Разработка и доклинические исследования ортотопических костных имплантатов на основе гибридной конструкции из поли-3-оксибутирата и альгината натрия

Восстановление костных дефектов неправильной геометрической формы остается сложной в выполнении процедурой. Врожденные и особенно посттравматические дефекты и деформации в челюстно-лицевой области отличаются разнообразием форм, для их замещения требуются, как правило, не просто остеопластические материалы, а костные имплантаты (КИ), повторяющие форму восстанавливаемого дефекта [1]. Благодаря современному программному обеспечению, интегрирующему в себе возможность обработки данных компьютерной томографии и виртуального объемного (3D) моделирования, у исследователей и клиницистов появилась возможность проводить компьютерное планирование реконструктивных операций и получать модели костных имплантатов, полностью конгруэнтных воспринимающему ложу [2, 3], т.е. процесс подготовки модели КИ для производства можно считать вполне решаемой задачей.

Для изготовления самих КИ произвольной формы предложено несколько технологий. Одна из них — фрезерование аллокости [4, 5], керамических блоков [6], сложных костных матриксов [7]. Однако многие исследователи отмечают, что аллокость имеет ряд недостатков, а керамика характеризуется длительным сроком резорбции [8]. Другой многообещающей технологией для изготовления КИ является аддитивное производство, или 3D-печать. Одной из первых начала производить индивидуальные костные имплантаты методом 3D-прототипирования компания Oxford Performance Materials, Inc. [9]. В России имеется зарегистрированная и разрешенная к клиническому применению технология производства индивидуальных накостных имплантатов для контурной пластики из политетрафторэтилена, однако данный класс материалов относится к биоинертным, но не биоразлагаемым и не замещается костной тканью [3, 10].

Развитие прямой 3D-печати КИ осложняется тем, что материалы, традиционно используемые для замещения костных дефектов: полимеры (полиоксиалканоаты (ПОА), полилактиды, полигликолид и др.), минеральные материалы (полигидроксиапатит, соли кальция), ксено- и алломатериалы, — или не подходят для традиционных методов 3D-печати, или меняют свои физико-химические и биологические свойства и становятся непригодными для восстановления кости.

Для непрямых технологий изготовления 3D-изделий с заданной формой выбор материалов также имеет большое значение. Такие материалы должны обеспечивать заданную микроструктуру изделия, его физико-химические и биологические характеристики (достаточную прочность, пластичность, гидрофильность, способность к биодеструкции, биосовместимость). Далеко не всегда один материал может обеспечить сочетание всех данных свойств, в связи с чем в последнее время активно развивается направление создания гибридных конструкций с использованием различных биополимеров и минеральных веществ.

Одними из наиболее используемых полимеров для биоинженерии твердой соединительной ткани являются ПОА и альгинаты [11–13]. По своим свойствам эти полимеры сильно различаются. ПОА — это более гидрофобные, механически прочные, биодеградируемые с низкой скоростью полиэфиры, тогда как альгинаты — гидрофильные, образующие гидрогели, механически непрочные, биодеградируемые с высокой скоростью полисахариды. Образование композитов из полимеров этих двух классов позволяет регулировать свойства полученного композитного материала в самых широких пределах. Альгинаты активно используются для изготовления матриксов в инженерии костной, хрящевой, мягкой соединительной, мышечной тканей [12], тогда как матриксы на основе ПОА применяются преимущественно для регенерации костной ткани [11]. ПОА, в частности гомополимер поли-3-оксибутират (ПОБ), получают биотехнологическим путем с использованием высокоэффективного штамма-продуцента Azotobacter chroococcum 7Б, что дает возможность получать полимеры высокой степени очистки с заданными свойствами [14]. Несмотря на то, что для биомедицинских целей используют альгинаты, выделенные из бурых водорослей, эти биополимеры можно также получать биотехнологическим путем с помощью штаммов-продуцентов того же самого вида бактерий Azotobacter chroococcum [15].

Авторами разработан метод изготовления КИ сложной формы на основе ПОБ и альгината натрия методом двойного выщелачивания с использованием пресс-формы, выполненной методом 3D-печати.

Цель исследования — разработка технологии изготовления костных имплантатов на основе гибридной полимерной конструкции из поли-3-оксибутирата и альгината натрия для направленной костной регенерации с применением метода 3D-печати.

Материалы и методы

Реактивы. Использовали ПОБ (молекулярная масса — 150 кДа) и альгинат натрия (Sigma-Aldrich, Германия); трихлорметан (EKOS-1, Россия); карбонат аммония («Химмед», Россия); сахарозу («Химмед», Россия); стрэнг из полилактида для 3D-печати методом послойного наплавления (температура плавления — 200–255°С, плотность — 1,2–1,08 кг/м², экологически чист, не токсичен, высокая точность при печати, производство Московского завода FDPlast, Россия); Золетил 100 (Virbac, Франция); Рометар (Bioveta, Чехия); Доксициклин («Бинергия», Россия); Тетрациклин («Биохимик», Россия); ализариновый красный («ХимМедСервис», Россия).

Компьютерное моделирование и 3D-печать форм для изготовления КИ. Проведена конусно-лучевая компьютерная томография головы крысы. На основе DICOM-файлов осуществлена реформация 3D-модели черепа (рис. 1). По центру теменной кости смоделирован костный дефект цилиндрической формы диаметром 8 мм (рис. 2). Модель имплантата выполнена таким образом, чтобы не только заполнять костный дефект, но также перекрывать его снаружи. Это позволит защитить твердую мозговую оболочку и головной мозг от внешнего воздействия (рис. 3). Так как исследование проводилось на крысах одной массы и размера, все модели были изготовлены также одного размера. На рис. 4 представлена 3D-модель формы для изготовления КИ.

Рис. 1. 3D-модель черепа крысы, реформированная из DICOM-файлов

Рис. 2. Модель черепа крысы с искусственно смоделированным дефектом

Рис. 3. 3D-модель костного имплантата: а — вид снизу; б — вид сбоку и сверху; в — вид сбоку и снизу. Верхняя часть имплантата будет перекрывать костный дефект, защищая головной мозг

Рис. 4. 3D-модель формы для отливки имплантатов

Изготовление костных имплантатов по напечатанным 3D-формам. С использованием 3D-прин­тера PrusaMendel v2 (NWRepRap, США), работающего по принципу послойного наплавления, были выполнены формы для КИ из полилактида. Так как в процессе изготовления КИ применяется органический растворитель хлороформ, растворяющий полилактид, формы были изолированы алюминиевой фольгой (рис. 5).

Рис. 5. Форма для отливки имплантатов: а —на этапе печати; б — на этапе изоляции фольгой

Такой процесс отливки легко масштабируется для изготовления имплантатов размером не менее 5×5×5 см.

Получение полимерных матриксов для изготовления костных имплантатов. С целью получения пористых матриксов использована новая модификация широко применяемого для изготовления матриксов в тканевой инженерии метода выщелачивания — метод двойного выщелачивания [16]. В качестве порообразующих агентов выбраны карбонат аммония и сахароза. Размер кристаллов карбоната аммония составлял 40–94 мкм, сахарозы — 94–315 мкм. Нормирование размеров производили с помощью лабораторных сит U1-ESL с ячейками 40, 94 и 315 мкм («Крафт», Россия).

На первой стадии метода двойного выщелачивания происходит термическое разложение карбоната аммония:

(NH₄)₂CO₃→2NH₃+CO₂+H₂O,

при этом образуются поры меньшего диаметра. На второй стадии воду меняли несколько раз до полного вымывания сахарозы.

Раствор ПОБ (65 мг на 1 мл трихлорметана) добавляли к смеси карбоната аммония и сахарозы (1:3) до состояния смеси, близкого к жидкой пасте. Этой смесью заполняли форму, изготовленную ранее. После испарения растворителя форму погружали в горячую воду (~90°С). После прекращения газообразования полученные матриксы удаляли из формы и промывали дистиллированной водой — 5 раз по 30 мин на шейкере.

Перед имплантацией матриксы заполняли 1% раствором альгината натрия до полного насыщения и затем помещали в 50 мМ раствора CaCl₂ до полного гелирования альгината в матриксе, после чего полученный гибридный матрикс промывали фосфатно-буферным солевым раствором.

Подобная гибридная конструкция из матрикса на основе ПОБ, заполненного альгинатом натрия, была разработана с учетом ранее полученных данных [17, 18]. Нами установлено, что барьерная мембрана из ПОБ и паста для заполнения костных дефектов на основе микросфер из ПОБ в альгинатном геле являются эффективными для регенерации костной ткани. Кроме того, альгинат натрия может быть использован в дальнейшем в качестве средства для инкапсулирования и введения в матрикс мезенхимальных стволовых клеток и других клеток, применяемых для стимуляции регенерации костной и хрящевой тканей [19].

Структура и морфология матриксов. Иссле­дование внешнего вида, морфологии и структуры полученных матриксов проводили с использованием сканирующего электронного микроскопа JSM-6380LA (Tokyo Boeki Ltd., Япония). С этой целью образцы закрепляли на алюминиевых столиках и напыляли золотом 15 мин при силе тока 15 мА (IB-3; Giko Engineering Co., Япония).

Пористость. Пористость матриксов оценивали с помощью метода определения пористости через массу. Сначала измеряли массу пористого матрикса (Acculab AL-64, США), его диаметр и высоту, рассчитывали теоретический объем монолитного матрикса, а с учетом плотности полимера (1,25 г/см³) определяли массу сплошного непористого образца. Пористость рассчитывали по формуле:

П=(1–m₁/m₂)·100%,

где m₁ — измеренная масса пористого образца, а m₂ — расчетная масса монолитного образца без пор, объем которого совпадает с объемом пористого образца.

Наличие открытых пор выявляли путем окраски чернилами. Образец матрикса обмакивали в чернила, высушивали, после чего разрезали.

In vivo исследования на критическом костном дефекте. Для изучения регенерации костей черепа наиболее показательной является модель критического дефекта свода черепа (теменной кости) у крысы [20], позволяющая получить воспроизводимые данные и сравнить их с многочисленными результатами других исследований [8, 16–18]. Эту модель используют для оценки эффективности и безопасности различных костезамещающих материалов, в том числе матриксов с факторами роста и клетками [21–23].

Методика операции. Исследование проводили на 24 самцах крыс линии Wistar c массой тела 400 г. Эксперимент соответствовал рекомендациям локального биоэтического комитета НижГМА, при его постановке руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» в соответствии с приказами МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г., №701 от 24.07.1978 г. и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» от 19.06.2003 г.

Под внутрибрюшинным наркозом (Золетил 100, 125 мкг/кг массы тела) крысам производили поперечный и вертикальный латерально-смещенный разрез кожи головы, формируя треугольный лоскут, и последовательно тупым и острым путем обнажали теменные кости. Посередине сагиттального шва на теменных костях формировали круглое отверстие с помощью трепана С-reamerдиаметром 8 мм и высотой 1,5 мм из набора Neobiotech SLA (Neobiotech, Корея), избегая перфорации сагиттального венозного синуса. Рану послойно ушивали (рис. 6).

Рис. 6. Этапы операции: а — хирургический доступ; б — формирование критического костного дефекта; в — закрытие дефекта костным матриксом; г — подшивание костного матрикса к надкостнице

Введение флюоресцентных меток для изучения скорости регенерации костных дефектов. Механизм мечения костного регенерата основывается на связывании тетрациклиноподобных флюорохромов и ионов кальция с образованием хелатных соединений, которые накапливаются в новообразованной костной ткани, что обеспечивает их последующую визуализацию. Для оценки динамики неоостеогенеза на разных сроках проводили прижизненное тройное мечение ново­образованной костной ткани. Всем экспериментальным крысам делали внутрибрюшинные инъекции раствора доксициклина к началу активной минерализации остеоида на 8, 9 и 10-й день после операции. Затем на 15, 16 и 17-й день эксперимента крысам внутрибрюшинно вводили раствор тетрациклина, который, включаясь в новообразованную костную ткань, образует новую меченую область. На 22, 23 и 24-й день вводили ализарин красный С для полного окрашивания краев минерализованного регенерата. Метки вводили в дозировке 25 мг/кг массы тела. Таким образом, мечение осуществляли по схеме 7–3–4–3–4–3–4 (три дня введения чередовались с четырехдневными перерывами).

На 28-й день, что соответствовало окончанию процессов первичного остеогенеза [24], крыс выводили из эксперимента передозировкой наркоза Золетил/Рометар. Скелетировали свод черепа, область регенерата выделяли с использованием хирургических цилиндрических боров и физиодиспенсера. Полученные образцы свода черепа фиксировали в 40% этиловом спирте в течение 24 ч. Такой способ фиксации широко употребляется для сохранения флюоресцентных меток и хорошей пропитки костной ткани [25].

Гистологическое исследование. Образцы фиксировали в 70% этаноле в течение 24–72 ч. Затем промывали, обезвоживали и заливали в метилметакрилат (Osteo-Bead; Sigma-Аldrich, США) по стандартной методике, рекомендованной производителем, с последующей полимеризацией. Из полученных блоков изготавливали первичные срезы толщиной 200 мкм (Low Speed Sow, Швейцария), из которых в свою очередь готовились вторичные срезы толщиной 40–50 мкм. Контроль толщины среза осуществляли стандартным механическим микрометром барабанного типа.

Микроскопическое исследование проводили на флюоресцентном микроскопе Leica DM 4000B (Leica Microsystems, Германия). Микро­фото­графирование выполняли с помощью стандартного набора светофильтров с последующим сложением RGB-каналов в единое изображение с использованием штатного программного продукта Leica для флюоресцентной микроскопии (мультиканальная гистопантомограмма).

Результаты и обсуждение

Структура и морфология матриксов. По методике двойного выщелачивания нами получены трехмерные матриксы из ПОБ (молекулярная масса — 150 кДа) (рис. 7). Изучение образцов полимерных подложек методом сканирующей электронной микроскопии (рис. 8) показало, что матриксы имеют трехмерную пористую структуру с разным размером пор: микропоры — 23±8 мкм, макропоры — 410±75 мкм. Размер микропор более 300 мкм считается оптимальным для проникновения питательных веществ и клеток во всем объеме материала [26].

Рис. 7. Внешний вид матриксов из поли-3-оксибутирата: а — до и б — после насыщения альгинатом натрия

Рис. 8. Микроструктура матриксов на основе поли-3-оксибутирата: а — до и б — после заполнения альгинатом натрия. Сканирующая электронная микроскопия

С помощью окрашивания чернилами определяли характер системы пор. Установлено, что матриксы из ПОБ имеют сообщающуюся систему пор. В среднем пористость матриксов составила 93%.

Гистологическое исследование. При микроскопическом исследовании с использованием флюоресцентной микроскопии образцов костной ткани теменных костей крыс выявлено, что накопление флюоресцирующих меток в костной ткани произошло успешно. Однако четкого градиента окрасок на гистологических срезах при микроскопии выявить не удалось, поскольку объем костной ткани накапливался постепенно и области окрашивания перекрывались. Поканальное изучение свечения флюорохромов выявило их присутствие и накопление в своем спектре, однако совмещение изображений в единое целое уже не позволяло четко идентифицировать области накопления флюорохромов в зависимости от срока наблюдения (рис. 9).

Рис. 9. Мультиканальная гистопантомограмма гистологического среза теменных костей крыс с раздельным флюоресцентным окрашиванием через 28 дней после трепанации

Заключение. Разработана комплексная методика получения гибридных полимерных 3D-матриксов заданной формы и микроструктуры, включающая методы 3D-печати, двойного выщелачивания и создания гибридных полимерных конструкций. Метод 3D-печати позволяет создавать форму для изготовления шаблонов для заполнения черепных дефектов не менее 5 мм в диаметре. Метод двойного выщелачивания позволяет изготавливать матриксы, предназначенные для заполнения костных дефектов. Полученные матриксы представляют собой гибридную конструкцию из различных биосовместимых полимеров — поли-3-оксибутирата и альгината натрия, в которой альгинат служит гидрогелем-наполнителем твердого высокопористого матрикса из поли-3-оксибутирата.

Исследования гистологических срезов образцов костной ткани при помощи флюоресцентной микроскопии с раздельным окрашиванием флюо­рохромами показали, что гибридный матрикс из поли-3-оксибутирата и альгината натрия обладает ограничительной функцией, обеспечивая условия для нормальной регенерации плоских костей черепа у крыс. Разработанный гибридный 3D-матрикс не препятствует течению нормального остеогенеза и обеспечивает благоприятные для регенерации условия.

Благодарности. Коллектив авторов благодарит Арутюнян Ирину Владимировну за помощь в проведении исследования.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (соглашение №15-15-10014 от 01.05.2015 г.).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.