Оценка безопасности применения рекомбинантных аналогов спидроинов как биодеградируемых матриксов для регенеративной медицины
Цель исследования — изучить токсические параметры (хроническую токсичность, местно-раздражающее и сенсибилизирующее действие) медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS, предназначенных для применения в области регенеративной медицины в качестве имплантатов для замещения дефектов мягких и костных тканей, в лечении глубоких ожогов, а также для культивирования клеток in vitro при испытании лекарств.
Материалы и методы. Работа выполнена на аутбредных крысах линии Wistаr, кроликах породы шиншилла, морских свинках. Проведено изучение хронической токсичности, местно-раздражающего и сенсибилизирующего действия медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS (ГосНИИгенетика, Россия) на основе рекомбинантного спидроина при накожном нанесении и внутримышечном введении. При исследовании хронической токсичности регистрировали интегральные, гематологические, биохимические показатели. Местно-раздражающее действие изучалось в патоморфологических исследованиях места введения медицинских изделий. Для изучения сенсибилизации применяли методы максимального сенсибилизирующего воздействия и закрытых накожных аппликаций.
Результаты. Выявлено, что медицинские изделия Гидрогель RS и Микрогель RS являются безвредными средствами при использовании в течение 90 суток, не обладают раздражающим действием при накожном нанесении и внутримышечном введении, не имеют сенсибилизирующих свойств.
Заключение. Медицинские изделия Гидрогель RS и Микрогель RS могут быть рекомендованы для проведения клинических испытаний в качестве имплантатов для замещения дефектов мягких и костных тканей, при лечении глубоких ожогов, а также для культивирования клеток in vitro при испытании лекарств.
Полимерные материалы различной природы находят широкое применение в разных областях: от изготовления предметов бытового назначения до регенеративной медицины (восстановление утраченных тканей и органов организма) [1, 2]. Главная проблема при использовании их в области регенеративной терапии — отсутствие биологически активных материалов, обладающих одновременно всем набором необходимых свойств: биосовместимостью, управляемой биодеградируемостью, пористостью, управляемой прочностью и др.
Один из возможных путей решения этой проблемы — использование рекомбинантных аналогов белков каркасной нити паутины пауков-кругопрядов — спидроинов, которые кроме выдающихся физико-химических свойств (сочетание высокой прочности и эластичности, устойчивость к высоким и низким температурам, положительный заряд во всем диапазоне физиологических значений рН) обладают также высокой биосовместимостью, медленной биорезорбцией и позволяют направленно действовать на клетки, например включая в их структуру генно-инженерными методами различные биологически активные соединения, в том числе факторы адгезии и роста клеток, дифференцировочные факторы [3, 4]. Эти белки в водной среде способны образовывать различные надмолекулярные структуры — пленки, гидрогели, микрогели, губки с регулируемым размером пор (от нано- до макроразмерных), микрокапсулы и т.д. [5, 6].
Клонированный в ГосНИИгенетике рекомбинантный аналог спидроина 1 — белок 1F9 [7, 8], нарабатываемый путем микробиологического синтеза в клетках дрожжей Saccharomices cerevisiae, был использован для изготовления пористых матриксов [9], а также гидрогеля и микрогеля, получаемого в результате механического дробления гидрогеля [10], на основе которых были разработаны медицинские изделия Гидрогель RS и Микрогель RS.
Установлено, что на поверхности гидрогеля и микрогеля присутствуют как макропоры диаметром до 500 мкм, так и микропоры диаметром 2–20 мкм, соединенные отверстиями, а в элементах рельефа — как нано-, так и микроструктуры размером соответственно 100–500 нм и 0,5–15 мкм [11], что делает их привлекательными для использования в качестве адгезионных клеточных культур и способствует процессам васкуляризации и иннервации в зоне имплантации.
Нанесение гидрогеля и микрогеля на поверхность ожоговой раны у экспериментальных животных ускоряет заживление по сравнению с традиционными методами лечения. Еще больший эффект наблюдается при подкалывании образцов под поверхность раны [11]. Исследование на мышах с использованием экспериментальной модели полнослойной кожной раны, имитирующей наиболее тяжелые повреждения кожного покрова, показало, что введение суспензии микрогеля интрадермальными инъекциями вокруг раны обеспечивает восстановление собственных тканей в месте кожного поражения, а также стимулирует процессы нейрогенеза и ангиогенеза [12], т.е. инициирует процессы тканеообразования в месте локального повреждения.
Эти результаты свидетельствуют о том, что медицинские изделия Гидрогель RS и Микрогель RS на основе рекомбинантного спидроина являются материалами, потенциально пригодными для использования в области регенеративной медицины, и могут быть наиболее востребованы в лечении глубоких ожогов, в качестве имплантатов для замещения дефектов мягких и костных тканей, а также для культивирования клеток in vitro при испытании лекарств.
Цель исследования — изучение токсических параметров (хронической токсичности, местно-раздражающего и сенсибилизирующего действий) медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS.
Материалы и методы. Образцы гидрогеля получали из 3% раствора высокоочищенного рекомбинантного спидроина 1F9 [8], а микрогель — путем физического дробления гидрогеля. Для получения медицинских изделий гидрогель и микрогель помещали в шприцы по 1 и 2 мл, стерилизовали методом тиндализации (трехкратное повторение процессов нагревания до 90°С и инкубации при комнатной температуре в течение 20 ч) и упаковывали в блистеры.
Токсикологические исследования медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS (ГосНИИгенетика, Россия) проводили на животных в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-2009, чч. 1, 2, 10 и 11 и со Стандартными операционными процедурами исследователя, разработанными в ЦНИЛ НижГМА. Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам, данным в руководстве «Guide for care and use of laboratory animals (ILAR publication, 1996, National Academy Press)», национальном стандарте РФ — ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», в санитарно-эпидемиологических правилах СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденных главным государственным санитарным врачом Российской Федерации от 29 августа 2014 г. №51, зарегистрированных Министерством юстиции Российской Федерации от 31 октября 2014 года, регистрационный №34547, и согласованы с Этическим комитетом НижГМА.
Хроническая токсичность. Эксперименты проведены на 240 аутбредных крысах линии Wistаr (120 самок и 120 самцов) массой 195,5±0,5 г, разделенных на следующие группы:
а) контроль — физиологический раствор накожно (10 самок + 10 самцов);
б) контроль — физиологический раствор внутримышечно (10 самок + 10 самцов);
в) Гидрогель RS/Микрогель RS — 0,5 мл/кг накожно (10 самок + 10 самцов);
г) Гидрогель RS/Микрогель RS — 5 мл/кг накожно (10 самок + 10 самцов);
д) Гидрогель RS/Микрогель RS — 0,5 мл/кг внутримышечно (10 самок + 10 самцов);
е) Гидрогель RS/Микрогель RS — 5 мл/кг внутримышечно (10 самок + 10 самцов).
Изделия медицинского назначения Гидрогель RS и Микрогель RS вводили накожно и внутримышечно однократно. В связи с низкой скоростью резорбции материала изделий наблюдение за ежедневным его воздействием на организм было возможным в течение 90 дней. В период до 90 дней (не более 10% продолжительности жизни крыс) регистрировали изменения интегральных показателей, оценивали неблагоприятный эффект, который возникает после однократного введения исследуемой пробы медицинского изделия, обладающего очень незначительной резорбцией.
Общее состояние животных определяли по проявлениям дыхательной функции, двигательной активности, наличию конвульсий, рефлексов, проводили офтальмоскопию, оценивали пульс, слюноотделение, состояние шерстного покрова, болевую реакцию, мышечный тонус, состояние желудочно-кишечного тракта, кожных покровов. Выполняли взвешивание, учитывали потребление воды и корма.
Кроме интегральных показателей в исходном состоянии и 1 раз в месяц после введения исследуемых изделий регистрировали гематологические показатели (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина, СОЭ, лейкоцитарная формула), биохимические показатели и активность ферментов сыворотки крови крыс (общий белок, креатинин, мочевина, глюкоза, холестерин, общие липиды, билирубин общий, активность щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, аспартат- и аланинаминотрансферазы, кальций, калий, натрий), оценивали функциональное состояние системы выделения по анализу мочи.
Патоморфологическое исследование крыс, проводившееся через 90 дней после введения, включало некропсию, макроскопическое исследование, взвешивание органов с определением массовых коэффициентов, гистологическое исследование.
Местно-раздражающее действие. Патоморфологические исследования места введения препарата проводили на кроликах породы Шиншилла при однократном накожном нанесении (n=24) в двух группах для каждого изделия (n=12):
а) контроль — физиологический раствор накожно (3 самки + 3 самца);
б) Гидрогель RS/Микрогель RS — 5 мл/кг накожно (3 самки + 3 самца).
Для вычислений индекса раздражения использовали данные наблюдений, полученные через 24, 48, 72 ч. Индекс первичного раздражения определяли путем суммирования баллов первичного раздражения для каждого животного, вызванного исследуемым материалом, включая отеки и эритемы, в каждый интервал времени наблюдения и деления их на общее число наблюдений (на 6 — по 2 на каждый интервал времени). Для объективности исследований из балла первичного раздражения исследуемого материала вычитали балл первичного раздражения контрольной группы.
Сенсибилизирующее действие. Для исследования гиперчувствительности замедленного типа при использовании медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-10-2009 применяли метод максимального сенсибилизирующего воздействия (GPMT) и метод закрытых накожных аппликаций (Buehler) на морских свинках (n=30). Создавали по две группы на каждое изделие (n=15) [10]:
а) контроль — физиологический раствор (5 самцов);
б) Гидрогель RS/Микрогель RS (10 самцов).
Доза медицинского средства, вводимая внутрикожно в каждый исследуемый участок, составляла 0,1 мл. Для аппликаций пропитывали испытываемой пробой гигроскопичную марлевую подушечку (8 см2), которую прикладывали на выстриженные участки кожи и фиксировали окклюзионной повязкой вокруг тела животного. Через 24 ч снимали повязку и образцы и оценивали состояние опытных участков на наличие эритемы и отека в соответствии с классификацией Magnusson и Kligman.
Через 7 дней после внутрикожной индукционной фазы начинали накожные аппликации исследуемого материала на участки инъекций (на внутрилопаточную область каждого животного), используя для этого пропитанные кусочки марли площадью 8 см2. Накладывали окклюзионную повязку. Удаляли повязку через 48±2 ч.
Через 14 дней (±1 день) после завершения местной индукционной фазы провоцировали всех опытных и контрольных животных испытуемыми материалами. Для этого проводили аппликации исследуемого материала на интактные участки кожи бока каждого животного, накладывая гигроскопичную марлевую подушечку на 24 ч. Описывали и оценивали степень кожной реакции, включая эритему и отек (по Magnusson и Kligman), для каждого участка и в каждый интервал времени наблюдения.
Методы статистического анализа данных. Полученные результаты обрабатывали с помощью пакетов прикладных программ Statistica 5.5. Для сравнения выборок (n=20) при нормальном распределении совокупностей использовали параметрический t-критерий Стьюдента для парных выборок (для зависимых выборок) или непарных выборок (для независимых). В случае значительных отклонений распределения признака от нормального закона, а также при малых объемах выборки (n≤10) применяли непараметрические критерии: для двух зависимых выборок — критерий Вилкоксона, в случае двух независимых выборок — критерий Манна–Уитни, в случае сравнения более двух групп — критерий Крускалла–Уоллиса. Различия между группами считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение. Проведенные исследования на белых аутбредных крысах показали, что при однократном накожном применении и внутримышечном введении подострых доз 0,5 и 5,0 мл/кг медицинские изделия Гидрогель RS и Микрогель RS являются безвредными веществами. Не наблюдалось гибели животных, не выявлено изменений в их общем состоянии: по проявлениям дыхательной функции, двигательной активности, по наличию конвульсий, рефлексов, по данным офтальмоскопии, оценки пульса, слюноотделения, состояния шерстного покрова, болевой реакции, мышечного тонуса, состояния желудочно-кишечного тракта, кожных покровов оно оставалось в пределах исходных значений. Не обнаружено разницы в приросте массы тела у животных с введением исследуемых медицинских изделий и контрольных (табл. 1).
|
Таблица 1. Влияние медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS на массу тела в течение 90 сут при однократном накожном нанесении и однократном внутримышечном введении белым аутбредным крысам, г (M±SEM) |
Также не установлено различий в биохимических и морфологических параметрах крови и мочи, массовых коэффициентах органов при однократном накожном нанесении и однократном внутримышечном введении медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS в подострых дозах и у животных контрольной группы (табл. 2).
При изучении местно-раздражающего действия в процессе нанесения медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS на кожу кроликов раздражающего действия не выявлено. В период наблюдения признаков эритемы, отеков и других признаков раздражения не отмечалось.
В результате проведенных исследований на морских свинках выявлено, что медицинские изделия Гидрогель RS и Микрогель RS не имеют сенсибилизирующих свойств. В тесте максимального сенсибилизирующего воздействия после внутрикожной индукционной фазы на опытных участках не зафиксировано никакой кожной реакции, в том числе эритемы и отека, что соответствует 0 баллов по классификации Magnusson и Kligman. После провокации животных исследуемым материалом после завершения индукционной фазы исследования также не обнаружено никакой кожной реакции, в том числе эритемы и отека, что соответствует 0 баллов по классификации Magnusson и Kligman (табл. 3).
|
Таблица 3. Результаты теста по изучению максимального сенсибилизирующего воздействия медицинских изделий Гидрогель RS и Микрогель RS при использовании их на морских свинках, в баллах |
Таким образом, медицинские изделия Гидрогель RS и Микрогель RS при использовании в течение 90 сут являются безвредными средствами по данным оценки интегральных параметров функционального состояния организма крыс (внешний вид, рефлексы, биохимические и морфологические показатели крови и мочи). Они не обладают раздражающим действием при накожном и внутримышечном введении, как показали опыты с кроликами, не обнаруживают сенсибилизирующих свойств в опытах с морскими свинками.
Заключение. Медицинские изделия Гидрогель RS и Микрогель RS (ГосНИИгенетика, Россия) могут быть рекомендованы для проведения клинических испытаний в качестве имплантатов для замещения дефектов мягких и костных тканей, при лечении глубоких ожогов, а также для культивирования клеток in vitro при испытании лекарств.
Финансирование исследования. Работа поддержана Минобрнауки РФ (соглашение о предоставлении субсидии №14.579.21.0017 от 05.06.2014 г., уникальный идентификатор ПНИ — RFMEFI57914X0017).
Конфликт интересов отсутствует.
Литература
- Girotti A., Orbanic D., Ibáñez-Fonseca A., Gonzalez-Obeso C., Rodríguez-Cabello J.C. Recombinant technology in the development of materials and systems for soft-tissue repair. Adv Healthc Mater 2015; 4(16): 2423–2455, https://doi.org/10.1002/adhm.201500152.
- Carletti E., Motta A., Migliaresi C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol 2011; 695: 17–39, https://doi.org/10.1007/978-1-60761-984-0_2.
- Kluge J.A., Rabotyagova O., Leisk G.G., Kaplan D.L. Spider silks and their applications. Trends Biotechnol 2008; 26(5): 244–251, https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2008.02.006.
- Spiess K., Lammel A., Scheibel T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol Biosci 2010; 10(9): 998–1007, https://doi.org/10.1002/mabi.201000071.
- Schacht K., Jüngst T., Schweinlin M., Ewald A., Groll J., Scheibel T. Biofabrication of cell-loaded 3D spider silk constructs. Angew Chem Int Ed Engl 2015; 54(9): 2816–2820, https://doi.org/10.1002/anie.201409846.
- Humenik M., Smith A.M., Scheibel T. Recombinant spider silks — biopolymers with potential for future applications. Polymers 2011; 3(4): 640–661, https://doi.org/10.3390/polym3010640.
- Bogush V.G., Sokolova O.S., Davydova L.I., Klinov D.V., Sidoruk K.V., Esipova N.G., Neretina T.V., Orchanskyi I.A., Makeev V.Y., Tumanyan V.G., Shaitan K.V., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P. A novel model system for design of biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins. J Neuroimmune Pharmacol 2008; 4(1): 17–27, https://doi.org/10.1007/s11481-008-9129-z.
- Bogush V.G., Davydova L.I., Moisenovich M.M., Sidoruk K.V., Arkhipova A.Yu., Kozlov D.G., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P., Debabov V.G. Characterization of biodegradable cell micro and macro carriers based on recombinant spidroin. Appl Biochem Microbiol 2014; 50(8): 780–788, https://doi.org/10.1134/s000368381408002x.
- Moisenovich M.M., Pustovalova O., Shackelford J., Vasiljeva T.V., Druzhinina T.V., Kamenchuk Y.A., Guzeev V.V., Sokolova O.S., Bogush V.G., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P., Agapov I.I. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds. Biomaterials 2012; 33(15): 3887–3898, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2012.02.013.
- ГОСТ Р ИСО 10993-10-2009. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 10. Исследования раздражающего и сенсибилизирующего действия. М: Стандартинформ; 2010.
- Moisenovich M.M., Malyuchenko N.V., Arkhipova A.Y., Kotlyarova M.S., Davydova L.I., Goncharenko A.V., Agapova O.I., Drutskaya M.S., Bogush V.G., Agapov I.I., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P. Novel 3D-microcarriers from recombinant spidroin for regenerative medicine. Dokl Biochem Biophys 2015; 463(1): 232–235, https://doi.org/10.1134/s1607672915040109.
- Moisenovich M.M., Malyuchenko N.V., Arkhipova A.Y., Goncharenko A.V., Kotlyarova M.S., Davydova L.I., Vasil’eva T.V., Bogush V.G., Agapov I.I., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P. Recombinant 1F9 spidroin microgels for murine full-thickness wound repairing. Dokl Biochem Biophys 2016; 466(1): 9–12, https://doi.org/10.1134/s1607672916010038.
