штаммами давало бы гораздо большее разнообразие признаков. Данные факты говорят о необходимости соблюдения всех требований инфекционного контроля в лечебных учреждениях и использования принципов рациональной антибиотикотерапии в повседневной врачебной практике, а также о совершенствовании и унификации методов эпидемиологического надзора за формированием госпитальных штаммов.

По сравнению с методом МЛСТ предлагаемая нами методика применения ПЦР для определения спектра госпитальных штаммов является материально малозатратной, поскольку используемое для данного метода оборудование имеется в большинстве исследовательских и клинических лабораторий, а стоимость расходных материалов существенно ниже стоимости реактивов для секвенирования. Полученные с помощью этого метода результаты легко воспроизводимы и статистически достоверны, что свидетельствует о возможности его широкого применения.

Заключение. Исследование генетической структуры штаммов A. baumannii с помощью ПЦР-анализа генов OXA-23, ISAba1, csuE, tonB позволяет эффективно оценить наличие эпидемической связи между штаммами, выявить преобладающий генотип и определить эпидемически важные свойства штаммов.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками и конфликт интересов, связанный с данным исследованием, отсутствует.