Новые флюоресцентные зонды для выявления амилоида

Сформировавшиеся благодаря работам Жана Мари Лена представления о том, что крупные органические молекулы могут взаимодействовать между собой как макрообъекты без образования сильных химических связей, образуя при этом фактически новое вещество — супрамолекулярную структуру, послужили основой для формирования нового суждения о строении и взаимодействии органических соединений. Один из относительно недавно обнаруженных видов супрамолекулярного взаимодействия заключается в том, что части молекул некоторых органических веществ небелковой природы могут совершать направленное вращение друг относительно друга в результате нарушения -сопряженных связей внутри молекулы под воздействием внешней энергии [1], что получило название «молекулярный ротор». Такое поведение молекул оставалось бы просто молекулярным курьезом, если бы не свойство роторов при торможении вращения средовым молекулярным окружением переизлучать накопленную потенциальную энергию в видимом световом диапазоне. При этом встраивание молекулярного мотора, если он сам по себе является флюорофором, в какую-либо супрамолекулярную структуру сопровождается батохромным смещением. То есть спектр излучения вещества смещается в красную сторону, что является доказательством встраивания. Это свойство позволяет идентифицировать среду, с которой специфично связывается такой флюорофор: есть связывание — есть свечение, нет связывания — нет свечения. Справедливо противоположное утверждение: если какое-то вещество, связываясь с такой средой, начинает флюоресцировать более интенсивно, чем без связывания, и наблюдается батохромный эффект, то оно является молекулярным ротором.

В качестве одного из таких веществ выступает специфичный флюоресцентный лиганд амилоида — тио­флавин. Как полагают, низкий квантовый выход индуцированного ультрафиолетом свечения тиофлавина в маловязких средах обусловлен вращательным движением бензотиазольного и N,N-диметиламинового колец друг относительно друга. При встраивании тиофлавина в структуру амилоида происходит значительное увеличение квантового выхода [1, 2]. В процессе изучения взаимодействия тиофлавина с амилоидом было установлено, что он служит селективным разрушителем амилоида, по крайней мере in vitro [3]. В связи с этим в ряду производных тиофлавина был начат поиск веществ, перспективных для использования в качестве средства диагностики амилоидоза [4], а также в качестве лекарственных средств для лечения амилоидозов [5], поскольку эффективных методов своевременной диагностики, профилактики и терапии этого заболевания до настоящего времени не разработано. Более того, не выявлено предикторов, позволяющих выделить группы больных, у которых течение основного заболевания осложнится развитием амилоидоза.

Тиофлавин не производится в Российской Феде­рации и закупается за рубежом. В соответствии с технологическим паспортом, предоставляемым вместе с препаратом фирмой-производителем (Santa Cruz Biotechnology, США), ЛД₅₀ тиофлавина при пероральном приеме у мышей составляет 151 мг/кг массы. В соответствии с ГОСТ 12.1.007–76 и СанПиН 2.1.4.1074-01 он относится к третьему классу токсичности — умеренно опасным веществам (диапазон 151–5000 мг/кг массы). С учетом разброса вариационного ряда этот препарат может попадать во второй класс токсичности, что исключает возможность его медицинского применения. Данный вывод был подтвержден нами в предварительных исследованиях токсичности тиофлавина [6], в которых подкожное введение мышам препарата в дозе 50 мг/кг сопровождалось 100% летальностью. По этой причине и в связи с малым количеством дорогостоящего реактива было принято решение использовать его только как постмортальный краситель без уточнения токсичности при парентеральном введении. Поскольку анти­амилоидный эффект тиофлавина, как предполагается, обусловлен супрамолекулярным взаимодействием с амилоидом [3], его фармакологическая эффективность должна находиться в прямой количественной зависимости от вводимой дозы. По этой причине использование тиофлавина или его близких производных в качестве лекарственных средств кажется бесперспективным.

Тем не менее можно предположить существование веществ, близких по химической структуре к тиофлавину, не являющихся бензотиазольными производными, однако имеющих аналогичные свойства молекулярных моторов, которые можно использовать в качестве флюорофоров для выявления амилоида.

Цель исследования — поиск флюорофорных меток, селективных к амилоиду, среди веществ, имеющих химическую структуру, близкую к тиофлавину.

Материалы и методы. Сотрудниками кафедры биологии и химии ЧГПУ им. И.Я. Яковлева и медицинского факультета ЧГУ им. И.Н. Ульянова был осуществлен дизайн молекулы молекулярного ротора на основе структуры азатрициклодецена, завершившийся синтезом производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.11.7.02.6]дец-8-енов (формула 1а–д), для использования в качестве перспективных флюоресцентных зондов, селективных к амилоиду:

где Y=2 — NO₂ (a), 3 — NO₂ (б), 4 — NO₂ (в), 3 — COOH (г), 4 — СООН (д).

Синтез исследуемых веществ (1а–д) осуществляли взаимодействием легкодоступных N-арил-2,5-дигидропиррол-2,5-дионов с фуран-2-карбальдегидом при эквимольном соотношении реагентов при комнатной температуре [6, 7]. В качестве растворителя использовали абсолютный 1,4-диоксан. Чистоту синтезированных продуктов контролировали по данным тонкослойной хроматографии, а структуру подтверждали методами ИК-, ЯМР ¹Н-спектроскопии. Соединения (1а–д) представляют собой кристаллические вещества светло-желтого или оранжевого цвета, константы и данные элементного анализа которых приведены в табл. 1.

---

Таблица 1. Выходы, константы и данные элементного анализа

---

Эксперименты с окрашиванием амилоидных депозитов проведены на обезличенных 5 мкм парафиновых срезах почек человека, предоставленных Республиканским бюро судебно-медицинской экспертизы (Чебоксары, Россия), где клинически установленный диагноз амилоидоза был подтвержден патогистологически. Три серии депарафинированных срезов были предварительно окрашены гематоксилином. Контрольная (первая) серия была окрашена тиофлавином Т по Вассару [8].

Вторая серия срезов после окраски гематоксилином была в течение 3 мин дополнительно обработана спиртовыми растворами исследуемых препаратов 1а–д, третья серия — водно-спиртовыми. Спиртовые 1,5% растворы приготавливали путем растворения навески препаратов при комнатной температуре в 96º спирте, водно-спиртовые — путем разбавления полученного спиртового раствора 1% водным раствором NaOH 1:1 по объему (рН>7), финальная концентрация препаратов составляла 0,75%. После окрашивания срезы были промыты водой, обезвожены и заделаны в полистирол.

Микроскопию срезов проводили на микроскопе «Люмам-4» («Ломо», Россия). Флюориметрию осуществляли с помощью микролюминиметра ФМЭЛ-1А («Ломо», Россия), запирающий светофильтр ЖС18, l_возб.=410 нм, светофильтры ФС, БС, СЗС. Электрические параметры на всех замерах были одинаковыми: входное напряжение — 900 В, сопротивление усилителя — 10⁶ Ом. В насадке был установлен зонд 0,5. Для измерения использовали ФЭУ-39, показания снимали с цифрового вольтметра, данные представлены в милливольтах (мВ). Микрофотографии получены с помощью цифровой камеры Levenhuk C800 NG 8M (Levenhuk, США).

Результаты и обсуждение. В соответствии с современными представлениями, амилоид представляет собой нанотрубку, образующуюся в результате агрегации короткоцепочечных (38–42 аминокислотных остатка) мономерных фрагментов, осуществивших дисфолдинг в β-складчатую конформацию. Образование β-листа в данном частном случае имеет энергетический выигрыш, поскольку физиологическая конформация пептида — предшественника амилоида — метастабильна, т.е. имеет некоторый избыток максимума энергии. Сброс избыточной энергии осуществляется в результате самоукладки в β-лист, конформация которого отвечает условию минимума энергии при данных химических условиях среды и потому стабильна [9, 10] (рис. 1).

---

Рис. 1. Модель связывания конго красного [11] и тиофлавина Т [12] с амилоидными фибриллами: амилоид сворачивается в β-складчатый лист, при этом каждая пятая цепочка белка имеет одинаковое N–C-направление. Длина молекулы конго красного составляет ≈19 Å, поэтому ее отрицательно заряженные сульфатные группы связываются с положительно заряженными остатками аминокислот в первой и пятой полипептидных цепях β-складчатого листа амилоида. Следующая молекула красителя связывается с третьей и седьмой цепочками и т.д. [11]. В молекуле тиофлавина, имеющей линейные размеры: длина — 15,2±0,14 Å, ширина бензотиазольной части — 6,1±0,1 Å, диметилзамещенной анилиновой части — 4,3±0,1 Å, в жидкой среде происходит вращение анилинового кольца относительно бензотиазольного. Вращение осуществляется за счет тепловой энергии внешней среды. Встраивание молекулы тиофлавина в бороздки β-листа амилоида возможно вследствие идеальной комплементарности этих молекулярных структур. Заклинивание молекулы тиофлавина в бороздке β-листа прекращает вращение частей этой молекулы друг относительно друга, но не накопление внешней энергии в p-сопряженных связях. Поскольку возможность преобразования накопленной энергии в механическое вращение в образованной супрамолекуле невозможна, происходит ее переизлучение в видимом диапазоне. Данная модель объясняет специфичность взаимодействия конго красного и тиофлавина Т с амилоидными фибриллами и демонстрирует различия связывания этих красителей с амилоидом

---

В результате взаимопараллельной укладки нитей из 38–42 аминокислотных остатков создается регулярная структура — нанотрубка диаметром 10–20 нм и длиной до 1000 нм [13], способная к супрамолекулярным взаимодействиям. Она находится в состоянии энергетического минимума и более устойчива к действию пептидаз, чем исходный белок. По этой причине амилоид накапливается в тканях. При классической окраске амилоидных депозитов в тканях конго красным методом световой микроскопии амилоид обнаруживается в виде кирпично-красных образований как в цитоплазме некоторых клеток, так и в межклеточном пространстве (рис. 2, а, б).

---

Рис. 2. Окраска конго красным: световая микроскопия — амилоидные депозиты в канальцах (а) и почечных клубочках (б); флюоресцентная микроскопия (тот же препарат) — амилоидные депозиты в канальцах (в); ×20; окраска тио­флавином Т — амилоидные депозиты в канальцах (г) и клубочке (д); ×40. При флюоресцентном исследовании (в) амилоидные депозиты, меченные конго красным, выглядят как гомогенные объекты темно-красного цвета. Ткани, не содержащие амилоида, не светятся, что свойственно для не имеющих ауто­флюоресценции депарафинированных срезов тканей. Здесь: Кл — клубочки, Кн — канальцы, Э — эпителий канальцев

---

Конго красный способен к индуцированной ультрафиолетом крас­ной флюоресценции в видимом диапазоне (рис. 2, в). Однако квантовый выход этой флюоресценции настолько низок, что она представляет только теоретический интерес и не нашла широкого практического применения. Установ­лено, что конго красный встраивается только в торцы амилоидных β-листов (см. рис. 1). Поскольку амилоид представляет собой агрегаты таких β-листов, образующих нанотрубочки, которые связываются с полисахаридами соединительной ткани, трудно ожидать, что конго красный будет взаимодействовать со всеми местами специфичного связывания. Следовательно, трудно ожидать наличия параметрических характеристик такого связывания в ткани. Тем не менее окраска конго красным как достаточно простой и высокоспецифичный метод окрашивания амилоида продолжает оставаться клинически важным эталоном сравнения, позволяющим верифицировать спе­ци­фичность других методов окраски амилоида.

Второй, редко используемый в Российской Федерации, но высокоспецифичный метод выявления амилоида — флюоресценция с тио­флавинами Т или S (рис. 2, г, д). При окрашивании этим красителем амилоид выглядит как зелено-коричневые флюоресцирующие объекты. На препаратах почки амилоидные депозиты в просвете канальцев и амилоид цитоплазмы эпителия канальцев выглядят как ярко-зеленые, практически однородные объекты. В стенках сосудов и между капиллярными петлями почечных клубочков амилоид светится менее интенсивно-коричневатым оттенком. Участки тканей, не содержащие амилоид, выглядят темно-зелеными, практически черными. Клеточные ядра дифференцируются как округлые несветящиеся объекты.

Встраивание тиофлавина в структуру β-листа амилоида отличается от взаимодействия с амилоидом конго красного (см. рис. 1). Если конго встраивается в торец β-листа, то тиофлавин, возможно, укладывается в складки β-листа (стрелки на рис. 1), что прекращает вращение его диметиламинобензольного кольца относительно бензатиазольного. Максимум флюоресценции тиофлавина приходится на 534 нм. Интенсивность свечения интактных тканей составляет 0,014±0,003 мВ, пораженных амилоидом клубочков — 0,046±0,015 мВ, эпителия канальцев — 0,053±0,012 мВ, амилоидных депозитов в просвете канальцев — 0,72±0,20 мВ. Высокий размах вариационного ряда свидетельствует о том, что интенсивность флюоресценции амилоида, меченного тиофлавином, значительно различается в разных участках ткани почки, а это в свою очередь может свидетельствовать о наличии концентрационной зависимости. Сравнение структуры синтезированных нами соединений 1а–д и тиофлавина Т (см. рис. 1) показывает, что они близки. Если в тиофлавине функцию «якоря» выполняет метильная группа при азоте бензотиазольного кольца, то в наших соединениях — метилальдегидная группа.

У исследованных препаратов 1а–д в сухом кристаллическом виде максимум флюоресценции отмечался в диапазоне 421,0–436,5 нм (рис. 3).

---

Рис. 3. Сопоставление флюоресценции сухих кристаллов исследуемых флюорофоров (левая шкала) и связанных с амилоидом на препаратах почки (правая шкала). Наблюдается выраженный батохромный сдвиг флюоресценции при связывании с амилоидом

---

Ни спиртовой, ни водно-спиртовой растворы этих веществ в диапазоне концентраций от 0,75 до 1,5% регистрируемой флюоресценции с помощью ФЭУ-39 не обнаруживали. После обработки срезов амилоидной почки препаратами 1а–д наблюдается интенсивная флюоресценция с максимумом в области 534 нм, т.е. связывание этих веществ с амилоидными депозитами сопровождается выраженным батохромным сдвигом (рис. 4).

---

Рис. 4. Результаты окрашивания парафиновых срезов амилоидной почки препаратами (1а–д), ×40: препарат 1а — амилоидные депозиты в канальцах (а) и клубочках (б); препараты 1б (в), 1в (г), 1г (д) — амилоидные депозиты в клубочках; препарат 1д — амилоидные депозиты в канальцах (д, е)

---

Меньшее по интенсивности свечение обнаруживалось в клубочках с хорошо выявляемым париетальным листком капсулы и темно-зелеными депозитами амилоида, расположенными между петель клубочка, эпителием канальцев и эндотелием артериол. Обнаруживаемое свечение равномерно располагалось в цитоплазме клеток. Клеточные ядра выглядели как темные нефлюоресцирующие овальные объекты.

Интенсивность флюоресценции исследуемых препаратов в структурах почки (табл. 2) значительно не различается, что объясняется близостью их химического строения.

---

Таблица 2. Интенсивность флюоресценции исследуемых препаратов 1а–д, мВ

---

Все препараты 1а–д предположительно должны иметь низкую токсичность, поскольку ранее проведенное исследование острой токсичности азатрициклодеценов [6] позволило отнести эту группу соединений к четвертому классу токсичности.

Заключение. Исследованные препараты 1а–д, растворенные в водно-спиртовой среде, при рН>7, проявляют свойства селективных к амилоиду флюорофоров. Связывание препаратов 1а–д с амилоидными депозитами сопровождается резким увеличением интенсивности флюоресценции по сравнению с их водно-спиртовыми растворами и выраженным батохромным сдвигом. Данное обстоятельство позволяет утверждать, что механизм реализации флюоресцентных свойств новых изученных веществ реализуется аналогично тио­флавину Т. Учитывая дешевизну исходных веществ, необходимых для синтеза препаратов 1а–д, простоту и дешевизну самого синтеза, высокий квантовый выход, простоту окрашивания препаратов, а также вероятную низкую токсичность, можно утверждать, что все предлагаемые вещества имеют хорошую перспективу использования в качестве новых флюорофоров для выявления амилоида.

Финансирование исследования. Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий, договор 0004043.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.