Роль P2-рецептор-опосредованного компонента в нейрогенном контроле тонуса большой подкожной вены человека

За последние несколько десятилетий Р2-рецепторы были обнаружены во многих кровеносных сосудах человека и животных [1]. Это особый класс рецепторов, эндогенным лигандом которых является аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) [2]. Р2-рецепторы делятся на два больших семейства — Р2Х и Р2Y, отличающихся своей структурой и механизмом действия. Р2Х-рецепторы — это типичные лигандоперирующие ионные каналы, в то время как Р2Y-рецепторы по механизму действия являются метаботропными G-протеин-опосредованными рецепторами [3]. При этом локализующиеся на гладкомышечных клетках Р2Х-рецепторы опосредуют тонизирующее действие нуклеотидов на сосуды, тогда как находящиеся на эндотелии Р2Y-рецепторы обеспечивают вазодилатацию [4]. В настоящее время накапливаются сведения о роли внеклеточной АТФ в регуляции сердечно-сосудистой системы человека в целом и кровеносных сосудов в частности [1]. Последние исследования свидетельствуют о потенциальной возможности использования агонистов и антагонистов Р2-рецепторов в клинической практике [5].

Большая подкожная вена (БПВ) бедра человека является важным кровеносным сосудом, поскольку наиболее часто используется в качестве аутошунта при различных шунтирующих операциях (аортокоронарное шунтирование, бедренно-подколенное шунтирование и т.д.). В то же время БПВ наиболее часто поражается варикозной болезнью нижних конечностей в результате хронического заболевания вен (ранее — хроническая венозная недостаточность) [6], что ограничивает ее пригодность для хирургических операций.

Наличие и активность Р2-рецепторов в БПВ человека были показаны в предыдущих исследованиях [7–10]. Однако физиологическая и патофизиологическая роль этих рецепторов в здоровой и варикозной БПВ человека остается невыясненной. В частности, неизвестно, участвуют ли обнаруженные в БПВ Р2-рецепторы в формировании тонуса сосудистой стенки и активируются ли они в ответ на нервные импульсы.

Цель исследования — экспериментальное изучение степени вовлечения Р2-рецепторов в осуществление нейрогенного контроля тонуса варикозно-измененной и не пораженной варикозной болезнью большой подкожной вены человека.

Материалы и методы

Протокол забора ткани для экспериментов. В ис­сле­довании использовали сегменты БПВ, которые получали от пациентов во время выполнения хирургических вмешательств, требующих забора БПВ. Все пациенты находились на стационарном хирургическом лечении в клиниках Казани. Были сформированы две группы.

1-я группа — пациенты с варикозной болезнью нижней конечности в стадии субкомпенсации (С2–С3-стадии по классификации CEAP [11]), которым производилась операция флебэктомии по Троянову–Тренделенбургу–Бэбкоку. Группа включала 14 человек, из них 12 женщин и 2 мужчин в возрасте 32–60 лет. У каждого пациента забирали проксимальный сегмент вены длиной 1,5–2 см в верхней трети бедра в 2–3 см от сафено-феморального соустья. Данный сегмент БПВ был наиболее удобен для забора во время операции, а также обеспечивал минимальную степень травматизации сосуда, что гарантировало жизнеспособность ткани на протяжении всего эксперимента.

2-я группа — пациенты с ишемической болезнью сердца, стенокардией напряжения III–IV функционального класса; у большинства больных отмечался постинфарктный кардиосклероз. Этой группе пациентов проводилось аортокоронарное шунтирование с использованием БПВ в качестве аутовены. Группу составили 21 человек, из них 20 мужчин и 1 женщина в возрасте 41–65 лет. Сегмент вены длиной 1–1,5 см забирали в пределах верхней трети голени, поскольку БПВ именно на этом участке наиболее часто используется при аортокоронарном шунтировании. Всем пациентам из данной группы на дооперационном этапе проводили ультразвуковое исследование БПВ обеих нижних конечностей для определения наличия патологического расширения и обратного рефлюкса. В исследование были включены только пациенты с нормальными показателями ультразвукового обследования (полное отсутствие рефлюкса) и без других проявлений хронической венозной недостаточности.

Подготовка сосудистых препаратов к эксперименту. Сразу после интраоперационного забора БПВ сегмент вены, предназначенный для исследования, помещали в модифицированный раствор Кребса (охлажденный до 4°С) и транспортировали в фармакологическую лабораторию для исследования (от забора материала до начала эксперимента проходило не более 120 мин). Состав модифицированного раствора Кребса (мМ): NaCl — 133; KCl — 4,7; NaHCO₃ — 16,3; MgSO₄ — 0,6; NaH₂PO₄ — 1,35; CaCl₂ — 2,5; глюкоза — 7,8. Далее сегмент препарировали и готовили к фармакологическому эксперименту.

Эксперименты проводили на фармакологической установке регистрации механической активности изолированной ткани (Linton Instrumentation, Великобритания) (рис. 1). Сосуды тщательно, но осторожно очищали от крови, удаляли прилегающие ткани. Из БПВ нарезали кольцеобразные сегменты толщиной 1–2 мм, кольцо перерезали и таким образом получали гладкомышечный препарат длиной 8–10 мм, к двум концам которого привязывали две шелковые нити. Циркулярный гладкомышечный слой в препаратах располагался продольно. В таком виде препараты протягивали между двумя кольцами платиновых электродов (используемых для электрической стимуляции ткани), одну нить фиксировали, а другую соединяли с изометрическим датчиком механической активности FSG-01 (Linton Instrumentation, Великобритания). Далее препарат с электродом помещали в термостатируемые ванночки, содержащие 10 мл модифицированного раствора Кребса. Температура раствора в ванночке поддерживалась на уровне 37,0±0,5°С. Раствор постоянно аэрировали газовой смесью, состоящей из кислорода (95%) и углекислого газа (5%) для поддержания рН на уровне 7,3–7,4. Запись механической активности проводили на персональном компьютере посредством программы MP100WSW Data Acquisition System (Biopack, Великобритания). Перед началом эксперимента к сосудистым препаратам была приложена нагрузка в 1 г и в таком состоянии препарату позволяли привыкнуть к экспериментальным условиям в течение 60 мин, во время которых раствор Кребса в ванночках меняли 4 раза. Далее проводили регистрацию механической активности изолированных сегментов БПВ в ответ на электрическую стимуляцию до и после введения в раствор Кребса агонистов или антагонистов.

---

Рис. 1. Схема фармакологической установки, использованной для экспериментов

---

Протокол электростимуляции сосудистых препаратов. Для изучения нейрогенного контроля тонуса БПВ и выявления Р2-рецепторного компонента сокращения оценивали ответ ткани на электрическую стимуляцию (4 Гц, 20 В) до и после инкубации с м-холиноблокатором атропином (0,1 мкМ) в сочетании с α-адреноблокатором фентоламином (1 мкМ), антагонистами Р2-рецепторов пиридоксальфосфат-6-азофенил-2’,4’-дисульфатом (PPADS) (10 и 30 мкМ) и сурамином (100 и 300 мкМ), а также путем десенситизации Р2Х-рецепторов с помощью агониста Р2Х-рецепторов α,β-метилен-АТФ (10 мкМ), который был выбран как наиболее эффективный и энзиматически устойчивый аналог АТФ. Электрическую стимуляцию проводили при помощи электростимулятора MultiStim D330 (Digitimer, Великобритания). Исходное сокращение, принимаемое за 100%, регистрировали до инкубации с антагонистами. Затем в ванночку вносили какой-либо из блокаторов и снова оценивали эффект электростимуляции (рис. 2, а). После достижения максимального эффекта от электростимуляции препараты отмывали несколько раз раствором Кребса и делали перерыв не менее 30 мин перед введением следующего антагониста. В каждом случае проводили контрольную электрическую стимуляцию без внесения в ванночку каких-либо агонистов и антагонистов, которая на протяжении всего эксперимента вызывала одинаковые сокращения сосуда (рис. 2, б). Параметры электростимуляции были специально подобраны таким образом, чтобы стимуляции подвергались только нервные окончания, а не сами гладкие мышцы. Для подтверждения нейрогенного характера происхождения сократительного ответа БПВ на стимуляцию электрическим полем контрольные образцы инкубировали с селективным блокатором натриевых каналов тетродотоксином (1 мкМ) и оценивали сократительный ответ до и после инкубации.

---

Рис. 2. Нативные записи, получаемые при электрической стимуляции большой подкожной вены: а — запись сократительных ответов вены, вызванных электрической стимуляцией до (1) и после инкубации с PPADS (2); б — запись сократительных ответов вены, вызванных электрической стимуляцией в контроле (1, 3)

---

Исследуемые соединения. Атропина сульфат, фентоламин, PPADS, натриевая соль сурамина, α,β-метилен-АТФ и тетродотоксин были получены от компании Sigma-Aldrich (США).

Статистическая обработка данных. Результаты обработаны с помощью статистической программы Graph Pad Prism (США), использовали t-критерий Стьюдента для связанных и несвязанных величин, а также однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Статистически значимой считали разницу при значении р<0,05.

Этические аспекты. На проведение данного исследования было получено разрешение Этического комитета Казанского государственного медицинского университета. Каждый пациент подписывал информированное согласие на участие в исследовании.

Результаты. При исследовании нейрогенного контроля тонуса БПВ установлено, что совместное использование атропина (0,1 мкМ) и фентоламина (1 мкМ) полностью не угнетает сократительные ответы, вызванные стимуляцией электрическим полем. Данный эффект наблюдался как в варикозных БПВ, так и в венах, не подверженных варикозной болезни. В варикозных венах атропин и фентоламин угнетали эффект электростимуляции на 30,5±4,9%, а в неварикозных БПВ — на 38,0±3,3%. Добавленный в раствор антагонист Р2-рецепторов PPADS в концентрации 10 мкМ статистически значимо снижал амплитуду сократительного ответа на фоне атропина и фентоламина в варикозных и неварикозных БПВ — на 47,9±6,0% (p=0,046) и 51,9±3,9% (p=0,013) соответственно. Зависимости снижения ответа БПВ от концентрации PPADS не отмечено, поскольку при концентрации 30 мкМ антагонистический эффект PPADS достоверно не отличался от такового при концентрации 10 мкМ (p=0,63 для варикозных БПВ и р=0,24 для неварикозных БПВ) (рис. 3).

---

Рис. 3. Влияние PPADS (10 и 30 мкМ) на сократительные ответы большой подкожной вены человека, пораженной варикозной болезнью (n=14) и без нее (n=21); * — р<0,05 при сравнении с сократительной активностью на фоне атропина и фентоламина

---

Аналогичная картина наблюдалась при исследовании другого неселективного антагониста Р2-рецепторов — сурамина. В концентрации 100 мкМ сурамин статистически значимо снижал сократительный ответ БПВ на 46,3±2,6% (p=0,030) в варикозных венах и на 51,7±3,3% (р=0,043) — в сегментах БПВ, не пораженных варикозной болезнью, в то время как дальнейшего снижения амплитуды сокращения при увеличении концентрации до 300 мкМ не наблюдалось (рис. 4).

---

Рис. 4. Влияние сурамина (100 и 300 мкМ) на сократительные ответы большой подкожной вены человека, пораженной варикозной болезнью (n=14) и без нее (n=21); * — р<0,05 при сравнении сократительной активности на фоне атропина и фентоламина

---

Агонист Р2Х-рецепторов — α,β-метилен-АТФ, способный вызывать десенситизацию Р2Х-рецепторов при длительном воздействии, в концентрации 10 мкМ незначительно снижал амплитуду сократительного ответа БПВ в обеих группах: на 39,9±2,6% — для варикозных и на 42,8±8,7% — для неварикозных БПВ, однако в данном случае статистической значимости не выявлено (р=0,250 и р=0,532 соответственно) (рис. 5).

---

Рис. 5. Влияние α,β-метилен-АТФ (10 мкМ) на сократительные ответы большой подкожной вены человека, пораженной варикозной болезнью (n=14) и без нее (n=21)

---

При сравнении варикозных и варикозно не измененных вен были получены следующие результаты. Атропин, фентоламин и PPADS в меньшей степени угнетают сокращения в группе варикозно-измененных вен по сравнению с венами, не пораженными варикозной болезнью. Для сурамина и α,β-метилен-АТФ такой зависимости не установлено.

В экспериментах с тетродотоксином (1 мкМ) было подтверждено, что получаемые нами сократительные ответы носят именно нейрогенный характер, т.е. при воздействии электрическим полем возбуждаются только нервные, а не мышечные компоненты сосудистой стенки. После инкубации с тетродотоксином сократительный ответ БПВ на стимуляцию электрическим полем более не вызывался, что связано с блокадой натриевых каналов нервных окончаний и невозможностью проведения нервного импульса.

Обсуждение. Проведенное исследование свиде­тельст­вует о наличии неадренергического и нехолинергического компонентов нервной передачи в БПВ. Эффективность антагонистов Р2-рецепторов — PPADS и сурамина — позволяет предположить, что частью неадренергического и нехолинергического компонентов нервной регуляции тонуса БПВ является Р2-рецепторопосредованный компонент.

Наличие и активность Р2-рецепторов в варикозных и неварикозных БПВ человека были показаны ранее нами [7–9] и другими исследователями [10]. Мы обнаружили различные подтипы Р2-рецепторов в гладкомышечных тканях и эндотелиальном слое БПВ [9]. В то же время степень вовлечения этих рецепторов в формирование тонуса БПВ оставалась неизученной. Результаты настоящего исследования подтверждают, что Р2-рецепторы являются важной частью системы нейрогенного контроля тонуса этого кровеносного сосуда как в норме, так и при патологии. Кроме того, выявленные неадренергический и нехолинергический компоненты нервной передачи свидетельствуют о наличии эндогенных лигандов (таких как АТФ), выделяющихся при стимуляции нервов и действующих посредством Р2-рецепторов. В других исследованиях [1, 12] на различных кровеносных сосудах человека и животных было показано, что АТФ выделяется из нервных окончаний нервов (симпатических и сенсомоторных) совместно с другими нейромедиаторами, выступая в качестве котрансмиттера. Действуя содружественно с норадреналином (при совместном экзоцитозе из симпатических нервов), в кровеносных сосудах АТФ чаще всего влияет на Р2Х1-подтип рецепторов и также вызывает сокращение гладкомышечных клеток. При выделении из окончаний сенсомоторных нейронов АТФ чаще всего действует на Р2Y_{1, 2, 6}- или Р2Y₁₂-подтип рецепторов, вызывая либо сокращение, либо расслабление сосуда [1].

Р2-рецепторы в БПВ могут играть сразу несколько важных ролей. Существует теория, что Р2-рецепторная система эволюционно гораздо более ранняя, нежели другие рецепторные системы [13]. В связи с этим можно предположить, что в кровеносных сосудах человека Р2-рецепторная система уступает первенство в реализации вазомоторного эффекта более эволюционно-развитым системам, например адренергической. В то же время роль Р2-рецепторов существенно возрастает при возникновении патологических состояний, таких как воспаление, боль, тромбоз и вазоспазм [14, 15]. Таким образом, можно предположить, что Р2-рецепторы — это своеобразный защитный механизм, который организм человека может активировать при развитии патологического процесса. В частности, при варикозной болезни происходит перестройка Р2-рецепторного аппарата в БПВ, которая проявляется в изменении чувствительности Р2-рецепторов к действию агонистов и антагонистов на различных участках БПВ [7]. Такая перестройка может свидетельствовать о вовлеченности Р2-рецепторов в патогенез развития варикозной болезни, который на сегодняшний день остается до конца не изученным.

Результаты настоящего исследования показали, что эффективность адрено-, холино- и Р2-рецепторов меньше в варикозно-измененных венах по сравнению с венами без варикозного повреждения. Это позволяет предположить, что в процессе развития варикозной болезни происходит перестройка не только адрено- и холинорецепторов, но и Р2-рецепторов тоже. Однонаправленное вовлечение всех исследованных нами рецепторных систем в сторону понижения их эффективности может свидетельствовать о генерализованной потере рецептор­опосредованных ответов в варикозных венах, что, скорее всего, объясняется перестройкой БПВ сократительного типа в БПВ синтетического типа [16]. Конечно, интерпретацию этих данных и сравнение варикозных и неварикозных вен следует выполнять с осторожностью, поскольку исследования проводились на участках БПВ разной локализации.

Р2-рецепторы являются перспективными мишенями для разработки лекарственных препаратов, влияющих на сердечно-сосудистую систему [5, 17]. В настоящее время в клинической практике уже широко применяется несколько препаратов, механизм действия который основан на взаимодействии с Р2-рецепторами — клопидогрел, тиклопидин, празугрел [18]. Эти препараты являются мощными антиагрегантными средствами, которые действуют в качестве антагонистов Р2Y₁₂-рецепторов, расположенных на тромбоцитах. Детальное изучение роли Р2-рецепторов в БПВ позволит уточнить их роль в патогенезе развития различных заболеваний венозной системы человека (таких как варикозная болезнь, тромбофлебит и т.д.) и может создать предпосылки для разработки лекарственных средств, которые бы действовали посредством активации или ингибирования Р2-рецепторов.

Таким образом, данные, которые были получены нами ранее, и результаты этого исследования позволяют предположить, что изменение чувствительности Р2-рецепторов может служить одним из важных звеньев патогенеза варикозного поражения вен нижних конечностей. Можно надеяться, что дальнейшие исследования в этом направлении помогут найти новые эффективные средства лечения варикозной болезни.

Заключение. Выявленная роль Р2-рецептор-опосредованного компонента в нейрогенном контроле тонуса большой подкожной вены человека и дальнейшее изучение механизма действия Р2-рецепторов могут служить перспективной базой для создания лекарственных препаратов, действие которых было бы сходно с действием антагонистов Р2-рецепторов и которые могли бы использоваться для профилактики спазмирования после наложения аортокоронарного шунта.

Финансирование исследования. Работа поддержана грантом РФФИ №16-04-00101 и средствами субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки К(П)ФУ в целях повышения конкурентноспособности.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.