Получение клона клеток гастроинтестинальной стромальной опухоли с признаками множественной лекарственной устойчивости и оценка его свойств

Несмотря на существовавшую на протяжении длительного времени точку зрения о низкой эффективности химиотерапии у больных с гастроинтестинальными стромальными опухолями (ГИСО) [1, 2], в последнее время появились исследования, свидетельствующие об обратном. Например, показаны достаточно хорошие перспективы для использования отдельных химиопрепаратов в лечении больных с метастатическими и неоперабельными формами ГИСО [3, 4]. Результаты, полученные нашей научной группой, также свидетельствуют о том, что некоторые опухолевые клеточные линии ГИСО чувствительны к ингибиторам топоизомеразы II типа как in vitro, так и in vivo [5, 6]. Примечательно, что эффект химиопрепаратов данной группы был выявлен в отношении клеточных линий ГИСО — как чувствительных, так и резистентных к таргетному препарату иматинибу. Кроме того, мы обнаружили, что иматиниб способен вызывать сенситизацию опухолевых клеток ГИСО к химиопрепаратам данной группы [7]. Одним из потенциальных механизмов такого феномена является обнаруженная нами способность иматиниба ингибировать процессы гомологичной рекомбинации ДНК и, как следствие, невозможность опухолевых клеток репарировать повреждения ДНК, возникшие под воздействием на них доксорубицина и этопозида [8]. Результаты этих экспериментальных данных коррелируют с результатами некоторых клинических исследований, показавших эффективность применения иматиниба в комбинации с малыми дозами доксорубицина у больных с ГИСО [9]. Примечательно, что эффективность использования вышеуказанной комбинации препаратов была показана в том числе в группе больных, у которых не определялись известные «традиционные» мутации KIT/PDGFRA.

Вышеизложенное свидетельствует о хороших перспективах применения отдельных химиопрепаратов для терапии больных с ГИСО. В то же время является очевидным факт неуклонного развития химиорезистентности злокачественных новообразований после начала проведения химиотерапии онкологическим больным. Временной интервал, в течение которого опухоль остается восприимчивой к химиопрепаратам, зависит от многих факторов и может варьировать в каждом индивидуальном случае. Следовательно, представляется перспективной индивидуальная оценка чувствительности опухоли к химиопрепаратам и подбор индивидуальных схем химиотерапии онкологическим больным, в том числе больным с ГИСО.

Одним из критериев, используемых при поиске новых перспективных соединений с противоопухолевой активностью, является их способность индуцировать гибель опухолевых клеток с резистентностью к уже известным химиопрепаратам различных групп. Вследствие существовавшей длительное время ошибочной, на наш взгляд, точки зрения о низкой эффективности химиопрепаратов в лечении больных с ГИСО в настоящее время в арсенале исследователей не имеется клеточных линий ГИСО, обладающих фенотипическими свойствами множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).

Цель исследования — получение клона опухолевых клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей, обладающего устойчивостью к химиопрепаратам различного механизма действия, и оценка его чувствительности к некоторым химиопрепаратам разных групп.

Материалы и методы. В качестве объекта исследования была выбрана клеточная линия ГИСО Т-1, чувствительная к действию таргетного препарата иматиниба [10]. Для получения клона клеток ГИСО с признаками МЛУ опухолевые клетки культивировали с химиопрепаратом паклитакселом в течение 8 мес. Начальная доза химиопрепарата в культуре клеток составляла 0,4 нмоль, конечная — 24 нмоль. Клетки культивировали в стандартных условиях (37^оС, 5% СО₂) в культуральной среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, пенициллина и стрептомицина (все реагенты — «ПанЭКО», Россия), а также 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США). Каждые 2 мес проводили сравнительную оценку чувствительности клеток ГИСО и их клона к химиопрепаратам различных групп: доксорубицину, винбластину, паклитакселу, иматинибу (Sigma-Aldriсh, США), этопозиду, гидроксимочевине (Calbiochem, США) и цисплатину. С этой целью опухолевые клетки засевали в лунки плоскодонного 96-луночного культурального планшета (Сorning, США) и культивировали в трех повторностях в течение 48–72 ч при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Цитотоксичность вышеуказанных препаратов оценивали колориметрически с помощью реагента CellTiter 96^® AQueous MTS Reagent Powder (Promega, США) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 492 нм. Оценку пролиферативной способности клеток ГИСО в присутствии паклитаксела проводили методом измерения клеточного индекса в режиме реального времени с помощью клеточного анализатора iCELLigence RTCA (ACEA Biosciences, США) согласно протоколу фирмы-производителя.

Уровень экспрессии белков, являющихся маркерами повреждений ДНК, апоптоза и химиорезистентности, оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител.

Статистический анализ результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.

Результаты и обсуждение. Спустя 8 мес культивирования клеток ГИСО Т-1 в присутствии постепенно возрастающих концентраций паклитаксела (29-й пассаж) в них появились признаки резистентности к данному химиопрепарату — полученный клон опухолевых клеток ГИСО был обозначен как Т-1-29R.

О наличии химиорезистентности клеток T-1-29R свидетельствовали результаты оценки их пролиферативной активности в режиме реального времени в присутствии паклитаксела. Например, было обнаружено, что пролиферативные способности «материнского» и «дочернего» клонов клеток в отсутствие химиопрепарата (контроль) не отличались друг от друга (рис. 1, а). При культивировании клеток T-1-29R в присутствии паклитаксела в дозах 1 и 10 нмоль (рис. 1, б, в соответственно) скорость их пролиферации значительно превышала аналогичный показатель «материнского» клона ГИСО Т-1. Культивирование «материнских» и «дочерних» клеток ГИСО в присутствии высоких доз паклитаксела (100 нмоль) было губительным для обоих типов опухолевых клеток (рис. 1, г).

Рис. 1. Оценка пролиферативной способности клеток ГИСО Т-1 и Т-1-29R без присутствия препарата паклитаксела (а — контроль) и при различных его концентрациях: б — 1 нмоль; в — 10 нмоль; г — 100 нмоль. Кривые роста опухолевых клеток in vitro получены на приборе iCELLigence (США)

Результаты фотоколориметрического MTT-теста также показали более высокую жизнеспособность клеток Т-1-29R по сравнению с «материнскими» опухолевыми клетками ГИСО T-1 в присутствии данного химиопрепарата, что свидетельствовало в пользу имеющейся в клетках ГИСО T-1-29R устойчивости к паклитакселу (рис. 2).

Рис. 2. Цитотоксическая активность паклитаксела в отношении клеток ГИСО T-1 и Т-1-29R. Цитотоксичность определяли по результатам MTT-теста. Статистически значимая разница значений между исследуемыми клеточными линиями: * — p<0,01; ** — p<0,001

Помимо резистентности к паклитакселу в клетках ГИСО T-1-29R была отмечена устойчивость к действию ингибиторов топоизомеразы II типа, например доксорубицина (рис. 3).

Рис. 3. Цитотоксическая активность доксорубицина в отношении клеток ГИСО T-1 и Т-1-29R. Цитотоксичность определяли по результатам MTT-теста. * — статистически значимая разница значений между исследуемыми клеточными линиями; p<0,001

На основании проведенных исследований были определены эффективные концентрации химиопрепаратов, вызывающие 50% ингибирование выживаемости (IC₅₀) опухолевых клеток T-1 и T-1-29R. Сравнительные значения IC₅₀ химиопрепаратов (см. таблицу) свидетельствуют о том, что клон клеток ГИСО T-1-29R обладает перекрестной резистентностью к ингибиторам топоизомеразы II типа, а также к некоторым препаратам, влияющим на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (таксанам).

Цитотоксические свойства химиопрепаратов в отношении клеток гастроинтестинальной стромальной опухоли

Учитывая тот факт, что основным механизмом гибели опухолевых клеток под действием вышеуказанных препаратов является апоптоз, было проведено сравнительное изучение их способности индуцировать гибель «материнских» (T-1) и «дочерних» (T-1-29R) клеток ГИСО по механизму апоптоза. Установлено, что инкубация «материнских» клеток ГИСО Т-1 с паклитакселом приводит к значительному и дозозависимому повышению уровней экспрессии расщепленных форм каспазы-3 и поли-АДФ(рибоза)-полимеразы (PARP), являющихся общепризнанными маркерами апоптоза (рис. 4, а). Ожидаемо не выявлено повышения уровня экспрессии данных белков в клетках ГИСО T-1-29R, инкубированных с паклитакселом (рис. 4, б).

Рис. 4. Паклитаксел (PTX) индуцирует апоптоз клеток ГИСО Т-1 (а), но не Т-1-29R (б). Маркеры апоптоза — расщепленные формы PARP и каспазы-3 (cl.Casp-3), маркеры М-фазы — повышение уровня экспрессии pH2AX и pPLK-1. Концентрации паклитаксела указаны в нмоль. В качестве контроля использовали уровень экспрессии актина

Аналогичным образом инкубация клеток ГИСО Т-1 (но не T-1-29R!) с ингибиторами топоизомеразы II типа приводила к дозозависимому повышению уровней экспрессии вышеуказанных маркеров апоптоза (рис. 5, а, б соответственно). Примечательно, что уровень экспрессии гистона 2А, фосфорилированного по остаткам серина в положении 139 (Ser139) (pН2АХ), который является общепризнанным маркером двунитевых разрывов ДНК, значительно повышался в клетках ГИСО Т-1 после воздействия вышеназванных химиопрепаратов (см. рис. 5, а). В то же время отмечено лишь минимальное повышение уровня экспреccии pН2АХ в клетках Т-1-29R после их инкубации с этопозидом (см. рис. 5, б). Эффект доксорубицина также был менее выраженным по сравнению с «материнскими» клетками ГИСО Т-1.

Рис. 5. Доксорубицин (Dox) и этопозид (Eto) индуцируют апоптоз преимущественно клеток ГИСО Т-1 (а), но не Т-1-29R (б). Маркеры апо­птоза — расщепленные формы PARP и каспазы-3 (cl.Casp-3), маркер двунитевых разрывов ДНК — повышение уровня экспрессии рH2AX (Ser139). Концентрации этопозида указаны в мкмоль, доксорубицина — в мкг/мл

Снижение уровней экспрессии маркеров апоптоза на фоне снижения уровня повреждений ДНК (двунитевых разрывов) в клетках Т-1-29R после воздействия на них ингибиторов топоизомеразы II типа могло являться следствием ряда факторов, например активации репаративных процессов ДНК после генотоксического воздействия химиопрепаратов, усиления элиминации химиопрепаратов из опухолевых клеток и уменьшения тем самым времени их воздействия на ДНК и др. Учитывая выбранный нами временной интервал для оценки уровня экспрессии pН2АХ в опухолевых клетках, первое предположение следует признать маловероятным. В пользу усиления элиминации химиопрепаратов из опухолевых клеток Т-1-29R свидетельствует значительное повышение в них уровня экспрессии Р-гликопротеина (MDR-1), ответственного за элиминацию цитостатиков из клеток и обусловливающего тем самым развитие МЛУ (рис. 6). В то же время не было отмечено изменений в уровне экспрессии некоторых других белков-транспортеров, обусловливающих развитие МЛУ, например ABCG2, уровень экспрессии которых был изначально высоким.

Рис. 6. Динамика уровней экспрессии белков химиорезистентности (MDR-1, MRP-1 и ABCG2) в клетках ГИСО Т-1 при их культивировании в присутствии паклитаксела: 1 — 2 мес, 2 — 5 мес, 3 — 8 мес культивирования

Заключение. Результатом проведенных исследований явилось получение клона клеток опухолевой линии ГИСО Т-1, обладающего устойчивостью к действию химиопрепаратов различных групп, а именно влияющих на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (паклитаксела), а также ингибиторов топоизомеразы II типа (доксорубицина и этопозида). Полученный клон клеток ГИСО с признаками множественной лекарственной устойчивости может быть использован при проведении скрининга наиболее эффективных в отношении ГИСО химиопрепаратов и вновь синтезированных соединений. Результаты исследования свидетельствуют о высокой чувствительности клеток ГИСО к действию ингибиторов топоизомеразы II типа и таксанов, что подтверждает необходимость пересмотра существующей точки зрения об их химиорезистентности.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант №14-15-00342).

Конфликт интересов у авторов отсутствует.