Платформа для изучения молекулярных и клеточных механизмов болезни Паркинсона на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

Е.В. Новосадова, Е.Д. Некрасов, И.В. Честков, А.В. Сурдина, Е.М. Васина, А.Н. Богомазова, Е.С. Мануилова, Е.Л. Арсеньева, В.В. Симонова, Е.В. Коновалова, Е.Ю. Федотова, Н.Ю. Абрамычева, Л.Г. Хаспеков, И.А. Гривенников, В.З. Тарантул, С.Л. Киселев, С.Н. Иллариошкин

Ключевые слова: клеточное репрограммирование; индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; платформа для ИПСК; фибробласты; дофаминергические нейроны; болезнь Паркинсона.

Цель исследования — получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от пациентов с различными формами болезни Паркинсона (БП) и создание на этой основе платформы для изучения патогенеза болезни на молекулярном и клеточном уровнях с разработкой протокола дифференцировки данных стволовых клеток.

Материалы и методы. ИПСК получали из репрограммированных с помощью лентивирусных векторов и на основе вируса Сендай культивированных фибробластов кожи пяти пациентов с различными формами БП (PARK8, PARK2, GBA-ассоциированная и спорадическая формы). Полученные клоны ИПСК культивировали до стадии эмбриоидных тел и после спонтанной дифференцировки окрашивали иммуноцитохимически. Анализ экспрессии генов и нейрональных маркеров в этих линиях ИПСК проводили с помощью полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией.

Результаты. Полученные клоны ИПСК имели нормальный кариотип 46 XY, специфично окрашивались антителами на маркеры плюропатентности Oct4, Nanog, TRA-1-81 и SSEA-4 и экспрессировали маркерные гены, отвечающие за поддержание плюрипотентного состояния. В культурах, дифференцированных ИПСК, выявлены клетки, положительно окрашенные антителами на маркеры трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы). Разработан эффективный протокол дифференцировки ИПСК в дофаминергические нейроны, что подтверждено экспрессией маркера этих нейронов — фермента тирозингидроксилазы.

Заключение. На основе детально охарактеризованных ИПСК от пациентов с различными формами БП и разработанного клеточного протокола создана платформа для изучения патогенеза БП на молекулярном и клеточном уровнях. Получение клеточных культур, обогащенных дофаминергическими нейронами, открывает перспективу их использования для персонализированной клеточной заместительной терапии БП.

Литература

Kasten M., Chade A., Tanner C.M. Epidemiology of Parkinson’s disease. In: Handbook of clinical neurology. Part I. Elsevier; 2007; p. 129−151, https://doi.org/10.1016/s0072-9752(07)83006-5.
Wirdefeldt K., Adami H.-O., Cole P., Trichopoulos D., Mandel J. Epidemiology and etiology of Parkinson’s disease: a review of the evidence. Eur J Epidemiol 2011; 26(S1): 1–58, https://doi.org/10.1007/s10654-011-9581-6.
Иллариошкин С.Н. Паркинсонизм с ранним началом. Нервные болезни 2006; 3: 14–20.
Thomas B., Beal M.F. Parkinson’s disease. Hum Mol Genet 2007; 16: R183–R194, https://doi.org/10.1093/hmg/ddm159.
Иллариошкин С.Н. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование. М: МИА; 2004.
Иллариошкин С.Н. Современные представления об этиологии болезни Паркинсона. Неврологический журнал 2015; 20(4): 4–13.
Lin M.K., Farrer M.J. Genetics and genomics of Parkinson’s disease. Genome Med 2014; 6(6): 48, https://doi.org/10.1186/gm566.
Schiesling C., Kieper N., Seidel K., Krüger R. Review: familial Parkinson’s disease — genetics, clinical phenotype and neuropathology in relation to the common sporadic form of the disease. Neuropathol Appl Neurobiol 2008; 34(3): 255–271, https://doi.org/10.1111/j.1365-2990.2008.00952.x.
Chai C., Lim K.L. Genetic insights into sporadic Parkinson’s disease pathogenesis. Curr Genomics 2013; 14(8): 486–501, https://doi.org/10.2174/1389202914666131210195808.
Healy D.G., Falchi M., O’Sullivan S.S., Bonifati V., Durr A., Bressman S., Brice A., Aasly J., Zabetian C.P., Goldwurm S., Ferreira J.J., Tolosa E., Kay D.M., Klein C., Williams D.R., Marras C., Lang A.E., Wszolek Z.K., Berciano J., Schapira A.H., Lynch T., Bhatia K.P., Gasser T., Lees A.J., Wood N.W.; International LRRK2 Consortium. Phenotype, genotype, and worldwide genetic penetrance of LRRK2-associated Parkinson’s disease: a case-control study. Lancet Neurol 2008; 7(7): 583–590, https://doi.org/10.1016/S1474-4422(08)70117-0.
Kilarski L.L., Pearson J.P., Newsway V., Majounie E., Knipe M.D., Misbahuddin A., Chinnery P.F., Burn D.J., Clarke C.E., Marion M.H., Lewthwaite A.J., Nicholl D.J., Wood N.W., Morrison K.E., Williams-Gray C.H., Evans J.R., Sawcer S.J., Barker R.A., Wickremaratchi M.M., Ben-Shlomo Y., Williams N.M., Morris H.R. Systematic review and UK-based study of PARK2 (parkin), PINK1, PARK7 (DJ-1) and LRRK2 in early-onset Parkinson’s disease. Mov Disord 2012; 27(12): 1522–1529, https://doi.org/10. 1002/mds.25132.
Saiki S., Sato S., Hattori N. Molecular pathogenesis of Parkinson’s disease: update. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2012; 83(4): 430–436, https://doi.org/10.1136/jnnp-2011-301205.
Sulzer D., Surmeier D.J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson’s disease. Mov Disord 2013; 28(1): 41–50, https://doi.org/10.1002/mds.25095.
Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126(4): 663–676, https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.07.024.
Nakagawa M., Koyanagi M., Tanabe K., Takahashi K., Ichisaka T., Aoi T., Okita K., Mochiduki Y., Takizawa N., Yamanaka S. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol 2008; 26(1): 101–106, https://doi.org/10.1038/nbt1374.
Некрасов Е.Д., Лебедева О.С., Честков И.В., Сюсина М.А., Федотова Е.Ю., Лагарькова М.А., Киселев С.Л., Гривенников И.А., Иллариошкин С.Н. Получение и характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека из фибробластов кожи пациентов с нейродегенеративными заболеваниями. Гены и клетки 2011; 6(4): 82–88.
Lebedeva O.S., Lagar’kova M.A., Kiselev S.L., Mukhina I.V., Vedunova M.V., Usova O.V., Stavrovskaya A.V., Yamshchikova N.G., Fedotova E.Yu., Grivennikov I.A., Khaspekov L.G., Illarioshkin S.N. The morphofunctional properties of induced pluripotent stem cells derived from human skin fibroblasts and differentiated to dopaminergic neurons. Neurochemical Journal 2013; 7(3): 207–214, https://doi.org/10.1134/s1819712413030082.
Медведев С.П., Шевченко А.И., Сухих Г.Т., Закиян С.М. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Новосибирск: Изд-во СО РАН; 2014.
Bogomazova A.N., Vassina E.M., Kiselev S.L., Lagarkova M.A., Lebedeva O.S., Nekrasov E.D., Panova A.V., Philonenko E.S., Khomyakova E.A., Tskhovrebova L.V., Chestkov I.V., Shutova M.V. Genetic cell reprogramming: a new technology for basic research and applied usage. Russian Journal of Genetics 2015; 51(4): 386–396, https://doi.org/10.1134/s102279541504002x.
Byers B., Lee H., Reijo Pera R. Modeling Parkinson’s disease using induced pluripotent stem cells. Curr Neurol Neurosci Rep 2012; 12(3): 237–242, https://doi.org/10.1007/s11910-012-0270-y.
Yoshikawa T., Samata B., Ogura A., Miyamoto S., Takahashi J. Systemic administration of valproic acid and zonisamide promotes differentiation of induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic neurons. Front Cell Neurosci 2013; 7, https://doi.org/10.3389/fncel.2013.00011.
Narytnyk A., Verdon B., Loughney A., Sweeney M., Clewes O., Taggart M.J., Sieber-Blum M. Differentiation of human epidermal neural crest stem cells (hEPI-NCSC) into virtually homogenous populations of dopaminergic neurons. Stem Cell Rev 2014; 10(2): 316–326, https://doi.org/10.1007/s12015-013-9493-9.
Nekrasov E.D., Vigont V.A., Klyushnikov S.A., Lebedeva O.S., Vassina E.M., Bogomazova A.N., Chestkov I.V., Semashko T.A., Kiseleva E., Suldina L.A., Bobrovsky P.A., Zimina O.A., Ryazantseva M.A., Skopin A.Y., Illarioshkin S.N., Kaznacheyeva E.V., Lagarkova M.A., Kiselev S.L. Manifestation of Huntington’s disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Mol Neurodegener 2016; 11: 27, https://doi.org/10.1186/s13024-016-0092-5.
Huangfu D., Maehr R., Guo W., Eijkelenboom A., Snitow M., Chen A.E., Melton D.A. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol 2008; 26(7): 795–797, https://doi.org/10.1038/nbt1418.
Shi Y., Do J.T., Desponts C., Hahm H.S., Schöler H.R., Ding S. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2008; 2(6): 525–528, https://doi.org/10.1016/j.stem.2008.05.011.
Kriks S., Shim J.W., Piao J., Ganat Y.M., Wakeman D.R., Xie Z., Carrillo-Reid L., Auyeung G., Antonacci C., Buch A., Yang L., Beal M.F., Surmeier D.J., Kordower J.H., Tabar V., Studer L. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature 2011; 480(7378): 547–551, https://doi.org/10.1038/nature10648.
Chambers S.M., Fasano C.A., Papapetrou E.P., Tomishima M., Sadelain M., Studer L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol 2009; 27(3): 275–280, https://doi.org/10.1038/nbt.1529.
Yu P.B., Hong C.C., Sachidanandan C., Babitt J.L., Deng D.Y., Hoyng S.A., Lin H.Y., Bloch K.D., Peterson R.T. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol 2008; 4(1): 33–41, https://doi.org/10.1038/nchembio.2007.54.
Gilbert S.F. Developmental biology. Sunderland: Sinauer Associates; 2003.
Wurst W., Bally-Cuif L. Neural plate patterning: upstream and downstream of the isthmic organizer. Nat Rev Neurosci 2001; 2(2): 99–108, https://doi.org/10.1038/35053516.
Li X.-J., Hu B.-Y., Jones S.A., Zhang Y.-S., LaVaute T., Du Z.-W., Zhang S.-C. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells 2008; 26(4): 886–893, https://doi.org/10.1634/stemcells.2007-0620.
Hochbaum D., Barila G., Ribeiro-Neto F., Altschuler D.L. Radixin assembles cAMP effectors Epac and PKA into a functional cAMP compartment: role in cAMP-dependent cell proliferation. J Biol Chem 2010; 286(1): 859–866, https://doi.org/10.1074/jbc.m110.163816.
Sarnat H.B. Clinical neuropathology practice guide 5-2013: markers of neuronal maturation. Clin Neuropathol 2013; 32(9): 340–369, https://doi.org/10.5414/np300638.
Cooper O., Seo H., Andrabi S., Guardia-Laguarta C., Graziotto J., Sundberg M., McLean J.R., Carrillo-Reid L., Xie Z., Osborn T., Hargus G., Deleidi M., Lawson T., Bogetofte H., Perez-Torres E., Clark L., Moskowitz C., Mazzulli J., Chen L., Volpicelli-Daley L., Romero N., Jiang H., Uitti R.J., Huang Z., Opala G., Scarffe L.A., Dawson V.L., Klein C., Feng J., Ross O.A., Trojanowski J.Q., Lee V.M., Marder K., Surmeier D.J., Wszolek Z.K., Przedborski S., Krainc D., Dawson T.M., Isacson O. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med 2012; 4(141): 141ra90, https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3003985.
Howden S.E., Thomson J.A. Gene targeting of human pluripotent stem cells by homologous recombination. Methods Mol Biol 2014; 1114: 37–55, https://doi.org/10.1007/978-1-62703-761-7_4.
Mukherjee S., Thrasher A.J. Gene correction of induced pluripotent stem cells derived from a murine model of X-linked chronic granulomatous disorder. Methods Mol Biol 2014; 1114: 427–440, https://doi.org/10.1007/978-1-62703-761-7_28.
Rao M., Gottesfeld J.M. Introduction to thematic minireview series: development of human therapeutics based on induced pluripotent stem cell (iPSC) technology. J Biol Chem 2013; 289(8): 4553–4554, https://doi.org/10.1074/jbc.r113.543652.