Адресный токсин на основе направляющего модуля неиммуноглобулиновой природы как новый агент для тераностики

Разработка новых методов и подходов для высокочувствительной детекции опухолей, а также создание новых соединений для их высокоселективной терапии на сегодняшний день — одни из наиболее актуальных и активно развивающихся направлений в биологии и медицине. Наука, объединяющая эти два направления, — тераностика — является новой стратегией в медицине, основная идея которой состоит в создании препаратов, позволяющих одновременно визуализировать очаг болезни, оказывать терапевтическое воздействие на него, следить за кинетикой доставки лекарства к очагу опухоли и в процессе мониторинга лечения регулировать схему терапии [1, 2].

Поиск молекулярных мишеней для диагностики и лечения онкозаболеваний, определение молекулярного профиля раковой клетки — еще одно важнейшее направление исследований, являющееся составной частью тераностики.

Одной из наиболее изученных опухолевых молекулярных мишеней является рецептор 2 эпидермального фактора роста человека HER2. Тирозинкиназный рецептор HER2 в норме присутствует на всех типах эпителиальных тканей человека, его плотность составляет несколько тысяч молекул на клетку. Известно, что при нормальном статусе клетки рецептор HER2 способен образовывать функционально активные гетеродимеры с другими рецепторами семейства трансмембранных тирозинкиназ (HER3 и HER4), находящимися в комплексе с лигандом [3]. При злокачественной трансформации клетки происходит амплификация гена HER2, приводящая к суперэкспрессии кодируемого им рецептора. При этом концентрация HER2 на поверхности раковой клетки резко возрастает — до нескольких миллионов молекул на клетку, и рецептор HER2 обретает способность к конститутивной гетеродимеризации c рецептором HER3 (даже если HER3 не взаимодействует со своим лигандом) [4]. Непрерывная передача сигнала от мембраны к ядру клетки приводит к повышению клеточной пролиферации, ингибированию апоптоза и, в конечном итоге, к формированию опухоли и метастазированию. Известно, что 15–20% опухолей молочной железы и рака яичника человека характеризуется повышенным уровнем экспрессии гена HER2 [5−7]. В современной медицинской практике онкомаркер HER2 является терапевтической мишенью для моноклональных антител (пертузумаб, трастузумаб) и ингибиторов киназ при лечении HER2-положительных опухолей молочной железы [8]. Для усиления цитотоксического эффекта антитела или их фрагменты конъюгируют с токсинами, например дифтерийным или псевдомонадным, получая иммунотоксины [9, 10].

Однако антитела, используемые для доставки цитотоксического модуля, как правило, характеризуются низким уровнем экспрессии, склонностью к агрегации и ограниченным проникновением в ткани. В связи с этим идет активный поиск новых адресных молекулярных конструкций — каркасных белков (скаффолдов), альтернативных связывающим доменам антител.

Несколько лет назад в лаборатории профессора А. Плюктуна (Цюрих, Швейцария) был разработан новый класс адресных молекул неиммуноглобулиновой природы на основе искусственных белков с анкириновыми повторами — DARPins (Design Ankyrin Repeat Proteins) [11]. DARPins не содержат остатков цистеина в своей структуре, что позволяет продуцировать эти белки непосредственно в цитоплазме Escherichia coli,отличаются высоким уровнем экспрессии в бактериальной системе, являются мономерами в растворе, не склонны к агрегации и характеризуются высокой устойчивостью к протеазам [12–14]. Перечисленные особенности дают каркасным белкам значительные преимущества перед иммуноглобулинами в качестве альтернативных адресных компонентов в составе мультифункциональных соединений, предназначенных для диагностики и терапии различных заболеваний.

Учитывая достоинства адресных модулей на основе DARPin по сравнению с антителами, в своей работе мы использовали DARPin_9-29, специфичный к субдомену I внеклеточного домена рецептора HER2 (K_D=3,8 нМ) [15]. DARPin_9-29 применялся нами в качестве адресного модуля для доставки к HER2-положительным раковым клеткам цитотоксического модуля (на основе фрагмента псевдомонадного экзотоксина А (252–613 а.о., 40 кДа) из Pseudomonas aeruginosa, в котором отсутствует N-концевой домен, отвечающий за взаимодействие с природным рецептором), а также для доставки визуализирующего модуля на основе флюоресцентного белка mCherry [16].

Цель исследования — получение белкового мультифункционального противоопухолевого агента DARPin-mCherry-PE40, обладающего одновременно диагностическим и терапевтическим действием.

Материалы и методы

Получение генетической конструкции pDARP-mCherry-PE40. Плазмида pDARP-PE40, содержащая в одной рамке считывания под контролем индуцибельного промотора Т7 кодирующие последовательности адресного модуля DARPin_9-29 и цитотоксического модуля на основе фрагмента PE40 псевдомонадного экзотоксина А, была получена нами ранее [17]. Кодирующую последовательность флюоресцентного белка mCherry получали в результате обработки плазмиды pIG6-4D5scFv-mCherry эндонуклеазой рестрикции AscI [18] и лигировали с плазмидой pDARP-PE40 [17], предварительно обработанной этой же эндонуклеазой. После отбора трансформантов на основе картирования с помощью эндонуклеаз рестрикции была получена плазмида pDARP-mCherry-PE40, содержащая под контролем индуцибельного промотора Т7 в одной рамке считывания кодирующие последовательности адресного модуля DARPin_9-29, флюоресцентного белка mCherry и фрагмента PE40 псевдомонадного экзотоксина А (рис. 1, а). Правильность полученной конструкции подтверждали секвенированием.

---

Рис. 1. Экспрессия и очистка адресного гибридного токсина DARPin-mCherry-PE40: а — схема генетической конструкции для экспрессии гена рекомбинантного белка DARPin-mCherry-PE40 в бактериальной системе. На схеме обозначены промотор Т7, кодирующие последовательности адресного модуля DARPin, флюоресцентного модуля mCherry и цитотоксического модуля PE40; б — очистка белка DARPin-mCherry-PE40 с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии. Представлен профиль элюции целевого белка линейным градиентом имидазола (30–500 мМ); в — гель-электрофорез белка DARPin-mCherry-PE40 в 12% полиакриламидном геле. Дорожка 1 — маркер молекулярных масс PageRuler Prestained Protein (Thermo Fisher Scientific, США), дорожка 2 — очищенная фракция белка DARPin-mCherry-PE40

---

Экспрессия и очистка рекомбинантного белка DARPin-mCherry-PE40. Штамм E. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой pDARP-mCherry-PE40. Свежевыращенные трансформанты (из расчета 1 колония на 1 мл среды) инокулировали в 25 мл среды, содержащей 2 мМ MgSO₄, 2 мМ MgCl₂, 5 мМ КH₂PO₄, 45 мМ K₂HPO₄, 100 мМ NаCl, 1% дрожжевого экстракта, 1% триптона, 0,1 г/л ампициллина, и выращивали в 250 мл колбе при 37°С до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀=0,5. Затем температуру инкубации понижали до 13°С, добавляли изопропилтиогалактопиранозид до конечной концентрации 1 мМ и растили культуру при интенсивной аэрации до оптической плотности OD₆₀₀=18−20. Клетки осаждали центрифугированием на охлажденной центрифуге (4°С) при 6000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл буфера для лизиса (20 мМ Na₃PO₄; 100 мМ NаCl; рН-7,5; 60 мкг/мл лизоцима). Клетки помещали в ледяную баню и разрушали с использованием звукового дезинтегратора Vibra Cell (Sonics, США) в режиме: 10 с — обработка ультразвуком, 10 с — охлаж­дение, всего 30 циклов. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 15 000 g в течение 20 мин на охлажденной центрифуге (4°С). К осветленному супернатанту добавляли ингибитор протеаз PMSF (1 мМ). Лизат пропускали через фильтр 0,22 мкМ, добавляли имидазол (до конечной концентрации 30 мМ), NaCl (до конечной концентрации 500 мМ) и наносили на колонку Ni²⁺-NTA (GE Healthcare, США), предварительно уравновешенную буфером: 20 мM Na₃PO₄; pH-7,5; 500 мM NaCl; 30 мM имидазола. Целевой белок DARPin-mCherry-PE40 элюировали, используя линейный градиент имидазола (30−500 мМ) (рис. 1, б). Пик, зарегистрированный при ~150 мМ имидазола, использовали для клеточной работы. Выход целевого белка составил 35 мг на 1 л культуры.

Клеточные линии и условия культивирования. Культивируемые клетки аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3 (номер по каталогу ATCC — HTB-30), гиперэкспрессирующие рецептор HER2, и клетки яичников китайского хомячка CHO-K1 (номер по каталогу ATCC — CCL-61) растили в среде McCoy’s 5A (Life Technologies, США) с 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (Hyсlone Europe, Бельгия) в атмосфере 5% CO₂ при 37°C. Для предотвращения ферментативного удаления поверхностных рецепторов при субкультивировании снятие клеток с подложки выполняли раствором Версена («ПанЭко», Россия) без использования трипсина.

Исследование цитотоксичности DARPin-mCherry-PE40. Для определения цитотоксичности адресного токсина DARPin-mCherry-PE40 клетки высевали на 96-луночные планшеты (Corning, США) в количестве 4·10³ (SK-BR-3) или 1,5·10³ (CHO-К1) клеток на лунку и культивировали в течение ночи. После этого ростовую среду в лунках заменяли на свежую, содержащую различные концентрации рекомбинантного адресного токсина DARPin-mCherry-PE40, и инкубировали при 37^оС в атмосфере 5% СО₂ в течение 72 ч.

Жизнеспособность клеток оценивали методом МТТ-теста [19]. Относительную жизнеспособность клеток (в процентах) рассчитывали как отношение усредненной оптической плотности в лунках с клетками, обработанными токсином, к усредненной оптической плотности в лунках с клетками, не обработанными токсином (конт­роль). Построение кривых цитотоксичности и расчет IC₅₀ (концентрации адресного токсина, при которой относительная жизнеспособность клеток составляет 50% от контроля) проводили методом нелинейной ре­грессии с использованием программы GraphPad Prism 6.

Конфокальная микроскопия. Для экспериментов по определению связывания белка DARPin-mCherry-PE40 с рецептором HER2 клетки в количестве 25 000 высевали в конфокальные чашки со стеклянным дном (WillCo Wells, Нидерланды) в объеме 1,5 мл и растили в течение ночи при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Перед экспериментом к клеткам добавляли белок DARPin-mCherry-PE40 (30 нM), инкубировали при 4°С и 37°С в течение 10 мин, клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером и визуализировали с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710-NLO (Carl Zeiss, Германия) при следующих параметрах: возбуждение лазером 561 нм, регистрация флюоресценции — в диапазоне 570−735 нм.

Результаты и обсуждение. Развитие молекулярной медицины диктует необходимость разработки новых препаратов, обеспечивающих высокочувствительную детекцию и высокоизбирательную терапию злокачественных новообразований.

Ранее нами был сконструирован гибридный белок DARPin-mCherry для высокоспецифичной флюо­ресцентной визуализации клеток, гиперэкспрессирующих рецептор HER2 [18]. Адресный модуль, высокоаффинный к онкомаркеру HER2, в составе рекомбинантного белка представлен неиммуноглобулиновым каркасным белком с анкириновыми повторами DARPin_9-29 [15], визуализирующий модуль — флюоресцентным белком красного спектра эмиссии mCherry [16], спектр излучения которого находится в «терапевтическом окне прозрачности» биоткани. С помощью методов конфокальной микроскопии, проточной цитофлюориметрии и поверхностного плазмонного резонанса была установлена высокая специфичность связывания DARPin-mCherry с онкомаркером HER2 и перспективность его использования как визуализирующего агента в молекулярно-биологических исследованиях [18]. Позднее нами был получен и функционально охарактеризован адресный генетически кодируемый токсин DARPin-PE40 [17], обладающий высокой избирательной цитотоксичностью относительно HER2-положительных клеток (IC₅₀=0,2 пМ), в котором к адресному модулю DARPin_9-29 был добавлен цитотоксический модуль на основе фрагмента (40 кДа) псевдомонадного экзотоксина А. Цитотоксический модуль PE40 представляет собой фрагмент природного экзотоксина А (252−613 а.о) из Ps. aeruginosa, содержащий транслокационный домен II и домены Ib и III природного токсина, отвечающие за АДФ-рибозилирование фактора 2 элонгации трансляции эукариот. PE40 вызывает необратимое ингибирование белкового синтеза в клетках эукариот.

Объединив в единой белковой молекуле все три функции, необходимые для тераностического агента, — адресную, диагностическую и терапевтическую — мы получили рекомбинантный тераностический агент DARPin-mCherry-PE40, позволяющий одновременно проводить специфическую визуализацию и элиминацию HER2-положительных раковых клеток человека.

Генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка DARPin-mCherry-PE40 в бактериальной системе под контролем индуцибельного промотора Т7 содержит в одной рамке считывания кодирующие последовательности адресного модуля DARPin, визуализирующего модуля mCherry и цитотоксического модуля PE40 (см. рис. 1, а). На 3′-конце генетической конструкции предусмотрены последовательности, кодирующие гексагистидиновую метку (для очистки рекомбинантного белка методом металл-хелатной аффинной хроматографии) и сигнальный пептид KDEL, обеспечивающий транслокацию токсина из аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикулум [20].

Экспрессию гена целевого белка DARPin-mCherry-PE40 выполняли в штамме E. coli BL21(DE3). Очистку белка DARPin-mCherry-PE40 проводили с использованием металл-хелатной аффинной хроматографии (см. «Материалы и методы»). Как видно из профиля элюции градиентом имидазола, белок с колонки сходит одним симметричным пиком (см. рис. 1, б). Электрофоретический анализ фракций этого пика (рис. 1, в) показал, что чистота белка удовлетворяет требованиям клеточной работы. Выход белка составил 35 мг с 1 л культуры.

Наличие в составе гибридного белка DARPin-mCherry-PE40 адресного модуля, специфичного к онкомаркеру HER2, предполагает высокоспецифичное взаимодействие данного белка с этим рецептором. Оценку связывания DARPin-mCherry-PE40 с поверхностью опухолевых клеток SK-BR-3, гиперэкспрессирующих рецептор HER2, проводили с использованием конфокальной микроскопии. Установлено, что при инкубации HER2-положительных клеток с гибридным белком DARPin-mCherry-PE40 в течение 10 мин при 4°С (условия, исключающие рецептор­опосредованную интернализацию белка) происходит эффективное связывание рекомбинантного белка с мембраной клеток (рис. 2). Дальнейшая инкубация клеток SK-BR-3, подвергнутых обработке DARPin-mCherry-PE40, при 37°С в течение 10 мин приводит к интернализации гибридного белка DARPin-mCherry-PE40 внутрь клетки, что свидетельствует об активном рецепторопосредованном эндоцитозе. Флюоресцентный сигнал на HER2-отрицательных клетках CHO-К1, подвергнутых обработке белком DARPin-mCherry-PE40 при 37°С, обнаружить не удалось, что свидетельствует о специфическом взаимодействии DARPin-mCherry-PE40 с рецептором HER2.

---

Рис. 2. Взаимодействие гибридного белка DARPin-mCherry-PE40 с рецептором HER2. Представлены конфокальные изображения клеток SK-BR-3, обработанных DARPin-mCherry-PE40 при 4°С, а также клеток SK-BR-3 и CHO-К1, обработанных адресным токсином при 37°С. Левая панель соответствует изображениям клеток в проходящем свете, правая — флюоресцентным изображениям клеток в красном канале

---

Для определения специфической цитотоксичности гибридного токсина DARPin-mCherry-PE40 использовали спектрофотометрический МТТ-тест жизнеспособности HER2-гиперэкспрессирующих клеток SK-BR-3 в сравнении с жизнеспособностью HER2-отрицательных клеток CHO-К1. Установлено, что обработка HER2-положительных клеток SK-BR-3 белком DARPin-mCherry-PE40 приводит к специфическому снижению жизнеспособности этих клеток в диапазоне пикомолярных концентраций (IC₅₀=3,55 пМ) (рис. 3). В то же время для клеток CHO-К1, не гиперэкспрессирующих рецептор HER2, значимый цитотоксический эффект в указанном диапазоне концентраций токсина DARPin-mCherry-PE40 не наблюдается. Полученные данные свидетельствуют о высокой избирательной цитотоксичности DARPin-mCherry-PE40 по отношению к опухолевым клеткам, гиперэкспрессирующим онкомаркер HER2.

---

Рис. 3. Анализ цитотоксичности DARPin-mCherry-PE40 in vitro. По­ка­зана относительная жизнеспособность HER2-положительных клеток SK-BR-3 и HER2-отрицательных клеток CHO-К1 после их обработки адресным токсином DARPin-mCherry-PE40 в течение 72 ч

---

Заключение. Полученный в результате цитоплазматической экспрессии в бактериальной системе активный рекомбинантный адресный токсин DARPin-mCherry-PE40 является перспективным тераностическим агентом для одновременной детекции и элиминации HER2-положительных раковых клеток. Высокая избирательная цитотоксичность DARPin-mCherry-PE40 относительно HER2-положительных клеток, доказанная с помощью конфокальной микроскопии и спектрофотометрического МТТ-теста, свидетельствует о том, что все три домена в составе рекомбинантного белка сохранили свои функциональные свойства — высокую аффинность к опухолевому антигену, способность к флюоресценции и цитотоксичность. Таким образом, сконструированный мультифункциональный рекомбинантный белок DARPin-mCherry-PE40 объединяет функции селективной и высокоэффективной детекции раковых клеток и избирательного терапевтического воздействия на них, реализуя принцип, когда целое больше, чем сумма составляющих частей.

Финансирование исследования. Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации (проект RFMEF157814X0051).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.