Предсердный и мозговой натрийуретические пептиды секреторных кардиомиоцитов в условиях солевой нагрузки в эксперименте

Предсердный (ПНП) и мозговой (МНП) натрий­уретические пептиды — это биоактивные вещества, образующиеся в сердце, которые оказывают натрийуретический, сосудорасширяющий, гипотензивный эффекты и являются антагонистами ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) [1, 2]. Гормоны имеют сходную молекулярную структуру, рецепторный аппарат и механизмы действия [3, 4]. Исследователями отмечено увеличение выделения натрийуретических пептидов в кровь при артериальной гипертензии (АГ), причем величина их плазменной концентрации прямо коррелирует с тяжестью сердечной дисфункции [5–8]. Тем не менее роль данных пептидов в развитии, патогенезе и течении АГ до сих пор до конца не ясна [9, 10].

Хорошо изучена взаимосвязь артериального давления (АД) с солевой нагрузкой. Установлено, что у одних людей и экспериментальных животных употребление соли легко вызывает повышение АД, у других не оказывает эффекта [11–13]. Высокая чувствительность к приему NaCl выражается в виде значительного изменения АД и служит фактором риска развития АГ, инфаркта миокарда, инсульта [14, 15]. Обнаружение такой восприимчивости в клинике позволяет в короткий срок назначить пациентам наиболее эффективное лечение. Экспериментальные исследования в данном направлении обусловлены поиском новых критериев ранней диагностики АГ [16, 17]. Изучение натрийуретических пептидов при солевой нагрузке вносит вклад в понимание патогенеза данного заболевания [18].

Чаще всего ПНП и МНП изучают биохимическими методами [8, 19–22]. При этом их плазменный уровень не всегда совпадает с количественными характеристиками пептидов в сердце [23]. Применение метода подсчета иммуномеченых гранул разного типа позволяет оценить вклад ПНП и МНП предсердий в поддержание сердечно-сосудистого гомеостаза в условиях патологии. Следует отметить, что наибольшую значимость представляют работы, где анализируются оба гормона [24, 25].

Цель исследования — оценить воздействие солевой нагрузки на продукцию предсердного и мозгового натрийуретических пептидов в гранулах секреторных кардиомиоцитов крыс.

Материалы и методы. Исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики на 14 белых аутбредных крысах-самцах линии Wistar массой 280–300 г. Работа выполнена в полном соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Все крысы во время эксперимента получали стандартный рацион, имели свободный доступ к корму и воде и находились в условиях искусственного двенадцатичасового дня. Контрольную группу (n=8) составили интактные животные. В экспериментальной группе (n=6) крысам вводили раствор NaCl per os в дозе 1 г/кг массы тела на протяжении 14 дней. АД измеряли неинвазивным способом с помощью прибора NonInvasive Blood Pressure Meter LE5001 (Panlab, Испания), используя хвостовую манжету, до введения соли и через 14 сут. Животных выводили из эксперимента методом декапитации. Материал для дальнейшего изучения брали через 14 сут после измерения АД.

Для подтверждения специфичности реакции антител проводили иммуногистохимическое исследование образцов ткани правого предсердия интактных крыс. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 48 ч, промывали в проточной водопроводной воде, обезвоживали в этиловом спирте восходящей концентрации и заключали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5–7 мкм получали на санном микротоме LeicaSM 2000R (Leica Microsystems, Германия). Восстановление антигенной активности осуществляли методом теплового демаскирования в цитратном буфере с рН=6,0 (Novocastra, Laboratories, Великобритания) [26]. Для визуализации ПНП и МНП использовали первичные поликлональные антитела к ПНП — Rabbit anti-Atrial Natriuretic Factor (1-28) (rat) с рабочим разведением 1:50 и МНП — Rabbit anti-Brain Natriuretic Peptide-32 (Rat) Serum с рабочим разведением 1:100 (Peninsula Lab. Inc., Bachem, США). В качестве системы детекции применяли Peroxidase detection system (Novocastra, Laboratories, Великобритания) в соответствии с рекомендациями производителя. Негативный контроль выполнялся путем исключения первичных антител.

Электронно-микроскопический анализ образцов ткани правого предсердия интактных и экспериментальных животных проводили по стандартной методике. Материал фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (pH=7,4) и в 1% растворе OsO₄ с последующей заливкой в смесь эпона с аралдитом [27]. Клеточную локализацию ПНП и МНП выявляли на ультратонких срезах с помощью указанных выше первичных поликлональных антител к ПНП и МНП. В качестве вторых антител использовали белок А, конъюгированный с коллоидным золотом (диаметр частиц — 15 нм) — Protein-A/Gold, 15 nm (EMGrade, Electron Microscopy Sciences, США) [9]. Для каждого пептида реакции проводили отдельно. Контролем служили срезы, обработанные только вторыми антителами. Контрастирование осуществляли уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI, США) с использованием программы AnalySIS.

Количественный анализ двух типов гранул с пептидами в предсердных кардиомиоцитах (А-тип — «зрелые, запасающие» и В-тип — «растворяющиеся») выполняли подсчетом в полях зрения (38×38 мкм) [24, 28].

Статистическую обработку проводили с помощью программы Statistica 10.0 с применением критерия Вилкоксона и теста Манна–Уитни.

Результаты. Через 14 сут в экспериментальной группе наблюдалось изменение АД по сравнению с исходными величинами: у одних животных (n=3) произошло повышение АД с 98 до 105 мм рт. ст., у других (n=3) — снижение с 98 до 84 мм рт. ст. (р<0,05). В настоящем исследовании для дальнейшего изучения были взяты животные с достоверно повышенным давлением на 10% от интактных.

Иммунореактивность для ПНП и МНП была выявлена в правом предсердии у интактных крыс, с преимущественной локализацией в перинуклеарной зоне кардиомиоцитов. Причем реакция с ПНП (рис. 1, а) была более интенсивной, чем с МНП (рис. 1, б).

---

Рис. 1. Иммуногистохимическое окрашивание предсердного натрийуретического пептида (а) и мозгового натрийуретического пептида (б) в кардиомиоцитах правого предсердия интактных крыс (стрелки); ×400

---

При электронно-микроскопическом анализе правого предсердия животных из экспериментальной группы выявлены следующие изменения структуры кардиомиоцитов. В ядре преобладал эухроматин со слабовыраженной агрегацией по периферии, в большинстве — с отсутствием ядрышек. Кариолемма была ровная или с неглубокими инвагинациями (рис. 2). В саркоплазме визуально выявлялось значительное содержание цитоплазматических гранул. Цистерны саркоплазматического ретикулума не были расширены. Преобладали набухшие митохондрии, с про­светленным матриксом, дезориентацией и фрагментацией крист, встречались также единичные гигантские митохондрии. Миофибриллы в большинстве кардиомиоцитов четко определялись. Сарколемма в целом была без видимых изменений, местами образовывала складки, изредка обнаруживались участки ее истончения. Выявлялся умеренный межклеточный отек (рис. 3).

---

Рис. 2. Ультраструктура миокарда правого предсердия через 14 сут солевой нагрузки: Гр — гранулы; К — капилляр; Мх — митохондрии; Я — ядро; ×3500

---

Рис. 3. Секреторные гранулы в кардиомиоците правого предсердия через 14 сут солевой нагрузки; ×5600

---

Через 2 нед солевой нагрузки обнаружены разные морфометрические изменения гранул секреторных кардиомиоцитов правого предсердия, содержащих иммунореактивный материал. Выявлено увеличение количества гранул с ПНП А-типа на 79% и В-типа — на 128%, их общего количества — на 200%. При этом доля типов А и В составила 58 и 42% соответственно, у интактных животных — 63 и 37%. Количество гранул, содержащих МНП, было снижено относительно интактной группы: тип А — на 60%, тип В — на 52%, общее количество — на 43%. Доля А- и В-типов составила 64 и 36% соответственно, у интактных животных — 68 и 32% (см. таблицу).

---

Соотношение гранул А- и В-типов, содержащих предсердный натрийуретический пептид и мозговой натрийуретический пептид, в предсердных миоцитах крыс после солевой нагрузки

---

Обсуждение. Выявленное нами разделение экспериментальных животных по изменению АД на две группы подтверждает литературные данные о фактах солечувствительности [29, 30]. Восприимчивость к NaCl обусловлена особенностями функции почек, нарушением деятельности симпатической нервной системы, синтеза простагландинов, активности РААС [31–33]. В работе изучалась группа солечувствительных животных с повышенным АД.

Известно, что ответ ПНП и МНП на влияние различных факторов (ишемия, АГ) и изменения их концентраций в плазме крови во многом близки [1, 9, 34]. Это можно объяснить тем, что оба пептида имеют сходные строение и механизм действия, используют одни и те же клеточные рецепторы для реализации своих эффектов, совместно хранятся в гранулах секреторных кардиомиоцитов [24, 35]. Однако в научной литературе появляется информация о различиях в свойствах ПНП и МНП при сердечно-сосудистой патологии [5, 6, 36]. В нашем исследовании установлена разнонаправленная реакция пептидов в миоцитах правого предсердия крыс при воздействии соли.

В экспериментальной группе увеличение зрелых и растворяющихся форм гранул с ПНП относительно интактных животных свидетельствовало об активном накоплении и высвобождении гормона, при этом соотношение типов А и В указывало на смещение процессов в сторону его выделения. Установлено [37], что солевая нагрузка, как и повышение АД, является фактором, стимулирующим гипергрануляцию предсердных миоцитов и секрецию ПНП. Авторами работы [38] выявлено увеличение АД на 40%, гранул с пептидом — на 351% и плазменного уровня гормона — на 100% у мышей C57BL/6 (модель мышей с человеческим метаболическим синдромом) после 9 нед приема NaCl. Клинические исследования демонстрируют, что солевая нагрузка активирует РААС в почках [39–42]. По-видимому, активация РААС наряду с увеличенным АД является основным стимулом, влияющим на аккумуляцию и выведение ПНП у экспериментальных животных.

Анализ иммуномеченых гранул с МНП в нашем исследовании выявил снижение процессов его накопления и выделения. В соответствии с литературными данными об активации МНП в ответ на развитие сердечно-сосудистой патологии [43–45] это может свидетельствовать о раннем выделении гормона. По-видимому, оно направлено на снижение АД. Однако в экспериментальной группе мы наблюдали его увеличение. В научной литературе и клинической практике до сих пор нет ответа на возникающий при гипертензии «гормональный парадокс»: высокие концентрации натрийуретических пептидов не оказывают гипотензивного эффекта [18]. Одной из причин считается снижение плотности рецепторов к натрийуретическим гормонам [46], но достоверных доказательств не найдено. Исследователями отмечено, что нормальный компенсаторный механизм контроля АД натрийуретическими пептидами подавляется высокосолевой диетой [38] в связи с изменениями в почках [47, 48]. Тем самым и объясняется отсутствие гипотензивного эффекта раннего выброса МНП и большого количества ПНП через 14 сут нашего эксперимента.

Авторами работы [49] показана важная роль ионов Ca²⁺ в формировании реакций МНП. Через кальциевый унипортер (mitochondrial calcium uniporter), расположенный на мембране митохондрий, происходит повышенный ток ионов Ca²⁺ в их матрикс, приводящий к гибели клетки. МНП оказывает ингибирующее действие на этот канал, тем самым предотвращая гибель кардиомиоцитов [50]. Отсутствие выраженных изменений в ультраструктуре правого предсердия, отмеченное в настоящей работе, может быть связано с кардиопротекторным действием МНП, выделенным в более ранние сроки эксперимента. В то же время деструктивные изменения в митохондриях могут свидетельствовать о нарушении синтеза макроэргических соединений, что приводит к снижению образования и выведения МНП. Достоверно установлено [3], что усиление транспорта ионов Ca²⁺ способствует увеличению синтеза и формированию секреторных гранул с ПНП, и это подтверждает обнаруженное нами увеличение общего количества гранул с ПНП через 14 дней.

Проведенное исследование выявило различную реакцию натрийуретических пептидов в условиях солевой диеты. У солечувствительной линии крыс DOCA через 2 нед показано увеличение плазменного уровня ПНП, в то время как уровень МНП не изменялся, при этом экспрессия мРНК обоих пептидов в миокарде не отличалась от контроля [36]. Согласно гипотезе [51], стимулом для синтеза и выделения натрийуретических пептидов являются не только увеличение объема жидкости, АД, гипертрофия или аритмия, но и кислородный градиент [51] и изменение энергетического метаболизма миокарда [52, 53]. По-видимому, солевая нагрузка вызывает в кардиомиоцитах правого предсердия смещение вышеуказанных факторов, которые по-разному влияли на ПНП и МНП в наших экспериментах.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о разнонаправленной реакции пептидов в гранулах миоцитов правого предсердия крыс при воздействии соли. Вероятно, наблюдаемые нами снижение продукции МНП и увеличение накопления и выделения ПНП указывают на адаптивную реакцию сердца в условиях солевой диеты.

Заключение. Регуляция метаболизма натрийуретических пептидов осуществляется разными механизмами. Проведенное исследование позволяет сделать вывод, что раннее выделение мозгового натрийуретического пептида не способствует снижению АД из-за нарушения компенсаторного механизма при формировании артериальной гипертензии, вызванной солевой диетой. Увеличение продукции предсердного пептида происходит под воздействием ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и повышенного АД.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках ведомственной НИР Министерства здравоохранения РФ 2015–2017 гг. «Механизмы регуляции физиологических функций при экспериментальных состояниях организма».

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.