Активация мультипотентных стромальных клеток костного мозга лазерным и КВЧ-излучением и их сочетанным воздействием

В конце 60-х гг. прошлого столетия в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи была открыта уникальная категория стромальных клеток-предшественников [1], которые при последующих исследованиях были охарактеризованы как стволовые клетки стромы костного мозга или мультипотентные стромальные клетки (МСК) [2]. Стромальный компонент костного мозга представлен различными типами клеток. Главным клеточным типом стромы костного мозга являются ретикулярные клетки, а также эндотелиальные клетки, адвентиция крупных сосудов и т.д. При эксплантации костного мозга в монослойные культуры именно ретикулярные клетки, прикрепляясь ко дну культурального флакона, приобретают морфологию фибробластов и формируют колонии-клоны, состоящие из нескольких тысяч фибробластов (рис. 1). Полученные доказательства клональной природы колоний [1] позволили определить содержание этих клеток в органах кроветворения и иммунитета, изучить изменение их численности при различных патологических состояниях организма или воздействиях на организм (травма, облучение и т.д.).

Рис. 1. Микрофотографии колонии мультипотентных стромальных клеток костного мозга: а — колония-клон, сформированная мультипотентными стромальными клетками; ×10; б — структура колонии мультипотентных стромальных клеток, ×50

Интерес к изучению свойств и потенциальных возможностей МСК обусловлен широким терапевтическим потенциалом этих клеток, открывающим большие перспективы их использования в различных областях регенеративной медицины [3, 4]. В настоящее время они успешно используются в травматологии и ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, стоматологии с целью восстановления костной ткани, гиалинового хряща суставов, сухожильно-связочного аппарата и других тканей [5, 6]. МСК и их потомки обладают огромным пролиферативным потенциалом [7, 8].

В работе [9] показано, что на первых пассажах нарушений хромосомного набора в препаратах МСК не происходит, в то время как на более высоких пассажах выявляются определенные нарушения — клетки с измененным кариотипом, полиплоидия и т. д. Поэтому возможности эффективного наращивания МСК, выделенных из донорского костного мозга, и последующая трансплантация этих клеток в организм на ранних пассажах вызывают чрезвычайный интерес. В связи с этим разработка методов активации пролиферативного и дифференцировочного потенциалов клеток для ускорения формирования и регенерации тканей является одной из ключевых задач тканевой инженерии. С этой целью традиционно используются различные факторы роста и цитокины, ускоряющие пролиферацию и метаболизм клеток. В последнее время развиваются и иные подходы, заключающиеся в воздействии на ткани и клеточные культуры различными физическими факторами, способными стимулировать функциональную активность клеток. Для этого, в частности, используют лазерное излучение видимого и ближнего ИК-диапазонов [10–12], КВЧ-излучение [13–17], процессы лазероиндуцированной гидродинамики (ЛИГ), генерирующие специфические акустические импульсы (АИ) [18, 19].

Интерес к изучению влияния процессов ЛИГ на биологические объекты связан с появлением в последнее время новых технологий лечения различных заболеваний, таких как остеомиелит [19, 20], остеохондроз [21–23] и др., основанных на формировании каналов в биоткани при продвижении торца оптического волокна, разогретого лазерным излучением. При этом в био­ткани индуцируются различные гидродинамические процессы, в частности происходит генерация специфических АИ в диапазоне 0,1–2,0 кГц [19, 24, 25]. Есть основания полагать, что лечебное действие связано с этими АИ и обусловлено в основном низкочастотными механическими колебаниями ткани (эффекты механобиологии) [26].

Известно, что действие КВЧ-излучения на различные организмы проявляется лишь на определенных частотах, считающихся активными, при этом результирующие эффекты могут обладать кумулятивностью [17]. В медицинской практике обычно используется КВЧ-излучение с длиной волны 7,1 мм.

Сочетанные воздействия физических факторов на клетки и организмы могут приводить к синергетическим или антагонистическим эффектам [27, 28]. Это зависит от параметров воздействия, их последовательности, промежутков между ними и от состояния объекта. До сих пор исследования комбинированных воздействий на стволовые клетки не проводились, несмотря на интерес к подобным работам. В настоящей работе предпринята попытка исследования комбинации акустических импульсов и КВЧ-излучения. Оба этих фактора можно отнести к категории низкоинтенсивных нетепловых воздействий.

Очевидно, что эксплантация костного мозга в культуру ткани нарушает микроокружение МСК. Перенос этих клеток из своей естественной ниши, поддерживающей их стволовой статус, в новую нишу, например в тканеинженерную конструкцию, может привести к изменению их статуса. Как следствие, может иметь место «ослабление» МСК, нежелательное изменение их пролиферативного и дифференцировочного потенциалов. Данный факт обусловливает актуальность исследований по воздействию различных физических факторов как на «нормальные», так и на «ослабленные» МСК.

Цель исследования — изучение влияния лазерного излучения низкой и умеренной интенсивности, акустических импульсов, генерируемых лазерным излучением, КВЧ-излучения и их комбинаций на изменение пролиферативной активности мультипотентных стромальных клеток in vitro в состояниях, условно характеризующихся как «норма» и «ослабленное», а также оценка способности этих факторов увеличивать содержание МСК в костном мозге при воздействии в условиях in vivo и in vitro.

Материалы и методы. Объектами исследования являлись МСК костного мозга человека, кролика, морской свинки и крысы.

Этические принципы. Все экспериментальные операции выполнялись под наркозом с использованием разрешенных в ветеринарии препаратов (Золетил и Рометар) и соблюдением всех правил асептики и антисептики. В ходе манипуляций руководствовались правилами гуманного обращения с животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Работа была одобрена Этическим комитетом Научно-исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Животных выводили из эксперимента передозировкой наркоза.

Получение штаммов МСК костного мозга человека. Костный мозг человека получали из клиники ЦНИИ стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МЗ РФ при информированном согласии пациентов. Полученный трепанат костного мозга человека переносили во флакон со свежей питательной средой, шприцем готовили одноклеточную суспензию, фильтровали через четырехслойный капроновый фильтр и подсчитывали общее количество клеток. Клетки эксплантировали в пластиковые флаконы (Nunc 80 см², Nunc, Дания), содержащие 15 мл полной культуральной среды, которая состояла из 80% питательной среды альфа-МЕМ (Sigma-Aldrich, США), 20% сыворотки эмбрионов коров (СЭК) (HyClone, США), и антибиотики из расчета (3,5–4,0)·10⁴ клеток на 1 см² площади дна флакона. Культивирование выполняли при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂. На 12–14-е сутки, когда во флаконах формировались дискретные колонии стромальных фибробластов, проводили 1-й пассаж, используя стандартные методы [7]. По достижении клетками конфлюэнтного слоя проводили следующий пассаж.

Получение штаммов костного мозга кроликов и морской свинки. Под местным обезболиванием 0,5% раствором новокаина, в условиях асептики, удаляли крыло тазовой кости кролика и помещали в чашку Петри. В боксе крыло расщепляли скальпелем, костный мозг выскребали и переносили во флакон с питательной средой. Морских свинок и крыс усыпляли эфиром, с соблюдением асептики выделяли бедренные кости, обрезали концы и шприцем вымывали костный мозг в питательную среду. Дальнейшие дейст­вия были аналогичны процедурам при получении штаммов МСК костного мозга человека.

Получение штаммов МСК в измененном «ослабленном» состоянии. Колонии фибробластов, сформированные к 12–14-му дню после эксплантации костного мозга человека или кролика, подвергали пассированию в оптимальных условиях культивирования — в среде, состоящей из 80% среды альфа-МЕМ, 20% СЭК и антибиотиков. При следующем пассаже снятые клетки разделяли на две части и эксплантировали в культуральные флаконы с питательной средой различного состава. В первом случае культуральная среда состояла из 80% среды альфа-МЕМ и 20% СЭК и обозначалась нами как «норма», во втором — из 97% среды альфа-МЕМ и 3% СЭК и обозначалась как «ослабленная». В дальнейшем эти культуры вели параллельно до IV–VI пассажей. Такое значительное уменьшение СЭК приводило к стабильному снижению (примерно в 3 раза) пролиферации клеток. Перед облучением МСК низкоинтенсивными полями культуры обрабатывали 0,25% трипсином и снимали с «пластика». Суспензии МСК объемом 3 мл, содержащие 3,0·10⁵ клеток, разливали в пластиковые пробирки диаметром 15 мм. Воздействие проводили либо на суспензию клеток, либо на осажденные клетки.

Исследование стимуляции пролиферации МСК после воздействия. МСК из каждой пробирки с облученными клетками и из пробирок с контролем эксплантировали в три культуральных флакона площадью 25 см² по 1·10⁵ клеток в каждый, потом выращивали в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 5 дней. По завершении культивирования клетки снимали с «пластика» и подсчитывали число выросших клеток.

Исследование содержания МСК в костном мозге крыс после воздействия. Животных выводили из эксперимента на 3-й день, выделяли большеберцовые кости, подвергшиеся облучению, и контралатеральные необлученные голени, которые использовали в качестве контроля. В каждой серии опытов готовили общую для 3 крыс суспензию клеток костного мозга. Аналогичным образом готовили суспензию клеток костного мозга контралатеральных голеней тех же крыс. В культуральные флаконы площадью 25 см², содержащие 5 мл полной культуральной среды с антибиотиками, эксплантировали по 5·10⁵ костномозговых клеток в каждый и помещали в инкубатор. По завершении культивирования, на 12–14-й день, флаконы дважды промывали физиологическим раствором, фиксировали 70° этанолом в течение 30–45 мин, окрашивали по Гимзе и под бинокулярной лупой подсчитывали число выросших колоний.

Фрагментарное тепловое лазерное воздей­ст­вие на клетки костного мозга in vivo. Иссле­дования проводили на самцах крыс породы Wistar массой 100–120 г. Под эфирным наркозом стерильно обнажали большеберцовую кость. Через кость в 10 точках ее верхней трети проводили локальное облучение костного мозга. Точки воздействия располагали на расстоянии 1 мм друг от друга по двум параллельным линиям, расположенным вдоль оси верхней части кости. Облучение кости осуществляли контактно посредством оптического волокна диаметром 0,6 мм. Для этого использовали волоконный лазер с длиной волны 1,56 мкм отечественного производства («ИРЭ-Полюс», Россия). Длительность лазерного импульса при воздействии на каждую точку составляла 0,5 с. Таким образом осуществляли фрагментарное воздействие — вокруг областей лазерного нагрева оставалась интактная ткань.

Животные были разделены на 4 группы в соответствии с 4 дозами облучения — по 3 крысы на каждую дозу. Мощность лазерного излучения составляла 0,1; 0,2; 0,6 и 1,2 Вт. Всего было проведено 5 серий экспериментов. Измеряемым параметром являлась колониеобразующая активность МСК, т.е. отношение числа колоний, выросших из суспензий облученного и необлученного костного мозга, к числу эксплантированных клеток.

Температурное поле, формируемое в костном мозге, измеряли с помощью термопар в условиях, моделирующих эксперименты in vivo.

Факторы низкоинтенсивного физического дейст­вия на МСК костного мозга

1. Излучение He-Ne лазера. Использовали серийный аппарат ЛГН-213-1 (Россия) с длиной волны излучения 0,63 мкм и мощностью 0,8 мВт. Пробирку с суспензией МСК объемом 3 мл располагали в расходящемся лазерном пучке с плотностью мощности 0,4 мВт/см² и экспонировали в течение 60 с. Мощность лазерного излучения контролировали с помощью измерителя мощности Field Master с измерительной головкой LM-2VIS (Coherent, США).

2. Акустические импульсы процессов лазероиндуцированной гидродинамики генерировали с помощью специально разработанного аппарата АЛИГ. Первоначально в блок памяти аппарата записывали акустический сигнал, генерируемый при продвижении оптического волокна с лазерным излучением 0,97 мкм вдоль костномозгового канала берцовой кости теленка. Мощность излучения составляла 5 Вт, а на торец волокна было предварительно нанесено поглощающее покрытие [19]. Пробирку с суспензией или осажденными МСК устанавливали в наполненную водой кювету аппарата. Записанный в блок памяти аппарата и усиленный сигнал возбуждал в воде АИ с помощью пьезокерамического преобразователя. Экспонирование МСК составляло 50 с.

3. КВЧ-излучение. Использовали аппарат «Аква­стин» («ИРЭ-Полюс», Россия) с длиной волны 7,1 мм и плотностью мощности на выходах излучателя, рупорной и стержневой антенн 5; 0,5 и 3 мВт/см² соответственно. Пробирки с осажденными МСК устанавливали на излучающем торце головки аппарата, время воздействия составляло 30 с.

При исследовании влияния КВЧ-излучения на эффективность колониеобразования МСК in vitro костномозговую суспензию готовили обычным способом. Стержневую антенну КВЧ-излучателя устанавливали над суспензией, которая перемешивалась с помощью магнитной мешалки. Время воздействия составляло 15, 45 и 90 мин. Через 15 мин КВЧ-воздействие прекращали, отбирали необходимое для эксплантации число клеток и продолжали воздействие. Таким же образом поступали через 45 и 90 мин. В пластиковые флаконы с полной культуральной средой площадью 25 см² засевали по 5·10⁵ клеток и культивировали в обычном режиме 12–14 дней.

Влияние КВЧ-излучения на пролиферативную активность МСК костного мозга морской свинки изучали, воздействуя на клетки с помощью рупорной антенны. В каждую лунку 6-луночного планшета засевали 5·10⁴ клеток штаммов МСК костного мозга и перед началом облучения давали им адгезироваться к пластику в течение 60 мин. Антенну КВЧ-аппарата подводили либо сверху, облучая МСК через миллиметровый слой культуральной среды, либо снизу, приставляя ее непосредственно к пластику. В первом случае КВЧ-излучение значительно ослаблялось из-за поглощения культуральной средой. Во втором случае излучение практически без потерь достигало МСК, поскольку в пластике поглощение КВЧ-излучения незначительно. Диаметр рупорной антенны полностью соответствовал диаметру лунки с клетками. Облучение проводили в течение 0,5; 1; 3 и 9 мин. Контролем служили лунки с таким же числом эксплантированных клеток, не подвергавшиеся облучению. На 4-й день после облучения культивирование прекращали. Выросшие клетки обычным методом снимали с пластика и подсчитывали их численность.

Сочетанные воздействия. Эксперименты проводили в разных последовательностях: АИ + КВЧ, КВЧ + АИ. В первом случае воздействовали АИ аппарата АЛИГ в течение 50 с и затем через интервал 60 с — КВЧ-излучением в течение 30 с. Во втором случае воздействия проводили в обратном порядке.

Статистическая обработка данных. Сущест­вование различий между отдельными выборками проверяли с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни (ANOVA). По результатам измерений вычислялись средние значения и стандартные отклонения. В некоторых случаях для наглядности на гистограммах представляли относительные величины, когда средние результаты по облученным клеткам нормировали на средние значения для соответствующих контрольных экспериментов с учетом их ошибок.

Результаты и обсуждение. Динамика роста температуры в костном мозге, представленная для двух различных мощностей лазера (рис. 2, а), демонстрирует, что в течение лазерного импульса происходит монотонный нагрев ткани и постепенное ее охлаждение до исходной температуры после окончания лазерного импульса. При увеличении лазерной мощности от 0,2 до 0,6 Вт максимальный нагрев костномозговой ткани монотонно возрастает соответственно от 17 до 42°С.

Рис. 2. Влияние кратковременного теплового лазерного воздействия на эффективность колониеобразования мультипотентных стромальных клеток в костном мозге голени крыс: а — динамика изменения температуры костного мозга под действием лазерного импульса длительностью 0,5 с при различных мощностях лазерного излучения; б — относительное изменение числа колоний мультипотентных стромальных клеток в зависимости от мощности лазерного излучения при фрагментарном тепловом воздействии. Значение 1 на оси ординат соответствует контролю; статистически значимое отличие от контроля: * — р<0,2; ** — р<0,01

Зависимость относительного изменения числа колоний МСК в костном мозге голени крыс от мощности лазерного излучения при фрагментарном тепловом лазерном воздействии представлена на рис. 2, б.

В образцах, обработанных лазерным излучением с мощностью 0,1 Вт, число выросших in vitro колоний не изменяется. При мощности 0,2 Вт наблюдается почти двукратное увеличение числа колоний (р<0,01), что свидетельствует о существенном повышении числа колониеобразующих клеток по сравнению с контрольными образцами. Этот эффект уменьшается с повышением мощности до 0,6 Вт, а при мощности 1,2 Вт отмечается небольшое подавление колониеобразования (р<0,2).

Рост числа МСК в костном мозге при кратковременном фрагментарном лазерном нагреве до ~60°С (при мощности 0,6 Вт и времени нагрева ~2 с), скорее всего, вызван их стимуляцией, направленной на восстановление частично нарушенного гомеостаза. При облучении с мощностью 1 Вт в течение 5 с температура ткани увеличивается до ~100°С, увеличивается также и объем перегретой ткани. Столь значительный рост температуры и объема перегретой ткани, очевидно, вызывает существенно бóльшие повреждения костного мозга. В таких условиях клетки, оставшиеся интактными при локальном нагреве, уже не способны восстановить гомеостаз и число МСК уменьшается. В этом проявляется механизм гормезиса, имеющий достаточно универсальный характер, который, по нашему мнению, реализуется в условиях данного эксперимента.

Повышение эффективности колониеобразования МСК костного мозга отмечено также при воздействии КВЧ-излучения на суспензию костномозговых клеток крыс с помощью стержневой антенны (рис. 3). Облучение дозой 8 Дж/см² в течение 15 мин не вызывало стимуляции эффективности колониеобразования клеток, в течение 45 мин — приводило к выраженной стимуляции эффективности колониеобразования, превышающей контрольные значения на 85%, а в течение 90 мин — уже к ее значительному ингибированию.

Рис. 3. Численность колоний мультипотентных стромальных клеток во взвеси костного мозга крысы в зависимости от времени КВЧ-облучения; * — статистически значимое отличие от контроля, р<0,01

Результаты исследований по воздействию низкоинтенсивного лазерного излучения, КВЧ-излучения, а также АИ процессов ЛИГ на пролиферацию МСК костного мозга человека в состояниях «норма» и «ослабленное» (рис. 4, 5) показывают, что средние значения количества МСК после воздействия различных физических факторов практически для всех экспериментов выше контрольных. При этом значительные статистически значимые (p<0,01) отличия от контроля зарегистрированы при воздействии на «ослабленные» клетки с помощью АИ и КВЧ-излучения. Пролиферативная активность «ослабленных» МСК после воздействия на них АИ в течение 60 с (см. рис. 4) и КВЧ-излучения в течение 10 с (см. рис. 5) возросла на 30%. Увеличение времени воздействия КВЧ-излучения до 30 с вызывало усиление пролиферативной активности МСК по сравнению с контролем до 40%, а увеличение времени до 60 с привело к нивелированию позитивного эффекта.

Рис. 4. Пролиферация «нормальных» и «ослабленных» мультипотентных стромальных клеток (МСК) человека после воздействия акустическими импульсами (АИ) или излучением He-Ne-лазера; * — статистически значимое отличие от контроля, р<0,01

Рис. 5. Пролиферация «нормальных» и «ослабленных» мультипотентных стромальных клеток (МСК) человека после КВЧ-облучения при различных временах воздействия; * — статистически значимое отличие от контроля, р<0,01

Результаты наших исследований показывают, что эффект воздействия различных низкоинтенсивных физических факторов (лазерного излучения низкой интенсивности, КВЧ-излучения, АИ процессов ЛИГ) существенно зависит от состояния самих клеток. Физические воздействия практически не влияют на МСК в состоянии «норма», но увеличивают пролиферативную активность клеток, находящихся в «ослабленном» состоянии.

Воздействия КВЧ-излучения и АИ, в том числе и сочетанные, на МСК кролика не привели к усилению пролиферативной активности клеток при уровне значимости p<0,05 (рис. 6). Более того, наблюдалась тенденция к торможению роста числа МСК при использовании этих физических факторов, за исключением сочетанного воздействия в последовательности КВЧ-излучение + АИ.

Рис. 6. Пролиферация мультипотентных стромальных клеток (МСК) кролика и человека после воздействия различных физических факторов: акустических импульсов (АИ) и КВЧ-излучения (КВЧ). По оси ординат показаны нормированные на контроль значения; * — статистически значимое отличие от контроля, р<0,01

Однако для МСК человека во всех случаях, когда использовались АИ, происходило статистически значимое (p<0,01) усиление на 80% пролиферативной активности клеток по отношению к контролю. Полученный результат, связанный с позитивным воздействием специфических АИ ЛИГ-процессов на МСК человека, является для нас ожидаемым. ЛИГ-процессы служат основным терапевтическим фактором при воздействии лазерного излучения умеренной мощности на биоткань. Мы полагаем, что именно АИ, сопровождающие ЛИГ-процессы, запускают регенерацию ткани по механизму механобиологии.

Исследования сочетанных воздействий АИ и КВЧ-излучения показали, что они не приводят к усилению пролиферативной активности МСК человека по сравнению с моновоздействием АИ (см. рис. 6). Более того, если в последовательности АИ + КВЧ-излучение сочетанное воздействие не приводит к значимому изменению скорости пролиферации МСК по сравнению с моновоздействием АИ, то в противоположной последовательности КВЧ-излучение + АИ такое воздействие существенно (на 20%) уменьшает скорость пролиферации. Последнее указывает на антагонистичность используемой дозы КВЧ-излучения и акустического сигнала.

КВЧ-облучение адгезированных клеток с помощью рупорной антенны излучателя показало, что их прирост практически не зависит от положения рупора антенны. Наибольший прирост клеток (с увеличением ~2,3 раза) был отмечен в лунках, облученных в течение 0,5 мин. Пролиферативная активность МСК при облучении 1 и 3 мин была ниже и превысила конт­рольные значения в 1,7 и 1,3 раза, при 9-минутном облучении отмечалось угнетение клеточного роста (рис. 7).

Рис. 7. Пролиферация мультипотентных стромальных клеток (МСК) костного мозга морской свинки после КВЧ-облучения при различных временах воздействия и разном положении рупора антенны излучателя; статистически значимое отличие от контроля: * — р<0,05, ** — р<0,01

Заключение. Использование методов физического воздействия (лазерного излучения низкой и умеренной интенсивности, акустических импульсов, генерируемых лазерным излучением, и КВЧ-излучения) в условиях in vitro и in vivo увеличивает содержание мультипотентных стромальных клеток в исходном костном мозге, а также усиливает их пролиферативную активность в процессе развития штаммов клеток in vitro. Применение этих методов в клинике позволит на более ранних пассажах получать необходимое для обратной трансплантации число клеток и тем самым избежать возникновения хромосомных аберраций в культурах клеток.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда: в части изучения увеличения содержания МСК в костном мозге (грант 16-15-00042), а также в части исследования стимуляции пролиферативной активности клеток (проект №14-25-00055) при воздействии физических факторов.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.