Метаболический имиджинг в исследовании онкологических процессов (обзор)

Для поддержания гомеостаза клеткам необходима энергия. Все процессы жизнедеятельности клетки, такие как создание градиентов концентрации, движение цитоскелета, репарация ДНК, транскрипция, трансляция и везикулярный транспорт, являются энергозависимыми. Известно, что энергетический обмен нормальных клеток существенно отличается от метаболизма клеток при тех или иных заболеваниях. Поэтому метаболический статус может служить индикатором диагностики, а также визуализации ответа на лечение патологических процессов. В связи с широкой распространенностью онкологических заболеваний оценка метаболического фенотипа опухолевых клеток особенно актуальна.

Развитие технологий оптической визуализации открыло возможность неинвазивного анализа метаболических кофакторов НАДН и ФАД в живых опухолевых клетках с высоким пространственным разрешением (до нескольких сот нанометров) без применения дополнительных красителей и без существенного влияния на биохимическое и физиологическое состояние клеток. Понятие «метаболический имиджинг» охватывает ряд современных флюоресцентных методов, позволяющих визуализировать НАДН и ФАД по интенсивности и/или времени жизни их флюоресценции.

В представленном обзоре охарактеризованы особенности энергетического метаболизма опухолей, описаны два ключевых подхода к оценке метаболического статуса — анализ отношения интенсивностей флюоресценции кофакторов (редокс-отношение) и времени жизни их флюоресценции. Приведены многочисленные примеры использования метаболического имиджинга в исследовании онкологических процессов на культурах клеток in vitro, опухолях животных и человека in vivo, а также биопсийных образцах опухолей пациентов.

Кофакторы НАДН и ФАД и их роль в энергетическом метаболизме клетки

Важнейшие пути энергетического метаболизма клетки, такие как гликолиз и окислительное фосфорилирование, связаны с процессами клеточного дыхания и синтезом АТФ. В роли доноров и акцепторов электронов в реакциях образования АТФ выступают кофакторы НАДН и ФАД, которые присутствуют в клетке в окисленной (НАД⁺, ФАД) или восстановленной формах (НАДН, ФАДН₂) [1–7].

В процессе гликолиза молекула глюкозы распадается на две молекулы пирувата, при этом две молекулы НАД⁺ восстанавливаются до двух молекул НАДН и образуются две молекулы АТФ в реакциях субстратного фосфорилирования [8, 9]:

С₆H₁₂О₆+2АДФ+2H₃PO₄+2НАД⁺=2C₃H₄O₃+2НАДН₂+2АТФ+2Н₂О.

Затем молекула пирувата может быть транспортирована в митохондрии, где она преобразуется в ацетил-коэнзим А в результате реакций дегидрирования и декарбоксилирования. Эти реакции протекают при помощи мультиферментного пируватдегидрогеназного комплекса, состоящего из трех ферментов: пируватдекарбоксилазы, дигидролипоилтрансацетилазы и дигидролипоилдегидрогеназы (LiрDH), а также пяти коферментов: тиаминдифосфата, липоевой кислоты, ФАД, НАД⁺ и коэнзима А. Впоследствии ацетил-коэнзим А вступает в цикл Кребса. Многочисленные дегидрогеназные комплексы в митохондриях играют важную роль в регулировании соотношения НАД⁺/НАДН и пула НАДН, который служит донором электронов и протонов для дыхательной цепи митоходрий [10–13].

Окислительное фосфорилирование является самым эффективным способом производства АТФ, НАДН — первичным донором, а ФАД — первичным акцептором электронов и протонов в дыхательной цепи митохондрий. В результате реакций гликолиза и цикла Кребса распад одной молекулы глюкозы может привести к образованию до 10 молекул НАДН. В процессе тканевого дыхания электроны и протоны от НАДН через комплексы дыхательной цепи транспортируются на кислород, при этом НАДН окисляется до НАД⁺, а протоны поступают из матрикса митохондрий в межмембранное пространство, что приводит к созданию протонного градиента (электрохимического потенциала). Энергия электрохимического потенциала используется для синтеза АТФ при обратном транспорте протонов в матрикс митохондрий с помощью АТФ-синтазы [14–16].

Обобщающая схема участия НАДН и ФАД в реакциях энергетического обмена в клетке выглядит следующим образом (рис. 1) [17].

Рис. 1. Схема участия метаболических кофакторов НАДН и ФАД в энергетическом обмене клетки [17]

Коферменты НАДН и ФАД способны флюоресцировать (рис. 2). Спектр возбуждения НАДН лежит в районе 300–400 нм с пиком на длине волны 355 нм, спектр эмиссии — в районе 400–600 нм с максимумом на λ=470 нм. У ФАД спектр возбуждения флюоресценции находится в диапазоне 350–500 нм с двумя максимумами — на 370 и 450 нм, спектр эмиссии — в диапазоне 500–600 нм с максимумом на λ=525 нм [18–21].

Рис. 2. Спектры поглощения и флюоресценции НАДН (а) и ФАД (б)

Фосфорилированная форма НАДН (НАДФН) имеет те же спектральные характеристики, что и нефосфорилированная НАДН, однако непосредственно в реакциях энергетического метаболизма не участвует. Основным источником НАДФН в клетке является пентозофосфатный путь (за исключением тканей, в которых активно идет синтез жирных кислот и стероидов, где вклад в производство НАДФН вносят и другие реакции). НАДФН принимает участие в биосинтезе жирных кислот, каротиноидов и стероидов. Также НАДФН имеет большое значение для антиоксидантных систем, в частности аскорбат-глутатионового цикла, и регулирует процессы передачи клеточных сигналов. Окисленная форма НАДФ⁺ поддерживает гомеостаз Ca²⁺ в клетке [4–7]. По данным ряда работ, концентрация НАДФН в клетке в десятки раз ниже, чем НАДН, а квантовый выход флюоресценции — в 1,25–2,5 раза меньше [21–23]. При анализе энергетического метаболизма вклад НАДФН, как правило, не учитывается.

НАДН находится в клетке в свободном и связанном с белками состоянии. Свободная форма локализуется в цитозоле и отличается от связанной с белком формы спектром эмиссии (сдвинут в более красную область на 20 нм). Основная флюоресценция в синем диапазоне испускается связанной формой НАДН, локализованной в митохондриях, тогда как вклад свободной формы относительно мал [18]. При этом квантовый выход НАДН увеличивается примерно в четыре раза в связанном с белками состоянии [20].

ФАД в клетке связан с ферментами митохондрий, называемыми флавопротеинами. Флюоресценция ФАД тушится большинством этих ферментов, в том числе сукцинатдегидрогеназой, которая является ключевым ферментом цикла трикарбоновых кислот и вторым комплексом дыхательной цепи митохондрий. Около 50% флюоресценции ФАД испускается LipDH-содержащими ферментативными комплексами, 25% — электронным переносчиком флавопротеином, который служит посредником, принимая электроны и протоны от жирных кислот в процессе β-окисления и транспортируя их к пулу убихинона. Хотя флавопротеины не участвуют непосредственно в метаболизме глюкозы, они могут тушить флюоресценцию ФАД при изменении окислительно-восстановительного статуса клетки [10, 11, 24, 25]. Последние 25% флюоресценции ФАД испускаются дитионитом натрия и не связаны с метаболизмом [10]. Отношение связанной формы ФАД к ФАДН₂ увеличивается по мере роста скорости протекания реакций цикла Кребса и уменьшается по мере снижения скорости окисления НАДН в электронно-транспортной цепи митохондрий [26].

Понимание роли НАДН и ФАД в метаболических реакциях клетки имеет большое значение для правильной интерпретации данных, полученных на основе флюоресцентного анализа. Если НАДН локализован в основном в митохондриях и участвует преимущественно в энергетическом обмене клетки, то ФАД содержится как в цитоплазме, так и в митохондриях и задействован помимо окислительного фосфорилирования в различных биохимических процессах (утилизация глутатиона, липогенез, перекисное окисление липидов, антиоксидантные реакции, синтез ацетил-коэнзима А, аскорбат-глутатионовый цикл, пентозофосфатный цикл), что значительно усложняет анализ данных [4, 13, 21, 27].

Метаболические особенности опухолевых клеток

Опухолевые клетки характеризуются активной неконтролируемой пролиферацией, в связи с чем их энергетический метаболизм имеет некоторые особенности по сравнению с нормальными тканями. В отличие от нормальных клеток, у которых основным способом синтеза АТФ является окислительное фосфорилирование, у большинства раковых клеток повышен уровень гликолиза.

Характерной особенностью многих солидных опухолей является гипоксия, которая возникает в результате дисбаланса между поступлением кислорода и его потреблением в ткани. Считается, что уровень кислорода в гипоксичных опухолях ниже, чем в соответствующих нормальных тканях, и в среднем составляет 1–2% и ниже. Основными факторами развития гипоксии в опухоли являются атипичная структура микрососудов, большие расстояния между кровеносными сосудами и опухолевыми клетками, что ограничивает поступление кислорода путем диффузии, а также пониженный транспорт кислорода кровью в связи с анемией. Многочисленные исследования последних двух десятилетий показали, что гипоксия играет существенную роль в опухолевой прогрессии и является неблагоприятным фактором прогноза лечения [28–30]. Гипоксия индуцирует множество сложных сигнальных путей, включая HIF, PI3K/AKT/mTOR, MARK, NF-kB, вовлеченных в регуляцию пролиферации, апоптоза, воспаления, миграции, выживания и метаболизма. Среди них наибольшая роль в регуляции метаболизма принадлежит HIF1 и mTOR [31–33]. Транскрипционный фактор HIF1 является главным регулятором метаболизма глюкозы в условиях гипоксии. Он может способствовать деградации митохондрий через BNIP3-зависимую аутофагию, а также блокировать биосинтез митохондрий, ингибируя активность фактора транскрипции MYC. Путь mTOR принимает участие в запуске реакций гликолиза, биосинтеза липидов, аминокислот, нуклеотидов и белков. В результате в условиях пониженной оксигенации опухолевые клетки не способны к запуску реакций окислительного фосфорилирования, что вынуждает их переходить на гликолиз [28, 34–36].

Опухолевые клетки в отличие от нормальных используют гликолиз даже при нормальных условиях оксигенации. Данный эффект был открыт в 1920-х гг. немецким физиологом Отто Варбургом и получил название аэробного гликолиза, или эффекта Варбурга [37–39]. Варбург считал, что преобладание гликолиза в присутствии кислорода обусловлено необратимыми нарушениями функций митохондрий. Как было обнаружено позже, в действительности лишь некоторые опухолевые линии имеют митохондриальные дисфункции, такие как пониженная экспрессия белков-переносчиков и ферментов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях, укороченный цикл трикарбоновых кислот, сниженное количество митохондрий, нарушение структуры комплексов дыхательной цепи, повышенное количество ингибиторов митохондриальной АТФ-синтазы и высокая чувствительность мДНК к окислительному стрессу. Показано, что при ингибировании реакций гликолиза многие опухолевые клетки восстанавливают работу митохондрий и переходят на окислительное фосфорилирование [40–44].

Переход опухолевых клеток на гликолитический тип метаболизма вызван рядом причин. Во-первых, в основе этого лежит высокая потребность опухолевых клеток в синтезе макромолекул для активного роста. Именно в результате гликолиза образуются мономеры, необходимые для синтеза нуклеиновых кислот, белков и липидов. Во-вторых, при гликолизе понижено образование свободных радикалов, что снижает уровень генотоксических повреждений в клетке и способствует уходу от апоптоза [8, 26, 41, 45, 46]. В-третьих, продуктом гликолиза является лактат, который транспортируется в межклеточное пространство. Известно, что кислая среда способствует опухолевой инвазии и метастазированию. Кроме того, высокая концентрация АТФ неблагоприятна для опухолевых клеток, поскольку подавляет гликолиз, ингибируя фосфофруктокиназу-1 и пируваткиназу [40].

На сегодняшний день установлено, что энергетический метаболизм опухолевых клеток представляет собой баланс между гликолизом и окислительным фосфорилированием, а теория «чистого гликолиза» в опухоли опровергнута. В опытах со снижением уровня кислорода показано, что ни одна опухолевая клетка не может существовать только посредством гликолиза. Ряд глиом, гепатом и клеточные линии рака молочной железы используют реакции окислительного фосфорилирования в качестве основного источника АТФ (хотя их метаболический фенотип меняется в условиях гипоксии). Считается, что максимальный вклад гликолиза в производство АТФ в опухолевых клетках составляет не более 50–60%, а в некоторых случаях уровень окислительного фосфорилирования в опухолевых клетках даже выше, чем в окружающих стромальных клетках [9, 41, 42, 47]. Кроме того, некоторые опухолевые клетки способны обратимо переключаться между гликолизом и окислительным фосфорилированием в зависимости от наличия глюкозы в среде [9, 42]. Сами опухоли метаболически гетерогенны, и соотношение выработки АТФ путем гликолиза и окислительного фосфорилирования может варьировать в широких пределах между различными клетками одного опухолевого узла [41, 48].

Таким образом, метаболическая активность опухолевых клеток представляет собой сложный процесс, который помогает адаптироваться раковым клеткам к различным условиям окружающей среды, а также к их изменениям [42, 49–51].

Редокс-отношение как показатель метаболического статуса

Принцип и методы регистрации редокс-отношения. Так как НАДН и ФАД — единственные переносчики электронов, которые способны к флюо­ресценции, соотношение интенсивностей их флюо­ресценции может служить параметром для оценки метаболического статуса клетки и ткани. Отношение окисленных элект­ронных переносчиков к восстановленным называется редокс-отношением (redox ratio). Данный подход был предложен В. Chance и его коллегами [26, 52]. В литературе встречаются различные варианты расчета редокс-отношения:

ФАД/(НАДН+ФАД) [53–56];

ФАД/НАДН [22, 57–60];

НАДН/ФАД [61–63].

Выбор формулы подсчета редокс-отношения часто зависит от соотношения интенсивности флюоресценции кофакторов, вида объекта исследования и метода регистрации [63, 64].

Поскольку основная масса НАДН образуется при гликолизе, а ФАД — при окислительном фосфорилировании, низкое редокс-отношение указывает на высокую метаболическую активность клетки и преобладание гликолитического пути над окислительным фосфорилированием. Помимо увеличения гликолиза в пролиферирующих опухолевых клетках активно протекают реакции цикла Кребса, промежуточные продукты которого могут быть выведены из цикла для синтеза различных соединений. Увеличение гликолиза и/или цикла Кребса по сравнению с окислительным фосфорилированием приводит к аккумуляции НАДН. Если интенсивность флюоресценции НАДН увеличена, значит клетка имеет большой метаболический потенциал для производства АТФ с помощью реакций окислительного фосфорилирования. Увеличение концентрации НАДН является характерной особенностью опухолевых клеток [65, 66].

Снижение интенсивности флюоресценции НАДН и увеличение ФАД (высокое редокс-отношение) свидетельствует о высокой потребности в АТФ и преобладании окислительного фосфорилирования. Для нормальной клетки в стандартных условиях с оптимальным содержанием питательных веществ и кислорода увеличение потребности в АТФ приводит к росту редокс-отношения. Это связано с окислением НАДН до НАД⁺ в процессе окислительного фосфорилирования. В условиях гипоксии при недостатке кислорода, который служит конечным акцептором электронов в дыхательной цепи митохондрий, протекание реакций окислительного фосфорилирования становится невозможным, при этом увеличивается концентрация НАДН. Чтобы удовлетворить потребность в АТФ, клетка переходит на анаэробный гликолиз, в результате которого НАД⁺ восстанавливается до НАДН с образованием пирувата и АТФ. Отсутствие окисления НАДН через электронно-транспортную цепь и увеличение концентрации НАДН в результате гликолиза приводит к росту интенсивности флюоресценции НАДН в клетке при гипоксии [26, 52, 67].

Для регистрации флюоресценции НАДН и ФАД используются методы флюоресцентного имиджинга с одно- и двухфотонным возбуждением [26, 56].

В однофотонном режиме возбуждение НАДН осуществляется на длине волны 350 нм с диапазоном приема 450–470 нм. Флюоресценцию ФАД возбуждают, как правило, при λ=450 нм и регистрируют в диапазоне 500–550 нм [18, 20, 26, 52]. Исследования с применением однофотонного режима ограничены в основном моделями in vitro из-за сильного рассеивания света в толстых образцах ткани [26].

Исследование метаболического статуса с использованием двухфотонной флюоресцентной микроскопии имеет ряд преимуществ по сравнению с однофотонным режимом. При двухфотонном возбуждении молекула флюорофора поглощает два фотона, обладающих низкой энергией, в течение одного квантового события. В результате возбуждать флюоресценцию НАДН и ФАД можно в ИК-области (НАДН — в районе 740 нм и ФАД — в районе 900 нм), а не в УФ- и ближнем УФ-диапазоне [18, 26]. Это особенно важно для исследований in vivo, так как рассеяние света в ткани уменьшается при возбуждении флюоресценции в ИК-области. Кроме того, поскольку одновременное поглощение двух фотонов носит вероятностный характер, эффективное двухфотонное возбуждение происходит только в фокальной плоскости, где плотность фотонов самая высокая. Такое прицельное возбуждение флюо­ресценции снижает возможность повреждения и фотообесцвечивания образца [26].

Pедокс-отношение в опухолевых клетках и тканях. На сегодняшний день показатель редокс-отношения используется для оценки метаболического статуса опухолевых клеток in vitro, ткани ex vivo и опухолей in vivo. J.H. Ostrander с соавт. [62] показали на различных клеточных культурах опухоли молочной железы человека, что опухолевые клетки имеют увеличенное редокс-отношение НАДН/ФАД по сравнению с нормальными эпителиальными клетками. Это связано с повышенным потреблением глюкозы и аэробным гликолизом в опухолевых клетках. К тому же субпопуляция клеток рака молочной железы, экспрессирующая рецепторы эстрогена, имела сниженное редокс-отношение. Схожие результаты продемонстрированы и на клеточной линии рака мочевого пузыря человека: редокс-отношение НАДН/ФАД было увеличено по сравнению с нормой [68].

На клеточных линиях рака молочной железы MDA-MB-231, MCF7, SKBr3 и BT474 выявлено снижение редокс-отношения НАДН/ФАД после добавления ингибитора окислительного фосфорилирования FCCP, что свидетельствовало о метаболических изменениях в клетках [69]. Обнаружена прямая корреляция между редокс-отношением ФАД/(НАДН+ФАД) и потреблением кислорода на различных культурах клеток рака молочной железы человека in vitro [70]. Также на культуре клеток рака молочной железы показана взаимосвязь между редокс-отношением НАДН/ФАД и экспрессией гена HER2. Известно, что HER2 играет важную роль в патогенезе и прогрессировании определенных агрессивных типов рака молочной железы. Установлено, что самое высокое редокс-отношение НАДН/ФАД характерно для клеток с гиперэкспрессией гена HER2 [71, 72].

J.M. Levitt и соавт. на 3D-модели эпителия изучали метаболическую активность нормальных и предраковых ВПЧ-иммортализованных клеток. Было обнаружено, что предраковые клетки имеют сниженное редокс-отношение ФАД/(НАДН+ФАД) по сравнению с нормальными клетками вследствие преобладания в них гликолиза [53, 73]. При исследовании изменения редокс-отношения ФАД/НАДН в клетках рака шейки матки человека в условиях кокультивирования с фибробластами [57] показано, что редокс-отношение в опухолевых клетках снижается при кокультивировании с фибробластами. Это снижение вызвано переходом на более гликолитический метаболизм. На клетках рака ротовой полости (SCC25 и SCC61) продемонстрировано in vitro снижение редокс-отношения НАДН/ФАД после лечения клеток Цисплатином [74]. Схожие результаты получены на клеточной линии рака мочевого пузыря (Т24). После воздействия N-4-(гидроксифенил)-ретинамидом авторы наблюдали увеличение редокс-отношения ФАД/(НАДН+ФАД) [75].

In vivo в работе по изучению метаболических изменений эпителия слизистой оболочки защечного мешка хомяка показано снижение редокс-отношения ФАД/НАДН при канцерогенезе [60]. На той же модели в работах [76–78] обнаружено резкое снижение редокс-отношения ФАД/(НАДН+ФАД) в опухолевой ткани по сравнению с контролем, что свидетельствовало о ее повышенной метаболической активности. В работах [60, 78] выявлена разница в редокс-отношении ФАД/(НАДН+ФАД) между метастазирующей клеточной линией рака молочной железы MDA-MB231 и неметастазирующей — MCF7 in vivo. Редокс-отношение у клеток MDA-MB231 было выше, что авторы связывают с более агрессивным фенотипом метастазирующей линии.

Ряд работ посвящен изучению метаболических изменений при противоопухолевой терапии in vivo. Так, A.T. Shah с соавт. наблюдали статистически значимое снижение редокс-отношения НАДН/ФАД в клетках плоскоклеточного рака гортани (FaDu) in vivo на второй день химиотерапии Цисплатином [79]. Z. Zhangc соавт. описали увеличение редокс-отношения ФАД/(НАДН+ФАД) в клетках глиомы крысы in vivo после фотодинамической терапии [56]. В работе [80] ими показано резкое увеличение редокс-отношения ФАД/(НАДН+ФАД) на клетках глиомы крысы ex vivo после фотодинамической терапии, что связывают с запуском окислительного стресса и нарушением структуры митохондрий.

Данный метод (использование редокс-отношения для оценки метаболического статуса опухолевых клеток) находит применение и в клинических исследованиях. R. dе А. Natal с соавт. анализировали биопсийный материал от пациентов с опухолью молочной железы [54]. Выявлено, что редокс-отношение ФАД/НАДН снижено в образцах от пациентов с десмопластической реакцией, что указывает на высокую метаболическую активность данных клеток и неблагоприятный прогноз. А.Т. Shah и М.С. Skala продемонстрировали возможность применения редокс-отношения НАДН/ФАД для анализа биопсийного материала от пациентов со злокачественными новообразованиями гортани, языка, эпидермиса и аденокарциномы слюнной железы ex vivo. Полученные ими данные указывают на то, что метаболический статус опухолевых клеток может служить критерием подбора адекватного лечения [81]. На образцах эпителия шейки матки показано, что образцы с дисплазией имеют сниженное редокс-отношение ФАД/(НАДН+ФАД) по сравнению с нормальным эпителием [82]. Схожие результаты получены на опухоли головного мозга крыс ex vivo: редокс-отношение ФАД/(НАДН+ФАД) в опухоли было значительно ниже, чем в нормальной ткани, что свидетельствует о преобладании гликолиза в опухолевых клетках [83]. Предполагается, что разница в значениях редокс-отношения может быть использована для визуализации границы опухоли во время операции [83].

Хотя нами не найдено клинических примеров регистрации редокс-отношения, анализ интенсивности флюоресценции метаболических кофакторов имеет большой потенциал для применения в клинике. Ряд работ демонстрируют результаты регистрации флюоресценции НАДН в опухолях пациентов. Показано, что увеличенная интенсивность флюоресценции НАДН свидетельствует о диспластических и онкологических изменениях ткани эпителия шейки матки человека in vivo [84]. В опухолях головы и шеи человека in vivo также была выявлена повышенная интенсивность флюоресценции НАДН по сравнению с нормальным эпителием [85]. Сходные результаты получены и при исследовании базально-клеточной карциномы человека in vivo [3]. Все авторы связывают высокую интенсивность флюоресценции НАДН с активными метаболическими процессами в опухолевых клетках.

Время жизни флюоресценции НАДН и ФАД в оценке энергетического метаболизма

Флюоресцентный имиджинг с временным разрешением. Исследование метаболизма клеток методом время-разрешенного флюоресцентного имиджинга (fluorescence life time imaging, FLIM) основано на том, что время жизни флюоресценции кофакторов НАДН и ФАД существенно отличается в зависимости от того, в свободном состоянии они находятся или связаны с белками. Несмотря на большое количество работ, посвященных исследованию метаболического статуса клетки на основе регистрации редокс-отношения, при таком подходе спектральное разделение свободных и связанных форм кофакторов невозможно, так как их спектры эмиссии отличаются на 10–20 нм при ширине пика в 150 нм [18, 86].

Флюоресцентный имиджинг с временным разрешением дает возможность исследовать метаболические кофакторы в живых клетках путем измерения среднего времени, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии, а не фактической интенсивности флюоресценции. Время жизни флюоресценции в разумных пределах не зависит от концентрации флюорофора, тогда как микроокружение является наиболее значимым фактором. На время жизни могут оказывать влияние pH, температура, концентрация ионов и кислорода, связь с другими молекулами или конформация хромофора [87, 88].

Технология FLIM для разделения свободного и связанного НАДН была предложена в 1992 г. J.R. Lakowiсz и соавт. [89]. Ими впервые было измерено время жизни НАДН в растворе в свободном состоянии — 0,4 нс и в комплексе с малатдегидрогеназой — 1 нс. Недавно T.S. Blacker с соавт. была разработана методика разделения флюоресценции НАДН и НАДФН в живых клетках и тканях с использованием FLIM [21].

В настоящее время основным подходом к регистрации времени жизни флюоресценции является метод время-коррелированного счета фотонов (time-correlated single photon counting, TCSPC). Кинетика затухания флюоресценции измеряется после возбуждения образца коротко-импульсным лазерным излучением (фемто- или пикосекундным). Профиль затухания строится из множественного повтора одного фотонного события. Время прибытия первого фотона на детектор после импульса возбуждения измеряется и сохраняется в памяти, так что гистограмма времен и прихода фотонов представляет собой кривую интенсивности флюоресценции в зависимости от времени [90–92] (рис. 3). Поскольку данные измерения требуют временного разрешения порядка нескольких пикосекунд, FLIM-системы оснащены высокоскоростными и сверхчувствительными детекторами, способными улавливать единичные фотоны [93, 94].

Рис. 3. Принцип работы метода время-коррелированного счета фотонов [1, 93]

Характерное время жизни флюоресценции кофакторов в клетке составляет порядка 0,3 и 2,0 нс для НАДН, 0,3 и 2,7 нс — для ФАД. Более короткое время жизни соответствует связанной форме ФАД и свободной — НАДН, более длинное — свободному ФАД и связанному НАДН.

Хотя в случае ФАД различное время жизни обусловлено не связью с белком, а конформацией молекулы кофактора внутри белкового комплекса, применение понятий «свободный» и «связанный» к ФАД скорее традиционно. Известно, что ФАД существует в двух конформациях: закрытой, когда ароматические кольца изоаллоксазина и аденина находятся на предельно близком расстоянии друг от друга, и открытой, при которой два ароматических кольца предельно удалены друг от друга. При этом в открытой конформации эмиссия осуществляется за счет ароматической группы изоаллоксазина и время жизни составляет около 2–3 нс, тогда как время жизни флюоресценции закрытой конформации гораздо короче (100–300 нс), что обусловлено тушением флюоресценции изоаллоксазина аденином [21, 57, 86].

Свободная форма НАДН локализуется в цитозоле и отвечает за процессы гликолиза, тогда как связанная — в митохондриях и участвует в реакциях окислительного фосфорилирования. Время жизни связанного НАДН зависит от того, с каким белком связан кофактор, и варьирует в пределах от 1,7 до 2,9 нс [26, 60, 95].

Существует ряд работ, посвященных анализу изменения времени жизни кофакторов при онкологических процессах, однако основным показателем при изучении энергетического метаболизма методом FLIM является относительный процентный вклад свободной и связанной форм кофакторов [22, 26, 57, 95].

На сегодняшний день флюоресцентный имиджинг с временным разрешением реализован в виде микроскопии на основе двухфотонного возбуждения, спектроскопии и макроимиджинга. Существуют установки для двухфотонной микроскопии и FLIM, одобренные для применения в клинике, например системы MPTflex и DermaInspect производства компании JenLab (Германия) [3, 96, 97].

Изменения времени жизни флюоресценции при онкологических процессах. Ввиду неинвазивности, высокой чувствительности и отсутствия необходимости введения экзогенных красителей метод FLIM стал незаменимым инструментом для визуализации опухолевого метаболизма.

В многочисленных работах с помощью FLIM демонстрируется более гликолитический метаболизм опухолевых клеток по сравнению с нормальными. Например, на культурах клеток рака головы и шеи SCC25 и SCC61 выявлен пониженный процентный вклад связанных форм НАДН и ФАД по сравнению с нормальными эпителиальными клетками [74]. В той же работе продемонстрировано увеличение вклада связанного НАДН и ФАД после лечения химиопрепаратами Цисплатин, Цетуксимаб и BGT226. При исследовании времени жизни НАДН в кератиноцитах и опухолевых клетках полости рта человека in vitro обнаружено, что опухолевые клетки имеют большее время жизни флюоресценции НАДН, а соотношение свободной/связанной форм НАДН в них снижено по сравнению с контролем [98]. Также установлено, что время жизни флюоресценции НАДН в клетках рака молочной железы человека значительно ниже по сравнению с клетками нормального эпителия [86].

V.K. Ramanujan с соавт. измерили характерные времена жизни флюоресценции НАДН для человеческих эмбриональных клеток почек (HEK 293T), гепатоцитов и клеточной линии рака шейки матки человека (HeLa) и показали, что вклад свободной формы НАДН наиболее высок в опухолевых клетках, что свидетельствует о смещении метаболизма клеток к гликолитическому [99]. На культуре клеток базофильной лейкемии крыс проанализировано время жизни флюоресценции НАДН при нормальных условиях и при изменении концентрации глюкозы [100]. Выявлено, что наименьшее значение среднего времени жизни НАДН соотносилось с пониженным содержанием глюкозы и клеточным голоданием. С увеличением концентрации глюкозы в среде среднее время жизни НАДН увеличивалось. На клеточной культуре рака молочной железы человека установлено, что в процессе пролиферации клеток время жизни флюоресценции связанной формы НАДН снижается, а процентный вклад свободной формы увеличивается. Такие же изменения, но с различной динамикой, наблюдали при добавлении к клеткам цианистого калия и при снижении концентрации питательных веществ в культуральной среде [101].

M.S. Islam с соавт. показали изменение времени жизни флюоресценции ФАД в опухолевых клетках рака шейки матки человека при изменении рН. Время жизни флюоресценции оставалось неизменным при изменении внеклеточного рН, однако при защелачивании внутриклеточного рН оно снижалось [102].

В работе [103] изучено распределение флюоресценции флавинов, их характерное время жизни и вклад в метаболические процессы на опухолевых клетках глиобластомы человека U-87 MG in vitro. Выявлено, что в опухолевых клетках флавины локализуются в основном в митохондриях, а среднее время жизни ФАД составляет 1,4 нс. Данный факт может служить критерием для ранней диагностики онкологических процессов.

In vivo было показано снижение процентных вкладов связанных форм НАДН и ФАД в процессе канцерогенеза клеток эпителия защечного мешка хомяка в результате активации гликолиза [60, 95]. На той же модели индуцированного рака полости рта Н. Fatakdawala с соавт. показали пониженное время жизни флюоресценции НАДН в опухоли по сравнению с нормой [104]. На клетках плоскоклеточного рака гортани (FaDu) in vivo обнаружено снижение времени жизни флюоресценции НАДН и ФАД в результате химиотерапии Цисплатином и Цетуксимабом [79].

В последнее время особый интерес вызывает применение метода FLIM в клинической онкологии. Анализ кофакторов в опухолях человека проводится в основном в биопсийных образцах. На образцах опухоли пациентов с раком гортани, языка, эпидермиса и аденокарциномы слюнной железы ex vivo было про­анализировано время жизни НАДН и ФАД [81]. Данное исследование показало, что онкологические процессы имеют свои характерные метаболические особенности и отличаются от нормы более гликолитическим типом метаболизма. В работе [54] на образцах опухоли молочной железы человека ex vivo выявлено, что опухолевые клетки с десмопластической реакцией имели более короткое время жизни флюоресценции НАДН и ФАД по сравнению с опухолевыми клетками, у которых данная реакция не наблюдалась. В образцах опухоли яичника человека ex vivo было обнаружено увеличенное время жизни флюоресценции ФАД в сравнении с нормальным эпидермисом [105].

При помощи FLIM-макроимиджинга на биопсийных образцах установлено, что клетки базалиомы имеют более короткое время жизни флюоресценции НАДН по сравнению с нормой [106]. Также на образцах опухолей кишечника, желудка, мочевого пузыря, печени, поджелудочной железы продемонстрировано, что среднее время жизни флюоресценции НАДН значительно длиннее по сравнению с его значением на границе опухоли и нормальной ткани того же образца [107].

В связи с небольшой глубиной зондирования (~300 мкм), работы с использованием FLIM на опухолях человека in vivo ограничены исследованиями новообразований кожи и головного мозга (интра­операционно). Так, было продемонстрировано, что в клетках меланомы время жизни НАДН существенно короче, чем в клетках базалиомы, и это может служить критерием для дифференциальной диагностики [97]. Первая работа на опухоли мозга in vivo показала применимость FLIM для оценки границ резекции в процессе нейрохирурхического вмешательства [96]. У пациентов с опухолями головы и шеиметодом FLIM-спектроскопии обнаружено, что клетки опухолевой ткани имеют более короткое время жизни флюоресценции НАДН по сравнению с окружающей нормальной тканью [108–110], это говорит об их более гликолитическом статусе.

Заключение

Данные о метаболическом статусе клетки важны для оценки ее функционального состояния. Все вышеперечисленные примеры демонстрируют потенциал неинвазивных оптических методов для визуализации метаболического статуса опухолевых клеток по флюо­ресценции эндогенных флюорофоров НАДН и ФАД. Описанные подходы на основе анализа интенсивности флюоресценции (редокс-отношение) и времени жизни флюоресценции (FLIM) открывают возможности ранней диагностики онкологических заболеваний и мониторинга ответа на терапевтическое воздействие в режиме реального времени. Ожидается, что метаболический имиджинг улучшит понимание динамических биохимических процессов в клетках, а также станет основой для ранней диагностики не только онкологических процессов, но и других патологий, связанных с метаболическими изменениями (сахарный диабет, нейродегенеративные заболевания и др.).

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №14-15-00646).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.