Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов

При проведении восстановительных и реконструктивных операций все чаще используют аллогенные тканевые трансплантаты. Источником для них могут быть губчатая и кортикальная кость, серозные оболочки (перикард, брюшина, плевра), твердая мозговая оболочка, кожа, кровеносные сосуды [1–3]. В настоящее время аллогенные тканевые трансплантаты активно применяются в травматологии для замещения костных дефектов, в хирургии при герниопластике в качестве фиксирующих антиадгезивных имплантатов, в комбустиологии в виде раневых покрытий [2–5]. Перспективным направлением является использование тканей человека в качестве естественной матрицы при производстве комбинированных трансплантатов [6–8].

Учитывая широкий спектр применения тканевых трансплантатов, особое внимание следует уделять их качеству. Как правило, процедура изготовления тканевого трансплантата включает забор исходной ткани, ее модификацию, стерилизацию и хранение. При этом на каждом из указанных этапов возможно изменение или даже повреждение структуры коллагенового матрикса. Оценить структурную целостность трансплантата можно путем анализа его биомеханических свойств, таких как прочность, упругость, растяжимость [9, 10]. Однако в большинстве случаев оценку качества тканевых трансплантатов проводят с помощью световой микроскопии, используя стандартные гистологические, реже — гистохимические методики [2, 6, 11–13]. В ходе гистологического исследования трансплантата большую роль играет анализ организации компонентов межклеточного матрикса, в первую очередь — коллагеновых волокон, при этом почти не уделяется внимания такому явлению, как автофлюоресценция.

Способность к автофлюоресценции (свечению под действием возбуждающего света в отсутствие специальных флюорохромных красителей) является замечательным свойством коллагена [14, 15], которое определяется его специфическим аминокислотным составом, трехмерной организацией целых молекул, а также комплексов из них (готовых коллагеновых фибрилл или волокон). Поэтому справедливо предположить, что оценка автофлюоресценции коллагена позволит проанализировать внутреннюю топографию тканевых трансплантатов как на стандартных гистологических препаратах, так и при исследовании нефиксированных трансплантатов.

Цель исследования — определить возможность оценки биологических свойств тканевых трансплантатов разных типов с помощью анализа уровня авто­флюоресценции их коллагеновых волокон.

Материалы и методы. Анализ автофлюоресценции коллагена проводили как на гистологических срезах, так и на цельных фрагментах трансплантатов. Исследовали тканевые трансплантаты на основе дермального матрикса (15 разных образцов), перикарда (5 образцов), брюшины (4 образца), твердой мозговой оболочки (4 образца), кортикальной кости (4 образца), которые были изготовлены по известным методикам [3, 4, 16, 17], а также образцы кожи и аорты доноров тканей (по 5 образцов), жидкий коллаген 1-го типа из сухожилий человека и коллагеновые повязки на его основе (10 образцов). Кроме того, исследовали автофлюоресценцию коллагеновых волокон в составе трансплантатов, подвергавшихся дополнительным воздействиям, вызывающим структурные изменения коллагена. Для этого анализировали гистологические препараты следующих типов: нативная кожа доноров тканей (контроль), кожа доноров тканей после 4 ч инкубации в дистиллированной воде (сильная гипотония), кожа доноров тканей после 14 сут хранения в питательной среде для клеток DMEM при 37°C, дермальный матрикс [16], дермальный матрикс, подшитый подкожно лабораторным мышам, через 28 сут эксперимента. Все трансплантаты произведены в отделении консервирования тканей НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. Гистологические препараты исследовали с помощью световой и флюоресцентной микроскопии, цельные фрагменты трансплантатов — с помощью флюоресцентной и конфокальной микроскопии. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону.

Для оценки адгезии клеток человека на тканевых трансплантатах с разным значением средней интенсивности свечения коллагена (mean fluorescence activiti, MFI_кол) использовали фибробласты человека линии М-22 и тромбоциты доноров крови. Фибробласты линии М-22 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США) на 6-луночных планшетах Costar (Corning, США), содержавших образцы трансплантатов, при 37°С и концентрации CO₂ 5% в течение 3–5 сут. В качестве источника тромбоцитов использовали тромбоцитные концентраты, полученные у доноров крови путем автоматического афереза и содержавшие не менее 50% тромбоцитов с гранулами (структурно и функционально полноценные тромбоциты) от их общего числа в пробе. Оценку содержания тромбоцитов с гранулами проводили с помощью оригинального метода, основанного на витальном окрашивании тромбоцитов [17]. Для определения адгезии тромбоцитов на трансплантатах чашки Петри с 2 мл тромбоцитного концентрата и фрагментами тканевых трансплантатов помещали в термостат при 37°С и выдерживали в течение 0,5–1 ч. Для выявления адгезировавших фибробластов М-22 и тромбоцитов применяли разработанные нами методы, основанные на окрашивании клеток витальными флюо­рохромными красителями [17, 18] с дальнейшим их анализом на флюоресцентном микроскопе.

В работе использовали конфокальный микроскоп Nikon Eclipse 80i, совмещенный с флюоресцентной лампой Nikon Intesilight C-HGFi (Nicon Corporation, Япония).

Регистрацию автофлюоресценции коллагена в нефиксированных тканях проводили при синем светофильтре (λ возбуждения — 380–420 нм, λ эмиссии — от 450 нм, время экспозиции — 1 с), в гистологических препаратах — при красном светофильтре (λ возбуждения — 510–560 нм, λ эмиссии — от 575 нм, время экспозиции — 1 с).

Для количественной характеристики автофлюоресценции коллагеновых волокон использовали показатель MFI_кол, который определяли тем же методом, что и при анализе свечения витально окрашенных клеток [18]. Полученные цифровые фотографии переносили в программу Adobe Photoshop 8, выделяли отдельные изображения коллагеновых волокон и определяли интенсивность их флюоресценции в фут-канделах.

Полученные статистические данные обрабатывали с помощью методов вариационной статистики с использованием пакета программ Microsoft Excel 2000. Вычисляли средние арифметические значения (M) и среднеквадратичные отклонения (σ).

Результаты и обсуждение

Анализ автофлюоресценции готовых коллагеновых трансплантатов. Автофлюоресценцию коллагена регистрировали как на цельных фрагментах обследованных трансплантатов, так и на гистологических препаратах, что позволяло видеть контуры коллагеновых волокон, их толщину и ориентацию. На примере геля коллагена 1-го типа, выделенного из сухожилий трупного донора, наблюдали отдельные фибриллы и волокна разного диаметра (рис. 1), при этом более толстые пучки коллагеновых фибрилл имели более высокий уровень автофлюоресценции. Значение MFI_кол отдельных фибрилл варьировало от 8 до 15 фут-кандел, целых коллагеновых волокон — от 20 до 25 фут-кандел, фибриллы почти не контактировали друг с другом. В составе коллагеновых повязок почти весь коллаген был уже собран в волокна, чей уровень MFI_кол также составлял 20–25 фут-кандел, т.е. можно говорить, что в процессе лиофилизации коллагеновых повязок наблюдалась компактизация коллагена. В тканевых трансплантатах значение MFI_кол чаще всего было выше 25 фут-кандел (см. таблицу), достигая наибольшего уровня в трансплантатах твердой мозговой оболочки и кортикальной кости, содержавших очень плотные и толстые волокна. Таким образом, параметр MFI_кол предоставляет возможность оценивать степень компактизации коллагеновых волокон в составе трансплантатов разных типов.

---

Рис. 1. Автофлюоресценция выделенных волокон коллагена 1-го типа из сухожилий доноров тканей; ×400

---

Адгезивные характеристики тканевых трансплантатов в зависимости от интенсивности автофлюоресценции коллагеновых волокон

---

С другой стороны, уровень ком­пактизации коллагена исходной тка­ни может быть изменен при после­дующих воздействиях, в хо­де процедур изготовления тран­сплан­тата. Ис­поль­зование ткане­вых транс­план­татов как в клини­ческой практике, так и при клеточно-тканевом ин­жиниринге часто под­разумевает контакт транс­плантата с факто­ра­ми, способными влиять на струк­туру и топографию колла­геновых волокон в его составе. В насто­я­­щее время очень часто при­ме­няется проце­дура девитали­за­ции транс­план­та­тов (удаление клеточ­ных элементов из их состава) [3–6]. Производство де­витализи­рованных коллагеновых мат­рик­сов основано на исполь­зовании детергентов, растворов с высокой ионной силой и других химически активных веществ, по­тенциально способных нарушить исходную структуру кол­лагена и его топографию.

В настоящей работе влияние девитализации ис­сле­довали на гис­то­логических препаратах дер­мального матрикса, используя в качестве контроля препараты исходной (нативной) кожи доно­ров тканей. Установлено, что в исходной коже химическая фикса­ция трансплантатов значимо не влияла на уровень MFI_кол — на гистологических препаратах кожи доноров тканей можно отчетливо наблюдать автофлюоресценцию коллагена по всей площади среза (рис. 2), при этом наиболее интенсивное свечение отмечено у самых крупных волокон (35–40 фут-кандел). Параллельно регистрировали слабое остаточное свечение цитоплазмы клеток, что может быть обусловлено действием фиксатора формалина, который способен усиливать флюоресценцию. На препаратах дермального матрикса отмечено снижение автофлюо­рес­це­нции основной части волокон (до 28 фут-кандел), хотя в проходящем свете видимые изменения коллагеновых структур не выявлялись (рис. 3, а). Наряду с этим можно было обнаружить фрагменты очень ярких волокон с уровнем MFI_кол свыше 60 фут-кандел (рис. 3, б, г), хотя при окрашивании гематоксилином и эозином такие волокна имели стандартную окраску, т.е. интенсивность автофлюоресценции здесь не была связана с компактизацией волокон. При окраске по Ван-Гизону волокна с MFI_кол ≥60 фут-кандел имели не характерный красный, а бледно-желтый или бледно-оранжевый цвет (рис. 3, в), т.е. были пикринофильными (адсорбирующими пикрин, желтый компонент красителя), чего никогда не наблюдалось в препаратах нативной кожи (см. рис. 2).

---

Рис. 2. Нативная кожа доноров тканей: а, в — окраска гематоксилином и эозином; б, г — автофлюоресценция коллагеновых волокон; ×100 (верхний ряд) и ×400 (нижний ряд)

---

Рис. 3. Дермальный матрикс, полученный из кожи доноров тканей: а, в — окраска по Ван-Гизону; б, г — автофлюоресценция коллагеновых волокон; ×100 (верхний ряд) и ×400 (нижний ряд); стрелками указаны пикринофильные волокна

---

В клеточной биологии пикринофилия волокон рассматривается как явный признак деградации коллагена, нарушения его исходной структуры [19], т.е. в ходе процедуры получения дермального матрикса происходит необратимое разрушение части коллагеновых волокон. Примечательно, что во флюо­рес­центном микроскопе при стимуляции авто­флюо­ресценции коллагена пикринофильные волокна различимы гораздо лучше, чем в проходящем свете, даже при использовании окраски по Ван-Гизону. Это показывает, что на основе анализа авто­флюоресценции появляется возможность выявления сильно поврежденных волокон в составе трансплантатов, чей уровень MFI_кол в норме не превышает 60 фут-кандел. Отметим, что пикринофильные волокна практически всегда присутствовали в образцах дермального матрикса, однако их количество на единицу объема значительно варьировало. Можно заключить, что использованная в нашей работе технология девитализации кожи не нарушает общей топографии коллагена в ее составе, однако способна вызвать деградацию отдельных волокон, а также их частичную деконденсацию.

Влияние дополнительных воздействий на уро­­вень автофлюоресценции коллагеновых транс­­плантатов. На примере геля коллагена 1-го типа было установлено, что выделенные коллагеновые фибриллы не содержат структур с MFI_кол ≥60 фут-кандел. Дальнейшие исследования показали, что инкубация цельных трансплантатов в условиях сильной гипотонии также не приводит к образованию в них пикринофильных волокон. Так, после инкубации образцов кожи тканевых доноров в дистиллированной воде волокна с MFI_кол ≥60 фут-кандел не выявлялись, напротив, наблюдалось снижение интенсивности автофлюоресценции до 15 фут-кандел (рис. 4, а), т.е. в данном случае происходила деконденсация коллагеновых пучков без химической деградации коллагена. С другой стороны, после длительного хранения лоскутов кожи при 37°C волокна с MFI_кол ≥60 фут-кандел выявлялись по всему объему дермы (рис. 4, б), что свидетельствует о полном химическом разрушении коллагена дермы. Оно могло быть обусловлено действием многих протеолитических ферментов, выделяемых разрушающимися клетками в процессе хранения.

---

Рис. 4. Образцы кожи доноров тканей в условиях гипотонии (а) и после длительного хранении при 37°C (б); автофлюоресценция коллагеновых волокон; ×400

---

Лизис коллагеновых волокон особенно отчетливо виден при исследовании фрагментов дермального матрикса, подкожно подшитых мышам. Через 28 сут исследования у большинства животных отмечена интенсивная инфильтрация дермального матрикса клетками воспаления по всему объему трансплантата (рис. 5, а), при этом все волокна в его составе имели MFI_кол от 60 до 90 фут-кандел (рис. 5, б), что говорит о тотальной деградации коллагена. Однако подобная картина наблюдалась не всегда — у некоторых мышей степень инфильтрации дермального матрикса клетками воспаления была низкой (рис. 5, в) и, соответственно, число волокон с MFI_кол ≥60 фут-кандел было значительно меньше, а в отдельных случаях не превышало их исходного уровня в трансплантате (рис. 5, г). Это говорит о том, что потенциально существует возможность приживления аллогенного и ксеногенного дермального матриксов. При этом остается невыясненным, влияет ли уровень пикринофильных волокон в исходном трансплантате на его конечную приживаемость in vivo. Данный вопрос требует дальнейшего исследования.

---

Рис. 5. Дермальный матрикс, подшитый подкожно лабораторным мышам, через 28 сут эксперимента с высокой (а, б) и низкой (в, г) степенью инфильтрации клетками воспаления: слева — окраска по Ван-Гизону, справа — автофлюоресценция коллагеновых волокон; ×100

---

Адгезивная активность клеток на коллагеновых трансплантатах с разным уровнем автофлюоресценции. Незави­си­мо от того, ставится или нет задача полного приживления тканевого трансплантата, большое значение имеет оценка его биосовместимости с нормальными клетками и тканями. В первую очередь это подразумевает отсутствие токсического действия на культивируемые диплоидные клетки человека [6, 10–11, 20]. Кроме того, важным свойством тканевых трансплантатов являются их адгезивные характеристики. В зависимости от поставленных целей требования к адгезивности трансплантатов могут варьировать. Так, при клеточно-тканевом инжиниринге, производстве комбинированных биотрансплантатов используемая в их основе коллагеновая матрица должна быть высокоадгезивной для клеток. Напротив, при ряде хирургических вмешательств, таких как герниопластика, тканевые трансплантаты должны обладать антиадгезивными свойствами. На примере использования линии диплоидных клеток человека (фибробласты М-22) и тромбоцитов человека нами выявлено, что адгезивность коллагеновых матриксов зависит в том числе и от плотности упаковки коллагена в их составе (см. таблицу). Максимально выражены адгезивные свойства у трансплантатов с MFI_кол ≥30 фут-кандел, т.е. именно такие коллагеновые трансплантаты наиболее пригодны для использования в качестве матрицы при создании клеточно-тканевых конструкций. Адгезивность трансплантатов резко падает при MFI_кол, равном 40 фут-кандел и выше, — на таких трансплантатах слабо адгезировали фибробласты и совсем не адгезировали тромбоциты. Клетки обоих указанных типов полностью отсутствовали in vitro на образцах трансплантатов твердой мозговой оболочки, которые в настоящее время считают весьма перспективными при лапароскопической герниопластике, пластике передней брюшной стенки при лечении вентральных грыж [1]. Вместе с тем есть данные, что трансплантаты на основе твердой мозговой оболочки могут быть in vitro заселены хондробластами человека [5], т.е. по отношению к хондробластам твердая мозговая оболочка не обладает антиадгезивными свойствами. Таким образом, при оценке биосовместимости тканевых трансплантатов с помощью клеточных культур необходимо в том числе учитывать тип используемых клеток.

Заключение. Анализ автофлюоресценции позволяет не только выявить коллагеновые волокна в составе соединительных тканей, но также оценить их структурную целостность и компактность. В отсутствие специального окрашивания флюорохромами регистрация автофлюоресценции коллагена может дать важную информацию о топографии соединительной ткани, сохранности межклеточного матрикса, а также позволит оценить его повреждение, в том числе — в нефиксированных тканях и трансплантатах. Это создает возможность динамического анализа коллагеновых структур при работе с клеточными культурами invitro, при разработке и изготовлении новых типов комбинированных биотрансплантатов.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.