Референтные значения агрегации тромбоцитов при исследовании импедансным методом с аденозиндифосфорной кислотой на агрегометре Multiplate

О.В. Петрова, С.А. Шашин, Д.Г. Тарасов

Ключевые слова: референтный интервал; агрегация тромбоцитов; индуктор; аденозиндифосфорная кислота; автоматический агрегометр Multiplate.

Современные международные стандарты рекомендуют каждой лаборатории разработать или подтвердить имеющиеся в литературе референтные интервалы для каждого лабораторного показателя. В клинико-диагностической лаборатории Федерального центра сердечно-сосудистой хирургии Министерства здравоохранения РФ у 128 практически здоровых мужчин и женщин Астраханской области (Россия) была изучена агрегационная функция тромбоцитов. Исследование выполняли импедансным методом на агрегометре Multiplate (Verum Diagnostica, Германия), в качестве индуктора использовали аденозиндифосфорную кислоту. Возраст и пол статистически значимого влияния на значения агрегации тромбоцитов не оказывали. Референтный интервал агрегации тромбоцитов с аденозиндифосфорной кислотой на агрегометре Multiplate у здорового взрослого населения Астраханской области составил 598,0–1120,0 AU·min, где AU·min — площадь под кривой агрегации.

Установленный интервал агрегации тромбоцитов у взрослого населения может быть использован как референтный в лабораториях Астраханской области при работе на аналогичных аналитических системах (автоматическом агрегометре Multiplate), так как он был разработан с учетом всех особенностей формирования референтных групп и со стандартизацией всех этапов лабораторных исследований.

Тромбоциты играют большую роль в тромбообразовании у больных, перенесших кардиохирургические операции. Для профилактики и лечения тромбозов используются антитромботические (антиагрегантные) препараты [1].

К антиагрегантам относят разные по химической структуре лекарственные препараты, обладающие способностью угнетать функции тромбоцитов с помощью различных механизмов. Пациентам с риском развития кровотечений и тромбозов необходимо контролировать применение антиагрегантных препаратов (их дозировку, результаты) с помощью исследования агрегационной функции тромбоцитов. Так, например, при использовании клопидогреля (Плавикса) и Прасугреля контроль осуществляется с помощью исследования агрегационной функции тромбоцитов в присутствии активатора — аденозиндифосфорной кислоты [2–5].

В настоящее время в лабораторной практике для оценки агрегационной функции тромбоцитов используются агрегометры [1–3]. В основе метода определения агрегационной функции тромбоцитов лежит способность тромбоцитов под действием индукторов активизироваться и образовывать агрегаты, которые и анализирует агрегометр. По типу исследуемого материала агрегометры делятся на анализаторы, в которых используется цельная кровь, и анализаторы, в которых исследуется обогащенная тромбоцитами плазма. По типу регистрации изменений агрегатометрия делится на импедансную и оптическую [4, 5].

В последние годы современные импедансные агрегометры пришели на смену оптическим. Они в отличие от оптических не требуют специального обучения специалистов лабораторной диагностики и подготовки биологического материала, технически просты в эксплуатации, позволяют сократить время исследования крови.

Для оценки результатов лабораторного исследования используют референтный интервал (РИ). Этот показатель — ориентир, справочная информация, которая необходима врачу для правильной трактовки результата лабораторного исследования. Верхняя и нижняя границы РИ служат линиями раздела между здоровьем и болезнью в лабораторном смысле [6, 7].

Отсутствие регионарных РИ-показателей исследования агрегационной функции тромбоцитов ограничивает использование современных импедансных агрегометров в клинической практике.

Кроме того, современные отечественные и международные стандарты рекомендуют каждой лаборатории установить РИ для каждого лабораторного параметра или подтвердить имеющиеся в справочной литературе данные о РИ [6–8].

Цель исследования — установить референтные интервалы агрегации тромбоцитов в присутствии аденозиндифосфорной кислоты на агрегометре Multiplate на примере взрослого населения Астраханской области.

Материалы и методы. Для установления РИ использовали классический подход к расчету РИ с применением строгих критериев включения в исследование и исключения из него [6, 7].

Критерий включения в исследование — практически здоровые лица.

Критерии исключения пациентов из исследования: наличие соматической патологии, влияющей на состояние гемостаза; прием антитромботических препаратов.

Обследования проводили в рамках профилактического медицинского осмотра в Федеральном центре сердечно-сосудистой хирургии (Астрахань).

Референтная группа была сформирована следующим образом: 70 здоровых мужчин и 70 здоровых женщин — жителей Астраханской области в возрасте от 40 до 60 лет.

Качество лабораторного исследования зависит от преаналитического, аналитического и постаналитического этапов [9], в связи с чем все этапы нашего исследования мы стандартизировали.

Стандартизация преаналитического долабораторного этапа была обеспечена международными и отечественными стандартами, а также локальными документами, разработанными в Федеральном центре сердечно-сосудистой хирургии (Астрахань).

Образцы крови для исследования собирали путем пункции кубитальной вены после наложения жгута (не более 1 мин) в положении пациента лежа с помощью двухкомпонентных систем для забора крови — одноразовых полипропиленовых пробирок с 17 ЕД/л литий-гепарина (Sarstedt, Германия).

Образцы крови доставляли в лабораторию в течение 15–20 мин после венепункции и анализировали через 30–35 мин с момента поступления биологического материала в клинико-диагностическую лабораторию.

Контроль качества поступающего в лабораторию биологического материала был обеспечен на преаналитическом лабораторном этапе согласно международным и отечественным стандартам.

Стандартизация аналитического этапа была обеспечена:

ежегодным техническим обслуживанием автоматического агрегометра Multiplate (Verum Diagnostica, Германия);

ежедневной проверкой точности (правильности) работы измерительных частей (электродов) с помощью электронного контроля качества согласно инструкции по эксплуатации прибора;

ежедневным контролем качества импедансной агрегометрии с использованием сертифицированных контрольных материалов для проведения внутрилабораторного контроля качества согласно инструкции по эксплуатации анализатора;

наличием лабораторной информационной системы.

Исследование агрегационной функции тромбоцитов проводили в цельной крови импедансным способом, согласно инструкции производителя, на автоматическом агрегометре Multiplate (Verum Diagnosticа, Германия). В качестве индуктора использовали аденозиндифосфорную кислоту, конечная концентрация которой составила 6,5 мкМ. Результаты исследования агрегации тромбоцитов представлены в виде площади под кривой агрегации (AU·min).

Все статистические процедуры выполняли с помощью программного пакета Statistica 6.0 for Windows (StatSoft, Inc., США). Вычисляли X — среднее арифметическое и SD — стандартное отклонение, а также медиану, 5-й и 95-й процентили распределения. Проводили одномерный двухфакторный дисперсионный анализ, в котором пол и возраст выступали фиксированными факторами; агрегация тромбоцитов в присутствии аденозиндифосфорной кислоты — зависимой переменной. Тип распределения определяли по критерию Колмогорова–Смирнова. Для оценки различий средних тенденций между группами использовали критерий Манна–Уитни (U). Разделения считали статистически значимыми при уровне p<0,05.

Для определения РИ использовали статистические подходы, рекомендованные ГОСТ Р 53022.3–2008 и стандартом Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) A28-3 [6, 7].

Исследование проводили в два этапа. На первом этапе определяли и исключали из дальнейшей работы статистические выбросы при изучении агрегационной функции тромбоцитов с аденозиндифосфорной кислотой. Выбросы определяли с помощью метода Тьюки на основе интервала «нормальных» значений:
[Q1–1,5·IQR, Q3+1,5·IQR], где Q1, Q3 — границы первого и третьего квартилей, IQR=Q3–Q1 — межквартильный размах. С помощью метода Тьюки из исследования исключили 12 результатов определения агрегационной функции тромбоцитов, что составило 11,7%.

С учетом данных о половых и возрастных различиях агрегационной функции тромбоцитов [10] на втором этапе мы определяли целесообразность выделения групп по полу и возрасту при расчете РИ с помощью одномерного двухфакторного дисперсионного анализа.

Результаты исследования. Результаты одномерного двухфакторного дисперсионного анализа целесообразности выделения групп по полу и возрасту при расчете РИ агрегации тромбоцитов в присутствии аденозиндифосфорной кислоты представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Результаты одномерного двухфакторного дисперсионного анализа целесообразности выделения групп по полу при расчете референтного интервала агрегации тромбоцитов с аденозиндифосфорной кислотой

Таблица 2. Результаты одномерного двухфакторного дисперсионного анализа целесообразности выделения групп по возрасту при расчете референтных интервалов агрегациитромбоцитов

Статистически значимых различий в агрегации тромбоцитов в присутствии аденозиндифосфорной кислоты (средняя площадь под кривой) у мужчин и женщин не выявлено (см. табл. 1).

Статистически значимых различий в средних значениях агрегации тромбоцитов в присутствии аденозиндифосфорной кислоты у мужчин и женщин в зависимости от возраста также не выявлено (см. табл. 2).

Результаты одномерного двухфакторного дисперсионного анализа показали нецелесообразность деления взрослого населения Астраханской области по полу и возрасту при установлении РИ агрегационной функции тромбоцитов.

В связи с этим данные определения агрегации тромбоцитов у мужчин и женщин объединили в одну группу для того, чтобы рассчитать среднее значение и стандартное отклонение и сравнить полученные данные с данными, указанными в инструкции производителя.

В табл. 3 представлены значения РИ, установленные нами у взрослого населения Астраханской области, и данные из инструкции производителя.

Таблица 3. Значения референтного интервала агрегации тромбоцитов с аденозиндифосфорной кислотой

Установленный нами РИ агрегации тромбоцитов в виде 5–95‰ практически не отличался от РИ, указанного фирмой-производителем в инструкции к набору реактивов.

Сравнить значение РИ в виде Хср±1,96SD не представляется возможным, так как производитель не указал его в инструкции к наборам реактивов.

Обсуждение. Согласно известным стандартам, способ (метод) расчета РИ зависит от численности референсной группы и типа распределения значений лабораторного показателя. При численности группы менее 120 человек и ненормальном распределении лабораторных показателей используется расчет РИ в виде 5–95‰, согласно которому у 90% здоровых лиц обнаруживаются нормальные лабораторные показатели и у 10% — ненормальные. При численности группы более 120 человек и нормальном распределении лабораторных показателей используется расчет РИ в виде Хср±1,96SD, согласно которому у 95% здоровых лиц обнаруживаются нормальные лабораторные показатели и у 5% — ненормальные [6, 7].

Производитель в инструкции к наборам реактивов указал РИ в виде 5–95‰ при численности референтной группы 150 человек (см. табл. 3), это может указывать на ненормальное распределение значений агрегации тромбоцитов.

В нашем исследовании распределение агрегации тромбоцитов было нормальным и численность референтной группы составила 128 человек. Согласно стандарту CLSI A28-3 и ГОСТ Р 53022.3–2008 при нормальном распределении РИ должен быть рассчитан по формуле Хср±1,96SD [6, 7]. В этой ситуации РИ агрегации тромбоцитов в присутствии индуктора аденозиндифосфорной кислоты составляет 598,0–1120,0 AU·min.

Кроме того, пол и возраст не оказывают статистически значимого влияния на значения агрегации тромбоцитов в присутствии аденозиндифосфорной кислоты. Это отличается от данных, представленных в работе [10], которые выявили возрастные и половые отличия при установлении РИ агрегации тромбоцитов.

В заключение следует еще раз отметить следующее. В последние годы клинико-диагностические лаборатории лечебных учреждений активно оснащаются современными анализаторами. Однако отсутствие региональных РИ для лабораторных показателей затрудняет применение последних. Использование РИ, указанных в инструкции по эксплуатации анализатора, может привести к неправильной интерпретации результата лабораторного исследования, так как эти РИ были установлены для другой популяции.

Кроме того, в современных отечественных справочниках по лабораторной диагностике практически нет данных по РИ агрегационной функции тромбоцитов, которые можно брать за основу.

В то же время, несмотря на наличие РИ в инструкциях по эксплуатации анализаторов, производители лабораторного оборудования рекомендуют устанавливать РИ лабораторных показателей для населения конкретного региона, которое обслуживается данным прибором.

В связи с этим мы провели процедуру установки РИ агрегации тромбоцитов в присутствии аденозиндифосфорной кислоты на агрегометре Multiplate для взрослого населения Астраханской области. Референтный интервал агрегации тромбоцитов с аденозиндифосфорной кислотой на агрегометре Multiplate у здорового взрослого населения Астраханской области составил 598,0–1120,0 AU·min.

Заключение. Установленный интервал агрегации тромбоцитов у взрослого населения может быть использован как референтный в лабораториях Астраханской области при работе на аналогичных аналитических системах (автоматическом агрегометре Multiplate), так как он был разработан с учетом всех особенностей формирования референтных групп и со стандартизацией всех этапов лабораторных исследований.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках НИИ, проводимого Федеральным центром сердечно-сосудистой хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Литература

Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. M; 2008; 292 с.
Чарная М.А., Морозов Ю.А. Современные антиагрегантные препараты и их применение в клинике (обзор литературы). Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия 2009; 2(1): 34–40.
Siller J.M., Haberl K., Prillinger K., Panzer S., Lang I., Jilma B. The effect of antiplatet drugs clopidogrel and aspirin is less immediately after stent implantation. Thromb Res 2009; 123(6): 874–880, http://dx.doi.org/10.1016/j.thromres.2008.11.005.
Вавилова Т.В. Гемостазиология в клинической практике. СПб; 2005.
Долгов В.В., Свирин В.П. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. Тверь; 2005; 277 c.
Казакова М.С., Луговская С.А., Долгов В.В. Референсные значения показателей общего анализа крови взрослого работающего населения. Клиническая лабораторная диагностика 2012; 6: 43–49.
ГОСТ Р 53022.3–2008. Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки информативности лабораторных тестов. 2009.
Clinical and Laboratory Standards Institute. EP28-A3c. Defining, establishing, and verifying reference intervals in the clinical laboratory, approved guideline — third edition. 2010.
Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. M; 2007; 800 с.
Симонова О.И., Гордеева О.Б., Намазова-Баранова Л.С., Ботвиньева В.В., Горинова Ю.В., Солошенко М.А. Способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей. Патент РФ №2533287. 2006.
Valarche V., Desconclois C., Boutekedjiret T., Dreyfus M., Proulle V. Multiplate whole blood impedance aggregometry: a new tool for von Willebrand disease. Thromb Haemost 2011; 9(8): 1645–1647, http://dx.doi.org/10.1111/j.1538-7836.2011.04400.x.
Tóth O., Calatzis A., Penz S., Losonczy H., Siess W. Multiple electrode aggregometry: a new device to measure platelet aggregation in whole blood. Thromb Haemost 2006; 96(6): 781–788, http://dx.doi.org/10.1160/th06-05-0242.
Johnson A., Dovlatova N., Heptinstall S. Multiple electrode aggregometry and P2Y(12) antagonists. Thromb Haemost 2008; 99(6): 1127–1129, http://dx.doi.org/10.1160/th08-01-0054.