Оценка эффективности иммуногистохимических методов в диагностике состояния эндометрия у женщин с маточной формой бесплодия

Женское бесплодие остается одной из важнейших проблем современной медицины. Согласно данным эпидемиологических исследований, частота бесплодия в различных странах мира колеблется от 8 до 18%, а в России достигает 17,5% и не имеет тенденции к снижению [1–3]. Маточный фактор в структуре бесплодия занимает одно из ведущих мест (50%) наряду с трубно-перитонеальным фактором (70%) и эндометриозом (46,5%) [4, 5]. В основе патогенеза бесплодия при патологии матки лежит нарушение процесса имплантации эмбриона на стадии бластоцисты, происходящего в середине лютеиновой фазы (19–24-й день менструального цикла) [6, 7]. В настоящий момент для исследования структуры и функций слизистой оболочки матки используют гистологические и функциональные методы оценки [8–10], однако они не позволяют определить глубокие механизмы взаимодействия плодного яйца и матки, обеспечивающие наступление и прогрессирование беременности на всем ее протяжении. С целью повышения качества дифференциальной диагностики состояния эндометрия мы решили изучить возможности использования иммуногистохимических методов.

Цель исследования — изучение эффективности определения иммуногистохимических параметров при оценке состояния эндометрия у женщин с маточной формой бесплодия, обусловленной внутриматочной патологией.

Материалы и методы. В клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова за период с 2012 по 2014 г. было проведено комплексное обследование 100 женщин с нарушением репродуктивной функции в возрасте от 27 до 42 лет. У 46 из них отмечалась гиперплазия эндометрия, у 35 женщин — внутриматочные синехии, у 19 — хронический эндометрит.

Критерием отбора больных для исследования явилось отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции в течение 1 года и более на фоне подтвержденной внутриматочной патологии.

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией, принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия), и одобрено Этическим комитетом Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. От каждой пациентки получено информированное согласие.

Общеклинические методы исследования включали: клиническое и биохимическое исследование крови, гемостазиограмму, общий анализ мочи, микроскопическое и бактериологическое исследование флоры из цервикального канала и влагалища.

Инструментальные методы включали кольпоскопию, гистеросальпингографию, трансвагинальное ультразвуковое исследование органов малого таза, гистероскопию, биопсию эндометрия с последующими морфологическим и иммуногистохимическим исследованием соскобов.

Трансвагинальное ультразвуковое исследование осуществляли на ультразвуковом аппарате Toshiba SSH-140A (Toshiba, Япония) с трансвагинальным конвексным датчиком с частотой 6,5 МГц. Оценивали размеры матки, структуру эндо- и миометрия, толщину эндометрия, размеры и эхоструктуру яичников, наличие или отсутствие функциональных образований яичников. Оценивали также размеры, количество, локализацию и эхоструктуру патологических образований.

Всем пациенткам для окончательного подтверждения наличия внутриматочной патологии производили офисную гистероскопию на 5–9-й день менструального цикла. Использовали офисные гистероскопы со световолоконной оптикой (Karl Storz и Rudolf, Германия) диаметром 2,7 мм без применения пулевых щипцов и расширения цервикального канала. Оценивали форму цервикального канала и полости матки, состояние слизистой оболочки цервикального канала, эндометрия, устьев маточных труб.

Гистеросальпингографию проводили с целью уточнения состояния маточных труб.

Морфологическое исследование биоптатов выполняли в Межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Биоптаты и соскобы эндометрия и ткани фиксировали в 10% забуференном (фосфатном) нейтральном формалине и заливали в парафин. Суммарное время фиксации и заливки материала не превышало 24 ч. Затем из каждого блока делали не менее 10 ступенчатых срезов толщиной 4 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином. В окрашенных препаратах оценивали состояние желез эндометрия и стромы, наличие фиброза, воспалительной инфильтрации, количество и калибр спиральных артерий, толщину их стенок.

Для иммуногистохимического исследования применяли двухэтапный с демаскировкой антигена стрептавидин-биотин-пероксидазный метод, использовали стандартные наборы моноклональных антител (DAKO, США). Определяли следующие иммуногистохимические маркеры: рецепторы ER и PR, Кi-67, CD34, CD56, CD68, CD138, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Проявление реакции осуществляли с помощью системы визуализации Dako Cytomation (США). Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex, США).

Результаты реакции рецепторов к эстрогенам и прогестерону идентифицировали по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой числа окрашенных клеток и интенсивности окраски клеток. Экспрессию рецепторов к эстрогенам и прогестерону оценивали по трехбалльной шкале (слабая, средняя и выраженная).

Для определения уровня экспрессии антигена Ki-67 в железах подсчитывали индекс пролиферации — отношение количества окрашенных ядер клеток к общему числу ядер (в процентах) в не менее чем 300 ядрах. Экспрессию Ki-67 в строме оценивали путем подсчета количества окрашенных ядер в поле зрения при 400-кратном увеличении, изучая не менее 10 полей зрения.

Активность экспрессии CD34 и VEGF в эпителии, строме эндометрия и в эндотелии сосудов проявлялась в виде окрашивания мембраны и цитоплазмы эпителиальных и эндотелиальных клеток. Результаты оценивали полуколичественно, по общепринятой методике: (+) — до 20% положительных клеток — 2 балла; (++) — 20–40% положительных клеток — 4 балла; (+++) — более 40% положительных клеток — 6 баллов.

Экспрессию CD56, CD68, CD138 оценивали путем подсчета позитивных клеток при 400-кратном увеличении в 10 полях зрения и более.

Статистическую обработку материала проводили с использованием стандартной программы Microsoft Excel 2010. В данном исследовании применяли метод подсчета с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (p).

Результаты и обсуждение. Из 100 обследованных женщин с нарушением репродуктивной функции у 62 отмечено первичное бесплодие, а у 38 — вторичное. Длительность бесплодия составила 5,5±0,5 и 3,2±0,7 года соответственно.

При изучении акушерско-гинекологического анамнеза у женщин со вторичным бесплодием установлено, что только у 19 из 38 пациенток (50%) в анамнезе были роды, при этом одни роды в анамнезе были у 17 женщин (44,7%), двое родов — у 9 (23,6%). Искусственное прерывание беременности имело место в прошлом у 23 из 38 женщин (60,5%), а у 15 из них (39,4%) — более двух раз. Самопроизвольные выкидыши в анамнезе отмечались у 11 женщин (28,9%), из них у 6 (15,7%) — более трех раз. У всех пациенток с первичным и вторичным бесплодием в анамнезе имелись гинекологические оперативные вмешательства (рис. 1).

---

Рис. 1. Частота гинекологических оперативных вмешательств у женщин с первичным и вторичным бесплодием

---

Осмотр шейки матки в зеркалах и расширенная кольпоскопия в 8 наблюдениях позволили выявить рубцовую деформацию шейки матки, у 10 пациенток — эктопию шейки матки.

Гистеросальпингографию выполнили 60 женщинам из 100 (60%), 40 пациенткам ее проводили ранее в отделениях вспомогательных репродуктивных технологий перед ЭКО и ПЭ. У 21 из 60 женщин (35%) гистеросальпингография выявила дефект наполнения полости матки — от частичной до полной облитерации, что позволило диагностировать наличие внутриматочных синехий.

При трансвагинальном УЗИ, которое проводили в первую фазу менструального цикла, у большинства пациенток отмечалась повышенная эхогенность, неоднородность структуры эндометрия с множественными мелкими анэхогенными включениями.

При офисной гистероскопии у 46 женщин определяли неравномерно утолщенную слизистую оболочку с выраженным сосудистым рисунком, устья маточных труб визуализировали. У 7 пациенток полость матки была облитерирована полностью, внутриматочные синехии, деформирующие 2/3 полости, были обнаружены у 4 женщин, у 5 обследуемых внутриматочные синехии визуализировали в области трубных углов, у 19 — в виде единичных тяжей. У 19 отмечали гиперемию, легкую ранимость стенок, которые кровоточили при прикосновении, визуализировали островки белесоватого или желтоватого цвета и гипертрофированную, отечную слизистую оболочку матки.

В процессе гистероскопии всем пациенткам проводили биопсию эндометрия с последующим гистологическим исследованием, а в 59 случаях выполняли иммуногистохимическое исследование слизистой оболочки полости матки.

По результатам гистологического и иммуногистохимического исследования эндометрия из 59 пациенток были сформированы четыре группы: 1-я группа (n=25) — с гиперплазией эндометрия; 2-я группа (n=17) — с внутриматочными синехиями; 3-я группа (n=10) — с хроническим эндометритом; 4-я группа (n=7) — с эндометрием в фазе пролиферации (морфологически не измененный эндометрий).

Морфологическая картина в 1-й группе соответствовала простой гиперплазии эндометрия без атипии. Отмечалось повышение количества как железистых, так и стромальных элементов, однако отсутствовало тесное расположение желез, которые имели округлые очертания и были разнообразны по величине (рис. 2).

---

Рис. 2. Гиперплазия эндометрия; в эпителиальных клетках видны митозы; окраска гематоксилином и эозином; ×400

---

Морфологическая картина во 2-й группе соответствовала диагнозу «внутриматочные синехии», эндометрий соответствовал фазе пролиферации, при которой строма в значительной степени заменена фиброзной тканью, железы представлены неактивным приз­матическим эпителием эндометриального типа, определялись аваскулярные ткани, кальцификация стромы и желез.

Морфологическая картина в 3-й группе соответствовала хроническому эндометриту. Отмечалось наличие множественных воспалительных инфильтратов, состоящих преимущественно из плазматических клеток и лимфоидных элементов. Очаговые инфильтраты имели вид лимфоидных фолликулов и располагались не только в базальном, но и во всех других отделах функционального слоя эндометрия, в состав их входили лейкоциты и гистиоциты (рис. 3). Склеротические изменения стенок спиральных артерий эндометрия и очаговый фиброз стромы свидетельствовали о длительном хроническом воспалении.

---

Рис. 3. В верхней части препарата — лимфоидный фолликул с единичными делящимися клетками; иммуногистохимическая реакция; ×200

---

Морфологическая картина в 4-й группе показывает, что эндометрий соответствует фазе пролиферации, железы — мелкие, расположены равномерно, строма — рыхлая, сосуды — многочисленные с тонкими стенками (рис. 4), это свидетельствует о морфологически не измененном эндометрии и позволяет считать в дальнейшем эту группу контрольной.

---

Рис. 4. Эндометрий ранней стадии фазы пролиферации; окраска гематоксилином и эозином; ×100

---

Результаты иммуногистохимических исследований, проведенных в последующем, подтвердили их полную корреляцию с морфологическими данными.

Результаты иммуногистохимического исследования эндометрия у пациенток всех групп представлены в таблице.

---

Результаты иммуногистохимического исследования эндометрия у пациенток всех групп

---

При сравнении экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов ER и PR статистически значимых различий в 1, 2 и 4-й группах не выявлено. В ходе исследования обнаружено, что показатели ER:PR в стадии пролиферации были практически равны 1 (р<0,05). Отмечалась неравномерная экспрессия ER- и PR-рецепторов в строме и железах с преобладанием в железах. Экспрессия в группе с хроническим эндометритом (3-я группа) была понижена и составила 77,8 и 74,2% соответственно (р>0,05), что свидетельствует о нарушении синтеза эстрогеновых и прогестероновых рецепторов железистых и стромальных клеток. Таким образом, у пациенток этой группы эндометрий становится слабо восприимчивым к эстрадиолу и прогестерону.

У пациенток всех групп выявлена неравномерная, низкая пролиферативная активность. Отмечено снижение уровня экспрессии Ki-67 как в эпителии желез, так и в клетках стромы (р<0,05). Полученные данные не коррелируют с экспрессией рецепторов к эстрадиолу и прогестерону, что может свидетельствовать о наличии неполноценного «окна имплантации».

Выявлено снижение числа основных иммунокомпетентных клеток эндометрия (CD56-позитивных клеток) во всех группах (р<0,05), что проявлялось низкой цитотоксической активностью (рис. 5) и уменьшением макрофагов СD68 в эндометрии (р<0,05), тогда как считается [5, 8], что для обеспечения нормального процесса имплантации количество этих клеток в первую фазу менструального цикла должно повышаться.

---

Рис. 5. Немногочисленные CD56-позитивные лимфоциты в строме эндометрия; иммуногистохимическая реакция; ×200

---

Уровень экспрессии маркера плазматических клеток CD138 в эндометрии у пациенток 1-й группы невысокий, а у пациенток 2-й и 4-й групп экспрессия CD138 отсутствует (р<0,05). Это свидетельствует о незначительных воспалительных изменениях в эндометрии у пациенток 1-й группы и отсутствии воспалительных процессов у пациенток 2-й и 4-й групп. Полученные данные свидетельствуют о незначительной роли воспалительных изменений эндометрия в нарушении имплантации у пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия и внутриматочными синехиями, тогда как у пациенток с хроническим эндометритом повышенная экспрессия CD138 является фактором, препятствующим имплантации, и говорит о наличии воспалительных изменений эндометрия.

Экспрессия CD34 (маркера, отвечающего за ранние этапы кроветворения) во всех группах проявлялась позитивной интенсивной реакцией в эндотелии спиральных артерий, в многочисленных капиллярах и клетках стромы, что свидетельствует о нормальных процессах закладки сосудов и адекватной пролиферации эндотелиоцитов (р<0,05). Однако в 4-й группе отмечены повышенные показатели для данной фазы менструального цикла (пролиферации), что может свидетельствовать об интенсификации процессов пролиферации эндотелиоцитов в базальном слое и строме эндометрия. В норме нарастание экспрессии CD34 в базальном слое и строме эндометрия отмечается во второй фазе цикла. Таким образом, у пациенток 4-й группы можно предположить низкую вероятность фиброза эндотелиоцитов, что не исключает наличия его у пациенток 1, 2 и 3-й групп.

Экспрессия VEGF в 1-й и 3-й группах (р<0,05) проявлялась позитивной реакцией в отдельных клетках стромы и в эндотелии сосудов, что свидетельствует о снижении процессов неоангиогенеза, обусловливающем недостаточное кровоснабжение и гипоксию тканей вследствие уменьшения диффузии кислорода. Низкий уровень VEGF приводит к бедному сосудо­образованию, которое в дальнейшем еще более уменьшает сосудистый кровоток в эндометрии. Экспрессия VEGF в 4-й группе проявлялась позитивной реакцией во всех клетках стромы и в эндотелии сосудов, однако во 2-й группе она отсутствовала, что свидетельствует о нарушениях процессов неоангиогенеза у пациенток с внутриматочными синехиями.

Таким образом, включение в комплексное обследование женщин с внутриматочной патологией и бесплодием иммуногистохимических методов исследования позволяет провести более полную оценку состояния эндометрия и верифицировать его морфофункциональные отклонения. Изменение экспрессии рецепторов ER и PR, уменьшение содержания иммунокомпетентных клеток CD56 и макрофагов СD68, а также ослабление процессов неоангиогенеза и последующая гипоксия тканей наглядно иллюстрируют картину нарушения процессов имплантации, помогают оценить возможность ее наступления. Низкий уровень экспрессии Ki-67 указывает на недостаточную пролиферативную активность эндометрия, что также является препятствием для имплантации.

Заключение. Иммуногистохимические маркеры могут служить дополнительным критерием для оценки рецепторной активности, полноценности пролиферативной и репаративной функций эндометрия перед планированием беременности.

Внедрение в клиническую практику иммуногистохимических методов исследования позволяет существенно повысить качество диагностики нарушений состояния эндометрия у женщин с маточной формой бесплодия и выбрать адекватные лечебные мероприятия.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.