Влияние озона и доксорубицина на жизнеспособность и морфологию злокачественных клеток печени

В последние годы в медицине наряду с хирургическим и лекарственным лечением используются немедикаментозные методы. Некоторые из них применяются в онкологии для поддержания собственных компенсаторных функций организма, в первую очередь нейроэндокринной и иммунной систем. Одним из таких методов является озонотерапия. В клинической практике доказана эффективность очень низких доз озона, позволяющих корригировать состояние организма и поддерживать оптимальное течение адаптационных процессов.

Предпосылками для использования озона в онкологии можно считать два открытия немецких ученых: O.H. Warburg (1966), утверждавшего, что ключевой предпосылкой для развития опухоли является недостаток кислорода на клеточном уровне, и J. Varro (1974), выявившего непереносимость опухолевыми клетками пероксидов. В 1980 г. F. Sweet с соавт. представили доказательства ингибирующего действия озона по отношению к опухолевым клеткам в условиях in vitro, обнаружив слабую способность опухолевых клеток компенсировать кислородный «взрыв», вызванный озоном, по сравнению с нормальными клетками и установив 90% подавление роста малигнизированных клеток [1].

В 1982 г. H.H. Wolf выявил дозозависимый антипролиферативный эффект озона [2]. Позднее H. Karlic с соавт. подтвердили селективное подавление озоном роста клеток карциномы яичников и эндометрия [3]. K.S. Zanker, P. Kroczek обнаружили повышение под влиянием озона чувствительности резистентных линий опухолевых клеток к цитостатическим препаратам [4].

В работе M. Arnan, L.E. DeVries [5] продемонстрировано увеличение выживаемости мышей с перевитой карциномой, получивших инъекции озоно-кислородной смеси. Y. Rodrigues с соавт. [6] показали антиметастатический эффект озона. В наших экспериментальных исследованиях, выполненных на лабораторных животных с перевитой опухолью молочной железы [7], показано, что действие озона на патоморфоз злокачественных клеток сопоставимо с действием известного химиопрепарата доксорубицина. Доксорубицин является антибиотиком антрациклинового ряда. В последнее время доксорубицин используется в экспериментах на культуре клеток для разработки методов снятия резистентности [8, 9]. Нами продемонстрировано выраженное повреждающее действие на опухоль сочетания озона и доксорубицина. Кроме того, были определены эффективные концентрации озона и доксорубицина. Для уточнения механизмов действия озона и доксорубицина необходимым явился переход от экспериментов на целостном организме животного к культуре злокачественных клеток.

Цель исследования — изучение изолированного и сочетанного влияния доксорубицина и озона на жизнеспособность и морфологию нормальных и злокачественных клеток печени человека.

Материалы и методы. В работе использовались два вида клеток:

1) культивированные клетки нормальной печени человека Chang liver; культивирование осуществлялось в среде «Игла МЕМ» с солями «Эрла» («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия), оптимальная плотность — (0,5–1,0)·10⁵ кл./мл;

2) клетки линии SK-HEP-1 (аденокарцинома печени человека, асцитная жидкость), морфология — эпителиоподобная, культивирование осуществлялось в среде «Игла МЕМ» с солями «Эрла» («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия) и 1% заменимых аминокислот («ПанЭко», Россия), оптимальная плотность — (2,0–4,0)·10⁶ кл./см².

Поддержание жизнеспособности культур проводилось в СО₂-инкубаторе, при 5% содержании СО₂. Эксперимент выполняли на 3–5-м пассаже. Клетки рассаживали на 48- или 6-луночные планшеты. При достижении 60% роста монослоя проводили замену культуральной среды на испытуемые.

Испытуемые среды готовили следующим образом: в 50 мл среды для выращивания клеток вводили: а) доксорубицин в дозе 0,004 мг; б) 150 мл кислорода; в) 150 мл озоно-кислородной смеси с концентрацией озона 25 мг/л; г) среду с кислородом + доксорубицин 0,004 мг; д) среду с озоно-кислородной смесью + доксорубицин 0,004 мг. Кислород поступал из концентратора кислорода New Life Intensity (Buffalo, США). Озоно-кислородная газовая смесь поступала со скоростью 1 л/мин в течение 5 мин из генератора озона («Квазар», Россия).

Через 48 ч культивирования испытуемая клеточная среда убиралась, клетки промывали полифосфатным буфером (PBS) (pH=7,4) и заливали 250 мл смеси версена (0,02%) и трипсина (0,25%)в соотношении 3:1. Через 10 мин инкубации в СО₂-инкубаторе клетки пипетировали и добавляли в каждую лунку по 250 мл 8% формальдегида. После этого производили подсчет количества клеток на автоматическом анализаторе Septer (Мillipore, Германия).

Проверку клеток на жизнеспособность выполняли по восстановлению солей тетразолия МТТ (Sigma, США) [10]. В основе метода лежит реакция восстановления желтой соли тетразолия — бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолий) митохондриальными дегидрогеназами (оксидоредуктаза) живых клеток до голубых кристаллов формазана [11]. Для этого клеточную среду убирали, клетки промывали раствором PBS (pН=7,4), в каждую ячейку вносили по 300 мкл раствора соли тетразолия МТТ (концентрация — 0,25 мг/мл в PBS, pН=7,4). Инкубировали в условиях СО₂-инкубатора в течение 30 мин. Далее раствор МТТ удаляли и клетки заливали для разрушения клеточных мембран изопропанолом. Через 10 мин измеряли оптическую плотность (А) при длине волны 570 и 620 нм. Здесь: 570 нм — максимум поглощения восстановленной формы ММТ; 620 нм — максимум поглощения триптофана, пропорциональный количеству белка в пробе, которая зависит от количества клеток.

Расчет жизнеспособности (Е) проводили по формулам:

Е=А570–А620;

% жизнеспособных клеток=
=(Е опыта/Е контро­ля)×100%.

При исследовании влияния окислителей и доксорубицина на жизнеспособность клеток за контроль принимали изменение оптической плотности интактных культур.

Морфологические исследования проводили через 48 ч после замены клеток в лунках с помощью инвертированного микроскопа DMIL HC (Leica, Германия). Исследовали не менее пяти непересекающихся полей зрения с одной культуры.

Результаты. Изучение показателей жизнеспособности нормальных и злокачественных клеток печени (см. таблицу) показало, что она напрямую связана с активностью ферментов оксиредуктаз. Снижение активности данных ферментов указывает на выраженную цитотоксичность доксорубицина в отношении нормальных клеток печени (показатель жизнеспособности — 3,5%) и особенно злокачественных клеток печени (показатель жизнеспособности — 1,56%). Анализ действия окислителей выявил прямо противоположное действие на жизнеспособность клеток и озоно-кислородной смеси. Обработка культуральной среды кислородом повышала активность как нормальных оксидоредуктаз (показатель жизнеспособности увеличивался до 104%), так и злокачественных клеток (показатель жизнеспособности увеличивался до 115%). Это свидетельствовало о том, что добавление кислорода не изменяло состав среды для клеточной культуры и не мешало ей расти. Напротив, дополнительный кислород по принципу обратной связи активировал оксидоредуктазы. Введение в культуральную среду озоно-кислородной смеси вызывало образование продуктов взаимодействия озона с биоорганическими соединениями (озонидов). Эти продукты, по всей видимости, повреждали клеточные мембраны и подавляли активность оксидоредуктаз, что проявлялось снижением показателей жизнеспособности (4,54% — для нормальных клеток и 15,7% — для злокачественных клеток печени). Количественные различия жизнеспособности нормальных и злокачественных клеток можно объяснить более мощной антиоксидантной защитой злокачественных клеток.

---

Показатели жизнеспособности нормальных и злокачественных клеток при воздействии окислителей и доксорубицина, %

---

Сочетанное использование доксорубицина и кислорода показало, что применение двух агентов оказывает более выраженное действие на нормальные клетки, а не на злокачественные, имеющие более выраженную антиоксидантную систему защиты. Сочетание доксорубицина и озона сопровождалось снижением жизнеспособности как нормальных клеток — до 7,9%, так и злокачественных — до 2,6%. Отличие этих показателей от тех, что получены при действии изолированного введения доксорубицина и окислителей, связано, по всей видимости, с взаимодействием этих факторов между собой и компонентами клеток, в том числе и с антиоксидантами.

Исследование морфологической структуры клеток обеих выбранных линий (рис. 1, 2) показало, что кислород через 48 ч после замены культуральной среды не оказывает токсического действия на клеточные линии (рис. 1, в и2, в). Структура клеток остается неизменной, конденсация хроматина, характерная для апоптоза, не наблюдается. В культуре хорошо видны активно делящиеся клетки, отдельные клеточные элементы, открепившиеся от подложки и свободно пилагирующие (плавающие) в клеточной среде (один из этапов развития монослоя). В культуре Chang liver обнаружено небольшое количество клеток с измененной морфологией, контуры клеток — неровные, хроматин изменен, однако количество изменений морфологической структуры не значимо. Несмотря на то, что увеличение концентрации кислорода для клеточных линий не является физиологичным и рассматривается как неблагоприятный фактор, в наших исследованиях не выявлено каких-либо изменений морфологической структуры и жизнеспособности клеток даже при максимальном насыщении культуральной среды.

---

Рис. 1. Морфологическая структура клеток нормальной печени человека Chang liver после воздействия окислителей и доксорубицина: а — интактные клетки; б — доксорубицин в дозе 0,004 мг; в — кислород; г — кислород с доксорубицином в дозе 0,004 мг; д — озон в концентрации 25 мг/л; е — озон в концентрации 25 мг/л с доксорубицином в дозе 0,004 мг

---

Рис. 2. Морфологическая структура злокачественных клеток печени человека SK-HEP-1 после воздействия окислителей и доксорубицина: а — интактные клетки; б — доксорубицин в дозе 0,004 мг; в — кислород; г — кислород с доксорубицином в дозе 0,004 мг; д — озон в концентрации 25 мг/л; е — озон в концентрации 25 мг/л с доксорубицином в дозе 0,004 мг

---

Применение доксорубицина в культуре клеток линии Chang liver (рис. 1, б) в выбранной концентрации приводит к существенным изменениям морфологии клеток. Наблюдается потеря характерной клеточной структуры, клетки теряют форму, открепляются от подложки, уменьшаются в размерах, выявляются выраженные изменения ядерного аппарата и всех органелл. Данные изменения характерны для погибших клеток. Добавление кислорода не влияет на эффекты, оказываемые доксорубицином в концентрации 0,004 мг (рис. 1, г).

При изучении морфологии после 48-часового культивирования в озонированной среде обнаружены клеточные элементы, указывающие на терминальную стадию апоптоза, а также клеточные элементы с разрушенными мембранами (рис. 1, д).

При совместном использовании озона и доксорубицина выявлен цитостатический эффект (рис. 1, е). Обнаруживаются отдельные клеточные элементы с характерной для данной линии морфологией, присутствуют клетки с поврежденными мембранами, делящиеся клетки не выявлены. За 48 ч после воздействия образования монослоя (как в контрольных сериях) не произошло. Однако количество погибших и открепившихся от подложки клеток было относительно небольшим.

В культурах клеток линии SK-HEP-1 добавление цитостатика также вызывает необратимые изменения в большей части клеток (рис. 2, б): они теряют форму, хроматин конденсируется, наблюдается массовая гибель. При этом форма небольшой части неделящихся клеток остается веретеновидной, характерной для данной линии. Делящихся клеток не обнаружено.

Совместное применение доксорубицина и кислорода не влияет на эффекты, оказываемые цитостатиком (рис. 2, г). Применение озонированной среды вызывает выраженный цитостатический эффект (рис. 2, д), так как скорость достижения монослоя ниже. Однако через 48 ч после добавления озонированной среды к культуре наряду с большим количеством веретеновидных клеток обнаруживаются и делящиеся клетки.

Совместное применение доксорубицина и озона (рис. 2, е) приводит к необратимым последствиям для структуры клеточных элементов. Клеток с нормальной формой не обнаруживается: клеточные тела округлены, хроматин конденсирован, мембраны повреждены. Встречаются клеточные «тени» — как терминальная стадия некротической гибели.

Проведенный морфологический анализ показал, что совместное применение доксорубицина и озона усиливает цитотоксический эффект каждого из данных веществ. Клетки аденокарциномы печени более устойчивы, чем клетки нормальной печени, как к озону, так и к доксорубицину. Замена культуральной среды на среду, насыщенную кислородом, не влияет на морфологию клеток и линии аденокарциномы печени, и линии нормальной печени человека.

Таким образом, исследование жизнеспособности клеток печени выбранных линий и данные изменения их морфологической структуры убедительно свидетельствуют, что доксорубицин обладает выраженной цитотоксичностью в отношении и нормальных клеток печени, и, особенно, злокачественных клеток печени. Применение кислорода в монорежиме не изменяет состав среды для клеточной культуры и не мешает пролиферации клеток. Сочетанное использование доксорубицина и кислорода оказывает более выраженное действие на нормальные клетки, а не на злокачественные, отличающиеся более выраженной антиоксидантной системой защиты. Введение в культуральную среду озоно-кислородной смеси проявляется снижением показателей жизнеспособности для злокачественных клеток печени. Сочетание доксорубицина и озона сопровождается снижением жизнеспособности как нормальных, так и злокачественных клеток.

Заключение. Сочетанное применение озона и доксорубицина оказывает цитостатический эффект на жизнеспособность нормальных и злокачественных клеток печени человека, приводит к необратимым последствиям для структуры клеточных элементов. Эффект озона сопоставим с действием доксорубицина, что дает возможность подбирать способы введения озона — изолированно или в сочетании с доксорубицином.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.