Разработка наносекундного лазерного модуля, встраиваемого в роботизированный многофункциональный хирургический комплекс для малоинвазивной терапии патологии челюстно-лицевой области, и определение эффектов его воздействия на плазму крови

Современная медицина немыслима без применения лазерных технологий. Лазерное излучение обладает уникальными свойствами по отношению к биологическим тканям. Параллельный пучок светового потока, генерируемый лазерным излучением, дает возможность фокусироваться на объекте в пятно минимального диаметра с различными параметрами воздействия — длиной волны, длительностью, интенсивностью, что позволяет воздействовать на биологический объект с возбуждением различной реакции в тканях [1].

Последнее десятилетие характеризуется активным развитием робототехнических технологий в медицине. Конструирование и внедрение робота da Vinci дало возможность проведения тонких хирургических вмешательств в урологии, гинекологии, абдоминальной хирургии [2]. Роботизированные хирургические системы на основе лазеров используются в офтальмологии.

Достигнутые результаты убедительно показывают преимущества роботизированной хирургии, такие как минимальная инвазивность, высокая точность, быстрая реабилитация.

Перспективной представляется разработка робототехнического комплекса для лечения сложной патологии челюстно-лицевой области с возможностью интеграции лазерного модуля в манипуляторы робота-хирурга, доставляющие световые потоки лазерного излучения в глубокие анатомические структуры головы и шеи. Наличие множества тончайших анатомических структур в челюстно-лицевой области — мышц, сосудов и нервов, воздухоносных синусов — обусловливает сложности при проведении хирургических вмешательств и не позволяет добиться точности манипуляций врача-хирурга [3]. Множественность патологии челюстно-лицевой области, необходимость применения различных методов терапии, заместительной и реконструктивной хирургии тканей и органов головы и шеи требуют математического расчета условий выполнения процедур с подключением искусственного интеллекта [4].

Одним из этапов конструирования такого мультифункционального комплекса является разработка и создание лазерного модуля с уникальными характеристиками лазерного излучения и возможностью комбинированного воздействия низкоинтенсивным и высокоинтенсивным излучением для получения терапевтического и хирургического эффектов в тканях одномоментно.

Воздействие лазерного излучения на кислород является одним из важных факторов, обусловливающих комплексность биохимических реакций в тканях. Фотохимические реакции, возбуждаемые в клетках под действием лазерного излучения, запускают различные молекулярные механизмы, связанные в том числе с переходом растворенного в тканях молекулярного кислорода в синглетное состояние. На фотохимических реакциях основан метод фотодинамической терапии, которая представляет собой взаимодействие трех компонентов — фотосенсибилизатора, лазерного излучения и кислорода. Кислород фотосенсибилизатора, накопившегося в тканях под действием лазерного излучения, переходит в возбужденное триплетное состояние, энергия которого в свою очередь переходит на внутриклеточные молекулы кислорода в тканях с образованием молекулярного синглетного кислорода в соответствии со следующей схемой:

Sens + h → ¹Sens*;

¹Sens* → ³Sens*;

³Sens* + ³O₂ → ¹O₂ + Sens;

¹O₂ + Substrate → Oxidation,

где синглетное и триплетное возбужденное состояния фотосенсибилизаторов представлены как ¹Sens* и ³Sens*, синглетный кислород — ¹О₂.

Синглетный кислород является сильнейшим окислителем ароматических аминокислот и при вступлении в химические реакции с клеточными элементами разрушает мембранные структуры, запуская реакцию перекисного окисления липидов в клетке или околоклеточном пространстве. Деструкция биологических субстратов приводит также к образованию свободных радикалов, обладающих вторичным повреждающим действием на клетки. Известно большое количество соединений, способных выступать в качестве фотосенсибилизаторов, которые могут поглощать излучение всей видимой области спектра, но интенсивность реакции многократно усиливается при облучении светом с длиной волны, соответствующей пику поглощения — узкому диапазону, специфичному для каждого конкретного соединения. Возможность проведения фотодинамических реакций в тканях без использования фотосенсибилизаторов с помощью прямой генерации синглетного кислорода по следующей схеме:

³O₂ + h → ¹O₂;

¹O₂ + Substrate → Oxidation

видится наиболее перспективной для дальнейшего применения в медицинской практике. Такие реакции возникают при воздействии лазерным излучением с длиной волны, близкой к максимальному поглощению кислорода в тканях — 1265±5 нм [5]. Использование ультракоротких лазерных импульсов (фемтосекундных, пикосекундных, наносекундных) позволяет проникать световому потоку глубже в ткани без их существенного нагрева. За счет малого времени жизни и высокой мощности лазерных импульсов за время электронного перехода в молекуле кислорода с определенной вероятностью происходит суммирование энергии двух и даже трех лазерных фотонов, приводящее к заселению тканей кислородом в синглетном состоянии [6].

Лазерные излучатели, способные генерировать ультракороткие волны с определенной частотой, имеют высокую цену и большие размеры [7]. Исследовательской группой кафедры хирургии полости рта МГМСУ им. А.И. Евдокимова разработана модель диодного лазерного генератора с уникальными параметрами. Генератор выполнен в виде модуля, сконструирован на основе полупроводниковых кристаллов, имеет компактные размеры и способен к генерации наносекундных импульсов высокой мощности с продолжительностью импульса 400 нс и частотой следования 500 кГц. Такие характеристики обеспечивают более глубокое проникновение в ткани и суммирование энергии лазерных фотонов для усиления фотодинамических эффектов без применения экзогенных фотосенсибилизаторов (заявка на изобретение №2016129331 от 19.07.2016 г.).

Данный излучатель может использоваться как самостоятельный лазерный аппарат для применения в каждодневной практике врача-стоматолога при проведении различных хирургических вмешательств в челюстно-лицевой области, а также в терапии одонтогенных воспалительных заболеваний и патологии слизистой оболочки полости рта. Кроме того, компактные размеры и наличие гибких тонких световодов позволяют использовать разработанный модуль в робототехнической медицинской лазерной установке для малоинвазивной челюстно-лицевой хирургии.

Для внедрения в клиническую практику нового прибора и подтверждения его уникальных характеристик требуется проведение лабораторных испытаний по оценке различных факторов воздействия лазера на биологические ткани и, в частности, на элементы крови. Одним из важных аспектов является изучение фотохимических эффектов в плазме крови при воздействии лазерного излучения с определенными параметрами.

Цель исследования — оценка эффективности возбуждения синглетного кислорода в плазме крови in vitro с использованием инфракрасного лазерного излучения с длиной волны 1260±4 нм, генерируемого лазерным импульсным модулем, который предназначен для встраивания в робототехническую хирургическую установку для малоинвазивной хирургии челюстно-лицевой области.

Материалы и методы. В работе использовали модель разработанного наносекундного лазера с сенсорным дисплеем управления на полупроводниковых кристаллах, имеющую основной инфракрасный (ИК) излучатель с длиной волны, примерно соответствующей максимуму поглощения кислорода (1256–1264 нм), с генерированием импульсного сигнала с продолжительностью импульса 400 нс и частотой следования импульсов 500 кГц. Излучение фокусировалось в оптическом световоде диаметром 500 мкм.

Лазерный генератор сконструирован таким образом, что имеется возможность внедрения до трех дополнительных излучателей различных длин с использованием в одном световоде. Данная схема имеет преимущество перед существующими аналогами, так как применение нескольких различных длин волн разнонаправленного действия в одном световоде позволит проводить манипуляции одновременно с различными эффектами воздействия на ткани, что в свою очередь будет способствовать повышению терапевтического эффекта.

Для выделения плазмы из крови использовали пробирку с гепарином натрия и олефиновым гелем. Гепарин — это кислый мукополисахарид с молекулярной массой от 3000 до 40 000 Да. Он является натуральным антикоагулянтом, активирующим создание комплексных соединений между антитромбином III и такими факторами свертывания крови, как тромбин, факторы XIIa, XIa, Xa, IXa и VIIa. В таком комплексе факторы свертывания инактивируются необрати­­мо. Натриевая соль гепарина в пропорции к забираемой в пробирку крови 15–20 МЕ/1 мл служит гарантией полной инактивации факторов свертывания крови и не искажает параметры жидкости. Олефиновый гель представляет собой тиксотропный кополимер, который тяжелее плазмы, но легче форменных клеток крови, поэтому после центрифугирования он в виде тонкой полоски занимает промежуточное положение и служит разделительным барьером.

Фотохимические измерения проводили в разбавленной нейтральным (pH=7,6) фосфатным буфером (1,3-дифенилизобензофуран — ДФИБФ) плазме крови. Для опытов использовали три образца плазмы крови, полученные при различных режимах центрифугирования: образец 1 — 10 мин при 3600 об./мин и 20 мин при 6000 об./мин; образец 2 — 10 мин при 4500 об./мин и 15 мин при 3600 об./мин; образец 3 — 15 мин при 6000 об./мин. В каждом случае для обеспечения возможности надежного измерения оптической плотности в диапазоне длин волн 380–500 нм спектрофотометра необходимо было разбавить плазму буфером в 2 раза, поскольку она содержала заметное количество гемоглобина.

В работе использовали квадратные кварцевые флюоресцентные кюветы с длиной оптического пути 1 см. Объем проб в кюветах всегда составлял 0,75 мл, а концентрация в них ДФИБФ подбиралась так, чтобы оптическая плотность в максимуме поглощения входила в интервал значений от 0,9 до 1,1. Головку световода размещали вплотную к кювете с раствором ловушки. Продолжительность сеанса облучения пробы была подобрана так, чтобы эффект выцветания ДФИБФ был достоверно измеримым, но не слишком сильным. Оптическую плотность растворов (при длине волны 414 нм) измеряли до и после облучения, используя однолучевой спектрофотометр СФ-56 («Солар», Россия).

Контроль за реакцией выделения синглетного кислорода осуществляли с помощью спектрофотометра по выцветанию при лазерном облучении основной полосы поглощения ловушек при 414 нм. Для точности определения ответственности синглетного кислорода за убыль субстрата в раствор добавляли специальные химические агенты — тушители синглетного кислорода. Кроме того, путем барботирования растворов азотом добивались освобождения их от растворенного кислорода.

Для оценки эффективности генерации синглетного кислорода при использовании разработанного модуля полученные данные сравнивали с таковыми при применении генератора лазерного излучения с длиной волны 1270 нм в непрерывном режиме излучения.

Результаты и обсуждение. При облучении растворов ДФИБФ исследуемым ИК-лазером в разбавленной плазме крови из всех образцов в течение 1,5 ч наблюдался достоверный эффект выцветания ловушки (рис. 1–3).

---

Рис. 1. Серия спектров поглощения химической ловушки в разбавленной плазме крови (образец 1) при действии исследуемого лазера

---

Рис. 2. Серия спектров поглощения химической ловушки в разбавленной плазме крови (образец 2) при действии исследуемого лазера

---

Рис. 3. Серия спектров поглощения химической ловушки в разбавленной плазме крови (образец 3) при действии исследуемого лазера

---

Уменьшение оптической плотности при 414 нм достоверно отмечалось во всех трех образцах плазмы крови, эффект составил около 0,04±0,01 за 30 мин облучения. Высокие скорости центрифугирования при получении плазмы крови влияют на повышенное разрушение кровяных клеток (эритроцитов, лейкоцитов), что обусловливает большое количество антиоксидантных веществ в полученных образцах. Несмотря на наличие высокого уровня антиоксидантов, чем обусловлена высокая степень тушения синглетного кислорода, было зарегистрировано достоверное убывание плотности химической ловушки.

При сравнении значений оценки эффективности генерации синглетного кислорода разработанным лазерным модулем, генерирующим наносекундные ультракороткие импульсы, и лазерным излучателем, работающим в непрерывном режиме и генерирующим длину волны, близкую к максимуму поглощения кислорода (≈1270 нм), были получены следующие результаты (см. таблицу).

---

Сравнение эффективности фотодеструкции ловушки синглетного кислорода при действии двух инфракрасных лазеров с различным режимом излучения

---

Значения относительных скоростей выцветания ловушки в плазме крови при действии двух ИК-лазеров соответствуют скорости падения оптической плотности ловушки, нормированной на мощность 1 Вт за 30 мин лазерного облучения. Каждое число является средним значением для трех независимых измерений (статистическая погрешность ±5%).

Из таблицы видно, что выцветание ДФИБФ при использовании лазера с наносекундным импульсным излучением практически в 10 раз больше, чем при использовании лазера, работающего в непрерывном режиме. Полученный результат можно объяснить тем, что лазерные ультракороткие импульсы высокой мощности способствуют увеличению времени релаксации кислорода в тканях и вероятному суммированию энергии лазерных фотонов и тем самым — заселению тканей синглетным кислородом.

Таким образом, поскольку молекулы ДФИБФ (химической ловушки) имеют максимум поглощения только в УФ- и видимой области спектра и не поглощают ИК-излучение лазера, эффект обусловлен прямым лазерным возбуждением растворенного кислорода, полоса поглощения которого соответствует спектральной области лазерного излучения. Сравнение действия импульсного наносекундного лазера и лазера, генерирующего непрерывное ИК-излучение, показывает, что эффективность выцветания ДФИБФ значительно выше при действии импульсного лазерного излучения по сравнению с непрерывным излучением с одинаковой длиной волны, близкой к максимуму поглощения кислорода.

Заключение. Полученные результаты оценки эффективности возбуждения синглетного кислорода в плазме крови in vitro свидетельствуют о больших возможностях разработанной модели лазера, генерирующего импульсное наносекундное излучение. Размеры и уникальные характеристики лазера позволяют использовать его в виде модуля в робототехнической установке для челюстно-лицевой хирургии.

Финансирование исследования. Субсидия по государственному заданию Министерства здравоохранения РФ 056-00139-16

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.