Метод нелинейной микроскопии в изучении состояния внеклеточного матрикса мочевого пузыря при тяжелых осложнениях лучевой терапии опухолей женской репродуктивной системы

Несмотря на развитие методов конформного облучения, изменения нормальных тканей, возникающие после проведения лучевой терапии по поводу злокачественных новообразований, до сих пор остаются нерешенной проблемой современной радиационной онкологии. К поздним относят лучевые повреждения, которые появляются в сроки более 100 дней после окончания облучения, часто спустя многие годы после лучевой терапии [1, 2]. Они имеют наиболее существенное клиническое значение, а их выраженность может варьировать от относительно незначительных функциональных нарушений до тяжелых осложнений, оказывающих влияние на качество жизни пациентов и в некоторых случаях угрожающих жизни [3, 4]. Мочевой пузырь и прямая кишка являются основными органами риска при лучевом лечении злокачественных новообразований органов малого таза. Развитию осложнений с их стороны способствуют более агрессивные схемы лучевой терапии и сочетание химиотерапии и облучения [5–8], а также использование нестандартных методов фракционирования [9–11]. Повышенный риск развития тяжелых радиационно-индуцированных повреждений имеют пациенты с хроническими воспалительными заболеваниями кишечника и мочевого пузыря [12, 13], сахарным диабетом [14], патологией сердечно-сосудистой системы [15], заболеваниями, передаваемыми половым путем, в анамнезе, в том числе с ВИЧ-инфекцией [16] и системными заболеваниями соединительной ткани [17].

Основным проявлением поздних радиационных изменений мочевого пузыря является формирование патологического постлучевого фиброза, которое обусловлено сосудистыми повреждениями, увеличением синтеза коллагена (преимущественно I и III типов) и последовательной активацией ключевых фиброгенных факторов роста и цитокинов, главным образом TGFb1 и CTGF [18].

Исследование морфофункциональных изменений мочевого пузыря после воздействия ионизирующего излучения показало, что позднее прогрессирующее повреждение органа проявляется денудацией уротелиальных клеток, образованием язв и некрозов, телеангиэктазий в слизистой оболочке и подслизистой основе и развитием фиброза [19, 20]. Эти изменения, как правило, возникают в сроки от 2 до 3 лет после облучения и могут привести к постоянному снижению емкости мочевого пузыря, что в некоторых случаях требует тотальной цистэктомии [21].

В большинстве исследований информация о состоянии соединительнотканного матрикса мочевого пузыря после облучения получена с использованием стандартных методов гистологического исследования. Появление современных высокоразрешающих методов визуализации коллагена и эластина — нелинейной микроскопии в режимах регистрации сигнала генерации второй гармоники (ГВГ) и двухфотонно-возбуждаемой автофлюоресценции (ДВАФ) — дает возможность оценивать эти изменения на новом уровне, позволяет разрабатывать неинвазивные оптические инструменты мониторинга радиационно-индуцированных повреждений для использования в клинической практике.

Цель исследования — оценка возможностей изученияособенностей состояния внеклеточного матрикса мочевого пузыря после проведения лучевой терапии по поводу рака шейки матки и рака тела матки с помощью метода нелинейной микроскопии.

Материалы и методы. Для выявления особенностей повреждения внеклеточного матрикса мочевого пузыря после воздействия ионизирующего излучения и в результате хронического воспаления проведено исследование двух групп больных.1-ю группу (n=75) составили пациентки, у которых после сочетанной лучевой терапии по поводу рака шейки матки или рака тела матки развились побочные эффекты облучения тяжелой степени со стороны мочевого пузыря. Данные осложнения развивались в сроки от 1 года до 11 лет после проведения облучения. Во вторую группу (n=80) вошли пациентки, страдающие хроническим циститом бактериальной этиологии с анамнезом заболевания более 3 лет.

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией, принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия), и одобрено Этическим комитетом НижГМА. От каждой пациентки получено информированное согласие.

Всем пациенткам было проведено цистоскопическое исследование. У 33 пациенток из 1-й группы и у 28 из 2-й выполнена биопсия мочевого пузыря. Образцы ткани мочевого пузыря для морфологического исследования брали из слизистой оболочки задней и боковых стенок мочевого пузыря, как визуально измененных, так и неизмененных. Сведения о пациентках, которым выполнялось морфологическое исследование слизистой оболочки мочевого пузыря, представлены в таблице.

Характеристика пациентов, которым выполнялось морфологическое исследование слизистой оболочки мочевого пузыря

В качестве контрольных использовались образцы неизмененного мочевого пузыря (секционный материал, 3 образца).

Нелинейную микроскопию и гистологическое исследование выполняли по следующей методике. Образцы ткани мочевого пузыря для обоих исследований фиксировали в течение 24 ч в 10% растворе нейтрального формалина. Затем проводили заливку образцов в парафин (среда Histomix-extra; «БиоВитрум», Россия) с последующей монтировкой парафиновых блоков. На ротационном микротоме Leica 450 RM (Leica Microsystems, Германия) с полученных блоков последовательно изготавливали срезы толщиной 10 и 0,1 мкм. Образцы толщиной 10 мкм депарафинировали и исследовали методом нелинейной микроскопии без дополнительного окрашивания. Для верификации полученных изображений срезы толщиной 0,1 мкм, приготовленные с тех же блоков, окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикросириусом красным.

Нелинейную микроскопию проводили на инвертированном лазерном сканирующем микроскопе LSM Axiovert 510 Meta (Carl Zeiss, Германия). В качестве источника возбуждающего излучения использовали короткоимпульсный фемтосекундный лазер MAI TAI HP (Spectra Physics, США) с частотой следования импульсов 80 МГц и длительностью порядка 100 фс. Возбуждение осуществляли на длине волны 800 нм, регистрацию сигнала ГВГ от коллагеновых структур проводили в диапазоне 362–415 нм (изображение в зеленом цвете), сигнала ДВАФ от эластических волокон — в диапазоне 480–555 нм (изображение в красном цвете). При совмещении сигналов ГВГ и ДВАФ получалось третье изображение, по которому было легче оценить вклад каждого компонента в общий сигнал от объекта.

Окрашенные гистологические препараты изучали с помощью микроскопа Leica DMLS (Leica Microsystems, Германия). Гистологические препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, использовали для описания характера воспалительного процесса и его выраженности. На данных препаратах производили подсчет количества сосудов микроциркуляторного русла в поле зрения. Для этого использовали морфометрическую сетку Автандилова с количеством пересечений 289. Подсчет сосудов проводили при увеличении объектива — 40, окуляра — 5 с последующим нормированием их количества на единицу площади. Гистологические препараты, окрашенные пикросириусом красным, оценивали методом поляризационной микроскопии, что позволило прицельно наблюдать изменения в состоянии коллагеновых волокон [22].

Результаты

Цистоскопическое исследование. У пациенток с осложнениями лучевой терапии при цистоскопии была выявлена характерная очаговая гиперемия на задней стенке мочевого пузыря, иногда с наличием петехиальных кровоизлияний — 47 случаев (62,7%). Гиперемия и отек в мочепузырном треугольнике присутствовали несколько чаще — 54 случая (72,0%). Тяжелое (III и IV степени) поражение мочевого пузыря зафиксировано у 20 пациенток, у 14 из них выявлены субтотальные телеангиэкта­зии, петехии, эрозированные очаги. Изменения обнаружены преимущественно в области задней стенки, мочепузырного треугольника («горячих» зон для лучевой терапии) и устьев мочеточников. Язвы с некрозами и иногда с инкрустацией солями наблюдались чаще на задней стенке. В 4 случаях имел место пузырно-влагалищный свищ.

У пациенток с хроническим циститом в процессе цистоскопии визуально не измененный мочевой пузырь выявлен в 5 случаях (6,25%), выраженное усиление сосудистого рисунка — в 46 случаях (57,5%), отек и гиперемия в зоне мочепузырного треугольника на фоне усиления сосудистого рисунка — в 19 случаях (23,75%), а картина лейкоплакии — в 37 случаях (46,25%).

Гистологическое исследование. В образцах ткани мочевого пузыря в сроки более одного года после лучевого лечения выявлены фиброзные изменения различной степени выраженности. Отмечали склероз стенок большей части мелких сосудов (диаметр их просвета был заметно уменьшен), а также значительный фиброз подслизистых структур. Практически во всех случаях в слизистой оболочке и подслизистой основе мочевого пузыря на фоне очаговых воспалительных инфильтратов, расположенных по большей части периваскулярно, наблюдали образование грубоволокнистой рубцовой ткани. При этом окрашивание пикросириусом красным выявило ярко-красное и желтое свечение коллагеновых волокон (коллаген I типа) преимущественно вокруг сосудов, что является признаком начинающегося склероза сосудистой стенки (рис. 1, а). Потеря эластичности распределительных сосудов микроциркуляторного русла вследствие подобных изменений может приводить к развитию одного из грозных осложнений лучевой терапии органов малого таза — интенсивных кровотечений из мочевого пузыря. В большей части препаратов облученного мочевого пузыря в различные сроки после лучевой терапии среди участков фиброза в подслизистой основе выявлены небольшие участки грануляционной ткани, что служит свидетельством несовершенства процессов регенерации на фоне протекающих процессов альтерации. В мышечной оболочке обнаруживали фиброзную ткань в виде единичных прослоек в сочетании с очаговой атрофией мышечных элементов. На гистологическом препарате, окрашенном пикросириусом красным, видны плотно уложенные толстые пучки коллагеновых волокон, образующие фиброзную ткань не только в подслизистой основе, но и в мышечной оболочке. Красно-оранжевый цвет волокон свидетельствует о преобладании коллагена I типа, пучки волокон имеют параллельную укладку (рис. 1, в).

Рис. 1. Сравнительный гистологический анализ состояния внеклеточного матрикса мочевого пузыря при лучевом (а, в) и хроническом (б, г) циститах: при лучевом цистите в подслизистой основе (а) выявлены начинающийся склероз сосудистой стенки (стрелки желтого цвета), участки фиброза (стрелки розового цвета) и небольшие участки грануляционной ткани (стрелка голубого цвета); в мышечной оболочке (в) видны плотно уложенные толстые пучки коллагеновых волокон, образующие фиброзную ткань, в сочетании с очаговой атрофией мышечных элементов; при хроническом цистите в подслизистой основе (б) очаги фиброза (утолщенные коллагеновые волокна красно-оранжевого цвета) определялись только на отдельных участках (стрелка розового цвета) на фоне преобладающих воспалительных процессов (тонкие коллагеновые волокна зеленого цвета) (стрелки голубого цвета); в мышечной оболочке (г) разрастаний соединительной ткани не замечено; окраска пикросириусом красным, микрофото сделано в поляризованном свете; ПО — подслизистая основа; МО — мышечная оболочка; КП — коллагеновые пучки; бар — 1 мм

Сравнительный микроскопический анализ образцов из визуально не измененных и визуально измененных зон мочевого пузыря при лучевом цистите показал, что степень повреждения тканей в них различна. В биоптатах из зон кровоизлияний на задней стенке в периваскулярных зонах выявлен эритродиапедез. Покровный уротелий имел разную толщину: встречались участки атрофии, очаговой гиперплазии, местами — заметные дистрофические изменения. В подэпителиальной ткани обнаруживались резкое полнокровие, выраженный отек, кровоизлияния (рис. 2, а, стрелка желтого цвета), периваскулярно — очаговые инфильтраты из лимфоцитов, плазматических клеток, гистиоцитов (рис. 2, а, стрелки черного цвета), что соответствует картине экссудативно-инфильтративного воспаления. Важно, что в слизистой оболочке визуально не измененных боковых стенок мочевого пузыря также обнаруживались подобные изменения, но меньшей степени выраженности. В нескольких препаратах в подслизистой основе выявлены очаги лимфоцитарной инфильтрации (рис. 2, б,стрелка), что характерно для хронического воспалительного процесса.

Рис. 2. Стенка мочевого пузыря при лучевом цистите: сравнительный гистологический анализ визуально измененных (а) и визуально не измененных (б) зон; окраска гематоксилином и эозином; У — уротелий, ПО — подслизистая основа; черные стрелки указывают на очаги инфильтратов; желтая стрелка — на очаг геморрагии; бар — 1 мм

В образцах ткани мочевого пузыря пациенток с хроническим циститом отмечаются разноплановые изменения покровного уротелия в виде участков атрофии, местами — гиперплазии, акантоза, с формированием очагов Брунна, неравномерное разрастание фиброзной ткани, в том числе в стенках сосудов, воспалительные лимфоплазмоцитарные инфильтраты преимущественно во внутренних оболочках стенки. Красно-оранжевое окрашивание коллагеновых волокон, которому соответствуют очаги фиброза (рис. 1, б, стрелка розового цвета), определялось только на отдельных участках на фоне преобладающих воспалительных процессов (тонкие коллагеновые волокна зеленого цвета) (рис. 1, б, стрелки голубого цвета). В мышечной оболочке разрастания соединительной ткани не замечено (рис. 1, г).

Таким образом, при хроническом цистите сроком более трех лет и при лучевом цистите сроком более одного года наиболее выраженные изменения формируются в подслизистой основе стенки мочевого пузыря. После проведения лучевой терапии участки выраженного фиброза обнаруживаются также и в мышечной оболочке. Отмечается тенденция к уменьшению общего количества сосудов микроциркуляторного русла на единицу площади ткани в случае радиационных осложнений по сравнению с хроническим циститом: 62±12 на 1 мм² и 73±8 на 1 мм² соответственно, хотя статистически значимых различий не выявлено. Основным отличием состояния ткани мочевого пузыря при радиационном поражении было существенно более выраженное нарушение структуры во всех оболочках стенки органа.

Исследование методом нелинейной микроскопии. Использование этого метода позволило более детально изучить состояние соединительнотканного матрикса мочевого пузыря. В нормальном мочевом пузыре коллагеновые волокна четко визуализируются, имеют извитую форму, расположены рыхло и сопровождаются эластическими волокнами. Местами коллагеновые волокна собраны в пучки диаметром 10–15 мкм (рис. 3, ряд 1, а–в).

Рис. 3. Нелинейная микроскопия и гистологическое исследование соединительной ткани мочевого пузыря: норма (ряд 1), лучевой цистит II степени тяжести (ряд 2), лучевой цистит III степени тяжести (ряд 3), хронический цистит (ряд 4); изображения нелинейной микроскопии в режиме ГВГ (столбец а), ДВАФ (столбец б), комбинированное изображение ГВГ + ДВАФ (столбец в); соответствующие гистологические препараты (столбец г), окраска гематоксилином и эозином; черные стрелки указывают на очаг бесструктурной ткани с высоким сигналом ГВГ (ряд 3, а, б, в), что может соответствовать очагу формирующегося гиалиноза (ряд 3, г)

При радиационном поражении мочевого пузыря состояние внеклеточного матрикса зависит от степени тяжести побочных эффектов лучевой терапии. При II степени тяжести коллагеновые волокна собраны в четко очерченные, организованные, компактно упакованные пучки с выделенным направлением (рис. 3, ряд 2, а). Эластические волокна — тонкие, имеют направление, аналогичное коллагеновым пучкам (рис. 3, ряд 2, б). При III степени тяжести лучевых повреждений коллагеновые волокна — размытые, дезорганизованные, сильно извитые, без выделенного направления (рис. 3, ряд 3, а). Эластические волокна — тонкие, четко очерченные, не имеют преобладающего направления, при этом мозаично встречаются сильно разветвленные участки. Наблюдается потеря характерной в норме для эластических волокон извитой формы укладки (рис. 3, ряд 3, б). В подавляющем большинстве изученных препаратов при тяжелой степени лучевых поражений выявлены очаги бесструктурной ткани с высоким сигналом ГВГ (рис. 3, ряд 3, а, стрелка), что свидетельствует о высокой степени анизотропии и плотности данных образований, но без признаков организации. Такая особенность регистрируемого сигнала ГВГ может соответствовать гиалинозу, однако при сопоставлении описанных участков с гистологическими препаратами выявлено, что они при окраске гематоксилином и эозином четко не дифференцируются на фоне фиброзной ткани (рис. 3, ряд 3, г, стрелка).

На изображениях мочевого пузыря при хроническом цистите, полученных методом нелинейной микроскопии, подобных очагов не выявлено. Распределение сигнала ГВГ от коллагена визуализирует размытые, дезорганизованные, плотные пучки без выделенного направления (рис. 3, ряд 4, а). При гистологическом исследовании выявлена фиброзная ткань с воспалительными инфильтратами (рис. 3, ряд 4, г). Эластические волокна — тонкие, их количество заметно уменьшено (рис. 3, ряд 4, б), что может влиять на функциональность мочевого пузыря.

Обсуждение. Основные морфофункциональные особенности, характеризующие ткань мочевого пузыря после воздействия ионизирующего излучения на опухоли женской репродуктивной системы, были выявлены в эксперименте более 30 лет назад: формирование лучевого фиброза, тяжелая эпителиальная гиперплазия, которая чередуется с очагами денудации, фокальный некроз гладкомышечных клеток и их замещение коллагеновыми волокнами за счет гиперплазии последних [20, 23]. В дальнейших исследованиях было показано [24], что в основе формирования ранних и поздних лучевых повреждений лежит нарушение уротелиального барьера за счет гибели узкоспециализированных полиплоидных поверхностных клеток. Также было показано, что одну из ключевых ролей в развитии радиационного повреждения органа играет прогрессирующее нарушение микроциркуляции [21, 25]. Указанные исследования проводились на животных моделях в условиях однократного облучения, что не позволяет в полной мере экстраполировать полученные результаты на оценку состояния мочевого пузыря пациентов, у которых данный орган является органом риска при проведении лучевой терапии.

Особенностью нашей работы стало использование нескольких методик оценки состояния коллаген- и эластинсодержащих структур мочевого пузыря. Стандартное гистологическое исследование с окрашиванием гематоксилином и эозином выявило атрофию и очаговую гиперплазию уротелия, в подлежащей соединительнотканной строме — полнокровие, выраженный отек, кровоизлияния, очаговые инфильтраты из лимфоцитов, плазматических клеток, гистиоцитов, что соответствует изменениям, описанным в работе [24]. Окрашивание пикросириусом красным дает возможность выявить коллагеновые волокна различных типов, что позволяет более детально изучить их структурную и пространственную организацию и помогает в интерпретации изображений, полученных методом нелинейной микроскопии.

Нелинейная микроскопия с детектированием сигнала ГВГ позволяет детально изучить состояние коллагенсодержащих структур биологических тканей без дополнительного окрашивания. Проведенные ранее с использованием данного метода экспериментальные исследования [26, 27] показали, что снижение интенсивности сигнала ГВГ является основным проявлением радиационного повреждения коллагена на ранних сроках после воздействия. В нашем исследовании с помощью нелинейной микроскопии впервые в клинике были изучены особенности состояния коллагенсодержащих структур мочевого пузыря после воздействия ионизирующего излучения по сравнению с хроническим воспалением.

Основным проявлением последствий облучения мочевого пузыря служит формирование фиброза, существенно более выраженного по сравнению с изменениями, наблюдаемыми при хроническом цистите. В поздние сроки после облучения проявления фиброза нарастают по сравнению с более ранними сроками, что также соответствует данным литературы. Была выявлена разница в состоянии коллагеновых и эластических структур при лучевом поражении мочевого пузыря различной степени тяжести, что не удается сделать при стандартном гистологическом исследовании и специфическом окрашивании коллагена пикросириусом красным.

Основным проявлением II степени тяжести лучевых осложнений было образование более плотной и «жесткой» упорядоченной структуры коллагеновых волокон, что является свидетельством преобладания процессов неоколлагеногенеза, т.е. формирования «классического» фиброза. При клинической картине, соответствующей III степени побочных эффектов облучения, наблюдалась выраженная дезорганизация коллагенсодержащих структур, что проявлялось как диффузное снижение сигнала ГВГ, размытость и нечеткость структуры волокон. Кроме того, на изображениях, полученных с помощью нелинейной микроскопии, были выявлены небольшие очаги бесструктурной ткани с высоким сигналом ГВГ, изменения в которых при традиционном гистологическом исследовании четко интерпретировать не удалось. Известно, что в процессе дезорганизации соединительной ткани происходит деполимеризация гликозаминогликанов, разрушение коллагеновых волокон и пропитывание их плазменными белками. По данным В.Н. Павловой с соавт. [28], коллаген при этом образует с фибриногеном и другими веществами плотные нерастворимые соединения. Можно предположить, что на ГВГ-изображениях так проявляют себя очаги деструкции соединительной ткани с развитием фибриноидного некроза [29].

Полученные результаты могут стать основой для разработки новых подходов к визуальной и количественной оценке состояния соединительнотканного матрикса мочевого пузыря после воздействия ионизирующего излучения с помощью неинвазивных оптических инструментов, например кросс-поляризационной оптической когерентной томографии [30].

Заключение. Использование метода нелинейной микроскопии позволяет детально изучить структурные изменения коллагена при лучевом и хроническом циститах и выявить отличия состояния соединительнотканного матрикса в случае неспецифического воспаления и радиационно-индуцированного поражения. Этот метод дает возможность выявить особенности состояния соединительной ткани в зависимости от степени тяжести радиационного поражения, что было невозможно при использовании рутинных методов гистологического исследования.

Финансирование исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №16-07-00655.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.