Определение токсичных и эссенциальных элементов в моче масс-спектрометрическим методом с индуктивно связанной плазмой

Проблема установления связи между воздействием факторов окружающей среды и состоянием здоровья населения является одной из наиболее актуальных и сложных в современной профилактической медицине. Использование новых медицинских технологий реабилитации и лечения населения, проживающего в условиях антропогенной нагрузки, требует новых экспрессных методик определения содержания химических соединений и элементов в биологических средах. По мнению аналитиков [1], наиболее перспективными методами, используемыми для анализа биологических жидкостей без предварительного разложения пробы, являются атомно-абсорбционный с электротермической атомизацией (ААС-ЭТА) с Зеемановской коррекцией фона и масс-спектрометрический с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС). Однако возможность определения большого количества элементов из одной пробы, низкие пределы обнаружения, хорошая воспроизводимость, широкий диапазон определяемых концентраций, низкий расход анализируемых веществ, высокая производительность обеспечивают бóльшие перспективы при анализе биосред методу ИСП-МС.

В нормативно-методической базе России представлены методические указания по определению химических элементов в биологических средах — МУК 4.1.1483-03 [2], которые носят рекомендательный характер. Они разработаны на основе метода ИСП-МС, однако не соответствуют современным требованиям стандартизации и метрологической аттестации, не учитывают конкретных условий подготовки проб, параметров настройки прибора, что вызывает трудности при использовании их в лабораторной практике.

В лаборатории методов элементного анализа Федерального научного центра медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения (Пермь) разработаны и внедрены методики одновременного определения 12 химических элементов (ванадий, хром, марганец, никель, медь, цинк, селен, стронций, таллий, свинец, кадмий, мышьяк) в биосредах [3–6]. Методики (МУК 4.1.3161-14, МУК 4.1.3230-14) зарегистрированы в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений (ФР.1.31.2014.17064) [7] и применяются в рутинной клинической диагностике нарушений здоровья населения, проживающего на территориях с негативным воздействием факторов среды обитания, а также для контроля после реабилитационного лечения в условиях стационара.

Наш выбор элементов для определения в биосредах не случаен. Рекомендованными диагностическими элементами в моче являются Cu, Zn, Mn, Ni, Pb, Cr, As,Cd, Tl и V [1, 8]. Мы сочли также необходимым контролировать содержание Sr в биосредах, так как в Пермском крае выявлены территории с повышенным содержанием стронция в питьевой воде. Следует отметить, что данные о концентрациях некоторых из перечисленных элементов в моче, приводимые разными аналитиками, довольно противоречивы. В таблице приводятся референтные значения элементов в моче, рассчитанные в диагностических лабораториях ALS Scandinavia [9], ARUP USA [10] и приведенные в известном руководстве Н.У. Тица [11]. Первые используют данные I. Rodushkin c соавт., полученные методом ИСП-МС [12], вторые ссылаются на G. Komaromy-Hiller с соавт. [13]. Различия в допустимых уровнях наблюдаются для Cr, Mn, Сu, Cd, Pb. N. Tietz приводит референтные уровни, определенные методами атомной абсорбции с пламенной и электротермической атомизацией (AAС и ААС-ЭТА), которые близки к обсуждаемым только для Сu, Zn, As. Кроме того известно, что пределы детектирования (LOD) указанных методов могут отличаться на несколько порядков [1].

Содержание токсичных и эссенциальных элементов в моче детей промышленного региона России (в сравнении с данными зарубежных исследований), мкг/ л

В связи с существующей проблемой мы поставили целью оценить правильность полученных результатов при одновременном определении ряда микроэлементов в образцах мочи с помощью ИСП-МС у детей, проживающих в промышленных регионах, используя разработанный метод.

Цель исследования — оптимизация условий проведения рутинного анализа мочи при определении содержания эссенциальных и токсичных элементов с помощью масс-спектрометрического метода с индуктивно связанной плазмой для диагностических исследований.

Материалы и методы. С аналитической точки зрения биологические жидкости сложны для анализа не только по причине очень малых содержаний большинства определяемых микроэлементов, но и вследствие их сложного матричного состава. Наиболее распространенным неинвазивным объектом исследования биосред является моча. Биологическая матрица мочи вследствие почечной фильтрации свободна от белков плазмы, липидов и других соединений с большой молекулярной массой, что упрощает процесс пробоподготовки. В то же время основной проблемой при определении элементов в моче является высокий солевой состав (хлориды, сульфаты и фосфаты), который приводит к существенному влиянию матричного эффекта и интерференционных помех. Использование октопольной реакционно-столкновительной ячейки позволяет минимизировать матричное влияние солевого состава мочи и определять такие сложные элементы, как Cr, As, Se и V.

Количественное определение V, Cr, Mn, Ni, Сu, Zn, As, Se, Sr, Cd, Tl, Pb в образцах мочи осуществляли на квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500cx (Agilent Technologies, США) с октопольной реакционно-столкновительной ячейкой. Для определения всех элементов в качестве газа-реактанта использовали гелий. Экспериментально было установлено значение скорости потока гелия, равное 5,0 мл/мин, что позволяло значительно снизить полиатомные наложения при сохранении высокого уровня чувствительности. Мощность высокочастотного сигнала — 1550 Вт. Для введения проб использовали двухканальную распылительную камеру Скотта. Температура распылительной камеры — 2,0°С. Скорость подачи образца в распылительную камеру составляла 0,4 мл/мин. Расстояние от горелки до отбирающего конуса — 9 мм. Скорость работы детектора равнялась <100 мкс на 1 ион. Для настройки использовали раствор ⁷Li, ⁵⁹Co, ⁸⁹Y и ²⁰⁵Tl в 2% HNO₃ с концентрацией 1 мкг/л для каждого элемента (Tuning Solution; Aligent Technologies, США). Соотношение ¹⁴⁰Ce¹⁶O⁺/¹⁴⁰Ce⁺ составляло менее 1%, а ¹⁴⁰Ce²⁺/¹⁴⁰Ce⁺ — менее 3%. Использовали жидкий аргон высокой чистоты — 99,99% (ТУ-2114-005-00204760-99). Максимальная скорость потока аргона составляла 20 л/мин, давление в канале подводки газа — 700±20 кПа, Т_плазмы = 8000–10 000 К. Автоматизация процесса проведения анализа обеспечивалась автосэмплером марки G3160B (Германия). В качестве основного стандартного раствора использовали раствор, содержащий 27 элементов с концентрацией 10 мг/л в 5% водном растворе HNO₃ (Multi-Element Calibration Standard-2A; Aligent Technologies, США). Для приготовления градуировочных растворов и подготовки проб применяли особо чистую HNO₃ (Sigma-Aldrich, США).

Концентрации градуировочных растворов для определения Cd и Tl составляли 0,0; 0,1; 0,5; 1,0 мкг/л; для Mn, Ni, Cr, V, Se, Cu — 0,0; 0,1; 0,5; 1,0; 5,0 мкг/л; для As, Sr, Zn — 0,0; 1,0; 5,0; 10,0; 50,0 мкг/л. Для приготовления растворов внутреннего стандарта (IS) использовали комплексный стандартный раствор ²⁰⁹Bi, ⁷³Ge,¹¹⁵In, ⁶Li, ⁴⁵Sc, ¹⁵⁹Tb, ⁸⁹Y с концентрацией 10 мг/л в 5% водном растворе HNO₃ (Internal Standard Mix; Aligent Technologies, США). В качестве внутреннего стандарта для определения Pb и Tl использовали ¹⁵⁹Tb, для определения Cd — ¹¹⁵In, а для остальных элементов — ⁷²Ge вследствие близости их потенциалов ионизации и атомной массы. Все растворы разбавляли деионизированной водой с удельным сопротивлением 18,2 MОм∙см, очищенной в системе Milli-QIntegral (MilliporeSAS, Франция). Холостую пробу готовили аналогично рабочей.

Для подготовки к анализу лабораторной посуды из стекла, тефлона, полипропилена использовали ульт­развуковую мойку Elmasonic S100H (Elma, Германия). Посуду выдерживали 20 мин в бидистиллированной воде при 55°С, затем 20 мин в водном растворе азотной кислоты (1:5) при 55°С и потом 20 мин в деионизированной воде при 55°С.

Для контроля правильности результатов анализа использовали стандартные образцы мочи Seronorm^TM urine (LOT 0511545; Sero AS, Норвегия). Подготовку к анализу осуществляли аналогично реальным пробам. Контрольные образцы анализировали после каждой пятой реальной пробы.

Результаты определения микроэлементов в процентах относительно сертифицированных значений (n=12) представлены на рисунке. Концентрации выше 100% показали Cr, Mn, Сu, As, Cd и Pb, погрешность определения составляет 1,5–7%. Концентрации ниже 100% показали V, Ni, Zn и Sr. Погрешность их определения находится в диапазоне от 2 до 7% и соответствует аттестованным значениям. На уровне 100% найдено содержание Se и Tl.

Результаты определения микроэлементов в процентах относительно сертифицированных значений в образцах SeronormTM urine (n=12): у1 — минимальный сертифицированный уровень, %; у2 — максимальный сертифицированный уровень, %; у3 — найдено, %

Результаты проведенных исследований позволили разработать методику одновременного определения 12 элементов в моче (МУК 4.1.3230-14) [7]. От действующих в настоящее время МУК 4.1.1483-03 [2] она отличается отработанной схемой пробоподготовки для минимизации матричных эффектов, выбором внутреннего стандарта для каждого определяемого элемента, использованием реакционно-столкновительной ячейки с гелием для коррекции полиатомных интерференций. Пределы обнаружения (LOD) в неразбавленной моче приведены в таблице.

Содержание V, Cr, Mn, Ni, Сu, Zn, As, Se, Sr, Cd, Tl, Pb с использованием разработанной методики определено в 57 образцах мочи детей промышленного региона России. Возраст обследованных детей составил 3–7 лет, из них 47% девочек и 53% мальчиков. В группы исследования включены дети, не имевшие в анамнезе врожденной патологии, органических и инфекционных заболеваний центральной нервной системы. Биомедицинские исследования выполняли в соответствии с обязательным соблюдением этических принципов, изложенных в Хельсинской декларации 1975 г. с дополнениями 1983 г. От каждого законного представителя ребенка, включенного в выборку, получено письменное информированное согласие на добровольное участие в исследовании.

Отбор проб утренней мочи производили в стерильные полипропиленовые контейнеры на 125 мл с винтовой крышкой (FL Medical S.r.l., Италия). Образцы мочи напрямую анализировали после разведения 1:10 1% раствором азотной кислоты: к 0,5 мл мочи добавляли 4,45 мл 1% водного раствора HNO₃ и 0,05 мл раствора внутреннего стандарта.

Результаты анализа мочи представлены в виде средней арифметической (АМ), медианы (Ме), а также диапазонов значений в группе. Медиана близка к средней арифметической только для меди и кадмия. Для сравнения в таблице приведены известные результаты анализов мочи детей Канады (возраст 6–11 лет) [14], Южной Мексики (возраст 6–11 лет) [15] и Германии (возраст 2–17 лет) [16].

Результаты и обсуждение. Содержание элементов в моче детей российской территории наблюдения не превышает принятые референтные уровни за исключением ванадия и стронция, которые превышены по медиане почти в 10 раз. Высокие концентрации стронция в моче связаны с близостью данной территории к месторождению целестиновых руд, содержащих до 20% сульфата стронция. Cодержание ванадия по сравнению с его уровнем у детей Канады по медиане показало превышение в 5 раз, по марганцу — в 10 раз, по никелю и меди — в 2 раза, свинцу — в 3 раза. Содержание мышьяка и кадмия выше у детей Канады. Содержание ванадия, хрома, марганца, меди, стронция и свинца по средним арифметическим значениям превышено по сравнению с детьми Германии. Содержание хрома, марганца, никеля, цинка, мышьяка и кадмия в моче детей шахтерского района Южной Мексики (метод ИСП-АЭС — атомно-эмиссионной спектроскопии) превышает найденные нами уровни.

Комплексная оценка состояния здоровья группы наблюдения показала, что только 1,7% детей могли быть отнесены к практически здоровым. Треть дошкольников имели хроническую патологию в состоянии компенсации и субкомпенсации (31,1%). Каждый пятый ребенок группы наблюдения имел отклонения от средних ростовых показателей, дисгармоничное физическое развитие наблюдалось у 33,6% детей. В качестве основного диагноза приоритетными являются заболевания желудочно-кишечного тракта (у половины обследованных) и патология нервной системы (у каждого пятого ребенка). По результатам ульт­развукового исследования печени, желчного пузыря и желчевыводящих путей детей обнаружены увеличение линейных размеров правой доли печени и реактивные изменения печеночной паренхимы у каждого восьмого ребенка. В структуре сопутствующей патологии преобладали болезни опорно-двигательного аппарата, сочетающиеся с высоким уровнем стронция в моче. Нарушения опорно-двигательного аппарата встречались у 62,9% и были представлены нарушением осанки (84,6%) и ускоренным созреванием костей у 27% детей.

Таким образом, по результатам определения токсичных и эссенциальных элементов в моче масс-спектрометрическим методом с индуктивно связанной плазмой с применением разработанного нами метода данную территорию можно оценить как неблагополучную по эколого-гигиенической ситуации.

Заключение. Предлагаемыйпростой способ определения эссенциальных и токсичных элементов в моче с использованием масс-спектрометра Agilent 7500cx с октопольной реакционно-столкновительной ячейкой может быть рекомендован для диагностических и скрининговых исследований в условиях клиники.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие финансирования и конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.