Биоинженерные конструкции на основе фиброина шелка и спидроина для регенеративной медицины и тканевой инженерии (обзор)

Выбор материала для регенеративной медицины, а также технология изготовления из него биоконструкций зависят от области применения: костная ткань, кровеносные сосуды, кожа, мышечная ткань, нервные волокна. Для успешного использования биоматериал должен обладать определенными химическими, биологическими и механическими свойствами [1, 2]. К требуемым химическим свойствам относят отсутствие вредных химических реакций с тканями и межтканевыми жидкостями, резорбцию с контролируемой скоростью внутри организма [3]. Необходимыми механическими свойствами являются прочность конструкции и возможность осуществлять хирургические манипуляции. Главной биологической характеристикой материала служит его биосовместимость с организмом. Всеми этими достоинствами обладают основной белок шелка шелкопрядов (фиброин) и каркасный белок шелка паутины (спидроин).

Структура и свойства биополимеров

Фиброин шелка. Фиброин является основным белком шелка, который получают из коконов шелкопряда Воmbух mori и родственных видов. Он представляет собой гетеродимер, состоящий из двух ковалентно связанных через дисульфидные мостики цепей [4, 5]. Гликозилированный белок P25 с массой 30 кДа объединен с Fib-L и Fib-H гидрофобными связями [6]. Предполагается, что этот комплекс может формироваться из 6 тяжелых и 6 легких цепей на одну молекулу гликозилированного белка P25 [7]. Легкая и тяжелая цепи фиброина, а также белок Р25 кодируются в геноме отдельно [4]. Первичную последовательность фиброина составляют глицин (43%), аланин (30%), серин (12%) [8]. В меньшем количестве в него входят тирозин (5%), валин (2%), аспартат, глутамат и цистеин, который выполняет главную интегрирующую роль в объединении разных субъединиц в одну молекулу. Глицин, аланин и серин составляют основную структурную последовательность Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser тяжелой цепи Fib-H — 70% всей белковой последовательности [9]. Встречаются похожие последовательности: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Tyr (20%), Gly-Ala-Gly-Tyr-Gly-Ala (6%), Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala (4%), которые образуют основу 12 регулярных гидрофобных кристаллических блоков, длина каждого из них 413 аминокислотных остатка. Эти 12 блоков — 94% общей белковой последовательности, и разделяются они 11 нерегулярными аморфными промежуточными участками длиной в 42–43 аминокислотных остатка с отрицательным зарядом [8].

Натуральный шелк не растворяется в воде, а также в разбавленных растворах многих кислот и щелочей, но растворим в концентрированных растворах хлорида лития, тиоцианата лития и кальция, хлорида кальция. Благодаря тому, что фиброин способен формировать α-спирали и β-складки, он существует в нескольких структурных формах: 1-я — рыхлая, глобулярная, нестабильная и механически непрочная; 2-я — обогащенная α-спиралями аморфной формы (silk I), устойчивая и упругая; 3-я — кристаллическая β-форма (silk II) — обладает самой высокой прочностью на разрыв, устойчива к сильным механическим воздействиям, однако менее упругая, чем α-форма [8]. Фиброин способен длительно сохранять кристаллическую структуру [10]. Насыщенная β-структурами форма белка задает и поддерживает конструкцию имплантата, создаваемого из фиброина шелка, обеспечивает ее целостность и стабильность в близких физиологической среде организма водных растворах [11]. В связи с этим конструкции из фиброина перед применением необходимо подвергать β-кристаллизации в среде культивирования или в условиях in vivo. Доля фиброина в шелковой нити составляет 70–80% массы белка, остальная часть — это серицин, который выполняет роль клея, скрепляя фибриллы фиброина в коконе, а также несколько процентов жиро- и воскоподобных веществ и неорганических анионов и катионов (менее 1%) [12, 13].

Фиброин является термостабильным белком, температура его денатурации выше 127°С. Модуль упругости фиброина равен 15–17 ГПа, белок обладает высокой прочностью на разрыв (610–690 МПа). Фиброин характеризуется высокой прозрачностью, его способность пропускания видимого спектра излучения составляет 90–95%, а коэффициент преломления фиброиновых пленок равен 1,55 при толщине 30–50 мкм [14].

Фиброин применяется в регенеративной медицине в качестве материала для изготовления матриксов [15, 16], пленок [17], а также входит в состав конструкций для доставки лекарственных и биологически активных веществ в организм [18, 19]. Кроме того, он обладает антимикробной активностью, поэтому может быть рекомендован к использованию в качестве нового природного антибактериального био­материала [20].

Спидроин. Каркасный шелк паутины синтезируется пауками [21]. Наиболее изучены свойства паутины пауков рода Nephilа, представителем которого является Nephila clavipes, синтезирующий паутину нескольких видов [21, 22]. Основными ампулярными железами он вырабатывает каркасный шелк паутины, чьи нити очень эластичны, характеризуются высокой прочностью на разрыв, сопоставимой с кевларом и превышающей сталь, что делает его уникальным среди других природных, а также большей части искусственных материалов [23]. Шелк паутины устойчив к условиям внешней среды, обладает высокой биосовместимостью и способностью к биодеградации. Такие свойства объясняются структурой материала. В состав каркасной нити входят два ковалентно связанных белка: спидроин 1, который кодируется геном MASP1 (образует кристаллические β-складчатые структуры), и спидроин 2, кодирующийся геном MASP2 (образует аморфный матрикс).

Спидроины — высокомолекулярные белки: молекулярная масса выделенных спидроинов — 300–350 кДа, димерных форм — 550–650 кДа [24]. Спидроины имеют периодическое строение с большим числом прямых повторов [25]. Первичная последовательность, обогащенная полиаланиновыми и насыщенными глицином последовательностями, формирует неоднородную вторичную структуру, а сегменты кристаллического строения, состоящие из антипараллельных β-складчатых структур, чередуются с менее структурированными участками так называемого аморфного матрикса [26]. Этот матрикс, богатый глицином, представляет собой спиральные участки и случайные петли, но при этом не является бесструктурным, так как его макромолекулы ориентированы преимущественно параллельно вертикальной оси спидроиновых фибрилл [27].

Существует два типа кристаллических доменов: плотно упакованные и строго ориентированные β-складчатые, а также свободно расположенные складчатости. В формировании кристаллических доменов участвует 90% аланиновых остатков, а β-складчатые структуры расположены параллельно оси волокна. В высокоупорядоченных областях метильные группы аланиновых остатков ориентированы относительно осей цепей строго под углом 90°. В менее упорядоченных — метильные группы аланиновых остатков не имеют строгой ориентации относительно оси волокна и обладают большей возможностью для пространственной переориентации [27]. Кристаллические части макромолекулы отвечают за высокую прочность на разрыв, а аморфный матрикс — за эластичность. У кристаллических доменов и аморфного матрикса нет четких структурных границ. Макромолекула спидроина способна к структурным переходам, уменьшая или увеличивая кристалличность. Изменяя условия прядения, можно влиять на эти переходы [28]. Каркасные нити паутины обладают высокой термостабильностью (до 230°С). При 210°С начинается плавление основных кристаллических доменов, их предел прочности на разрыв равен 22 ГПа, а на растяжение — 1,1 ГПа, относительное удлинение — 9% [29]. В связи с наличием дефектов и колебаниями толщины получаемой нити механическая прочность натуральных белков может изменяться. Структура паутинной нити изменяется при хранении: в течение года после получения улучшаются показатели механической прочности и эластичности, однако она подвержена старению из-за распада аминных групп, поэтому при увеличении времени хранения падает прочность и эластичность [30]. Кроме того, к старению приводит ультрафиолетовое излучение [31]. Влажность среды влияет на степень гидратации нитей, что также сказывается на механических свойствах белков за счет изменения характера водородных связей между белковыми цепями [32]. При максимальной степени гидратации 2/3 массы нити составляет вода, которая связывается в основном аморфным матриксом [22]. Влажность оказывает положительное влияние на показатели растяжения, а также на модуль упругости.

Существуют рекомбинантные аналоги природных спидроинов, которые получают синтезом в клетках дрожжей Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae, клетках млекопитающих, а также с использованием трансгенных животных и растений [33–35]. Рекомбинантные аналоги отличаются от натуральных материалов меньшей механической прочностью, которую впоследствии можно увеличить различными химическими и механическими методами — путем вытягивания нитей в метаноле [36] или кристаллизацией [37]. Введение дополнительных полинуклеотидных последовательностей в гены, кодирующие спидроины, также помогает модифицировать свойства материалов из рекомбинантных белков [38, 39]. На основе рекомбинантных аналогов можно создавать сополимеры, свойства которых будут отличаться от свойств нативных белков. Благодаря своим характеристикам каркасные белки паутины применяют для изготовления изделий в области регенеративной медицины [40].

Для полного понимания уникальности двух названных биополимеров и объективной оценки их преимуществ следует рассмотреть другие полимеры и сравнить их с фиброином шелка и спидроином.

Синтетические полимеры

Одними из первых в области тканевой инженерии начали использовать биодеградируемые синтетические биоматериалы на основе полимеров органических кислот.

Полигликолевая кислота — биоразлагаемый, термопластичный полимер, самый простой линейный алифатический полиэфир [41]. Одним из преимуществ этого материала является способность присоединения дополнительных химических цепочек, приводящих к появлению новых свойств, что увеличивает диапазон применения. Благодаря своей кристаллической структуре этот полимер нерастворим в воде, его пластичность возрастает с повышением влажности, что позволяет легко формировать биоконструкции [42]. В настоящее время полигликолевая кислота широко применяется для создания хирургического шовного материала [43, 44]. Хирургические нити из полигликолевой кислоты не требуют удаления после операции. Они полностью рассасываются внутри организма в течение нескольких месяцев, растворяясь до углекислоты и воды.

Полилактид представляет собой алифатический полиэфир, мономером которого выступает молочная кислота. Он обладает термопластичностью, является биоразлагаемым и биосовместимым [45]. Из полилактидов изготавливают биоразлагаемые упаковки, средства личной гигиены, конструируют винты, пластины и штифты, фиксирующие переломы, хирургические нити [46], также их применяют при создании лекарственных препаратов. Инкапсулированные в полилактид противомикробные вещества в различных концентрациях медленно и постепенно высвобождаются, предотвращая рост микроорганизмов [47]. Полилактид выступает в качестве исходного материала для печати в 3D-принтерах [48].

Поликапролактон — биоразлагаемый полиэфир, полимер ε-капролактона. Поликапролактон устойчив к воде, растворителям и различным маслам, а также характеризуется низкой вязкостью и легко поддается обработке. При смешивании с крахмалом снижается его стоимость и повышается биоразлагаемость [21]. В медицине поликапролактон используют как шовный материал [49], а также в качестве носителя для доставки лекарств в организм [50], в косметологии — для изготовления филлеров [51, 52].

Полиэтилентерефталат (ПЭТФ) — биоинертный термопластик, в аморфном состоянии — твердое, бесцветное и прозрачное вещество, в кристаллическом — непрозрачное и белое [53]. При нагревании до температуры стеклования происходит его переход в прозрачное состояние, в котором материал и остается при резком охлаждении. Длина молекулы полимера влияет на вязкость ПЭТФ, — чем больше вязкость, тем ниже скорость кристаллизации [45, 54]. ПЭТФ практически нерастворим в воде и органических растворителях, устойчив к кислотам и слабым растворам щелочей, довольно прочен, износостоек и является диэлектриком. Изменяя химический состав боковых групп молекул полимера, можно производить материалы с разной скоростью деградации [54]. В медицине ПЭТФ используют для изготовления протезов костных сосудов [55], сухожилий, связок, клапанов сердца [56].

Полиамиды представляют собой пластмассу, в основе которой находятся линейные синтетические высокомолекулярные соединения. Алифатические полиамиды в расплавленном состоянии имеют низкую вязкость в небольшом температурном интервале [57], обладают высокой температурой плавления. Полиамиды характеризуются гидрофильностью [58], и их водопоглощение оказывает существенное влияние на ударную вязкость и прочность [59]. Из полиамидных волокон изготавливают хирургические нити, протезы кровеносных сосудов [60, 61].

Полиуретаны — гетероцепные полимеры, которые являются синтетическими эластомерами и содержат незамещенные или замещенные уретановые группы [62]. Полиуретаны устойчивы к воздействию кислот, минеральных масел и окислителей, они гидролитически более стойкие, чем полиамиды. В медицине полиуретаны применяют для изготовления имплантатов [63, 64], катетеров и трубок общего назначения [65], хирургических простыней и салфеток.

Силиконы — высокомолекулярные кислородсодержащие кремнийорганические соединения, включающие в себя полиорганосилоксаны (силиконовые масла, гидрофобизаторы, низкомолекулярные каучуки) и кремнийорганические мономеры (силаны) [66, 67]. На основе молекулярного веса, степени сшивки, вида и количества органических групп у атомов кремния силиконы можно разделить на три группы: силиконовые жидкости, у которых менее 3000 силоксановых звеньев; силиконовые эластомеры, содержащие от 3000 до 10 000 звеньев; силиконовые смолы с более чем 10 000 силоксановых звеньев, обладающие довольно высокой степенью сшивки [68, 69]. Силиконы имеют большое количество уникальных свойств. Они увеличивают или уменьшают адгезию белков и клеток, могут придавать материалам гидрофобность, сохраняют свойства при экстремальных температурах, а также их быстрых перепадах, обладают диэлектрическими качествами, химически и биологически инертны, эластичны, экологичны и нетоксичны [70, 71]. Изделия из силиконов резистентны к воздействию радиации, ультрафиолетового излучения, электрических полей.

Природные полимеры

При изготовлении биоконструкций полимеры природного происхождения имеют значительные преимущества перед синтетическими полимерами. Продуктами распада таких материалов в организме являются естественные метаболиты, участвующие в биохимических процессах внутри клеток, поэтому био­совместимость природных полимеров значительно выше. Их механические характеристики не уступают свойствам изделий из синтетических полимеров.

Коллаген представляет собой фибриллярный структурный белок межклеточного матрикса, который является самым распространенным в организме млекопитающих (25–35% от общего количества белка в организме) и служит основой соединительной ткани, придавая ей эластичность и прочность. Молекула коллагена — это правозакрученная спираль из трех α-цепей, один виток которой включает три аминокислотных остатка. Благодаря содержанию аргинин-глицин-аспартат-последовательностей (RGD-последовательностей) в первичной структуре коллаген является биоматериалом, обеспечивающим адгезию клеток [72, 73]. Он обладает низкими аллергенными свойствами, нетоксичен, но нерегулируемое и быстрое время биодеградации существенно сокращает срок функционирования коллагеновых изделий до 1 мес. При введении в организм коллаген стимулирует репаративные процессы [74], способствуя образованию собственного коллагена, однако не обеспечивает полной регенерации органа, поскольку рано рассасывается и образует рубцовую ткань. Формирование гетерогенной надмолекулярной структуры коллагенсодержащего геля [75, 76] позволяет замедлить био­деградацию. Коллаген обладает гемостатическими свойствами, поэтому его применяют при изготовлении искусственных клапанов и сосудов [77, 78].

Желатин — продукт гидролиза коллагена. Пористые желатиновые трубки [79] используют как субстрат для зрелых мезенхимных стволовых клеток и гепатоцитов у крыс [80]. Установлено, что благодаря имплантации микросфер из желатина может поддерживаться рост церебральных нейронов, скелетных мио­бластов и кардиомиоцитов [81].

Хитин (поли-N-ацетил-D-глюкозамин) — азотсодержащий полисахарид, полимер из остатков N-ацетилглюкозамина, между которыми расположены бета-[1,4]-гликозидные связи. Хитин — самый распространенный природный полисахарид. Он является основным компонентом экзоскелета некоторых беспозвоночных [82], содержится в клеточных стенках грибов и бактерий, выполняет защитную и опорную функции [83]. Хитин — жесткий полупрозрачный полимер, он нерастворим в воде, устойчив к воздействию разбавленных кислот, щелочей, спирта и к другим органическим растворителям.

Хитозан — аминополисахарид 2-амино-2-дезокси-b-D-глюкана, образующийся при деацетилировании хитина. Хитозан может связывать большое количество органических водорастворимых веществ, например бактериальные токсины, поскольку способен создавать водородные связи. В растворенном виде он обладает большим сорбирующим действием [84]. Жиры, жирорастворимые соединения, предельные углеводороды связываются хитозаном благодаря эффекту молекулярного сита, а также гидрофобным взаимодействиям. С помощью таких микробных ферментов, как хитиназа и хитобиаза, хитин и хитозан расщепляются до N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозамина, поэтому они являются экологически чистыми материалами. Хитин и хитозан используют для создания искусственных кровеносных сосудов, катетеров, шовных материалов. Из них изготавливают раневые, ожоговые, заживляющие покрытия и адгезивы [85], они входят в составы конструкций для доставки лекарств [86, 87]. Из хитозана формируют устойчивые и прочные изделия (пленки, губки, мембраны) [88], однако они термически нестабильны, что усложняет их стерилизацию. В связи с этим изделия добавляют как дополнительные компоненты в композитные матриксы, а хрупкость уменьшают за счет пластификаторов: глицерола, лауриновой кислоты, молочной кислоты, полиэтиленгликоля [89].

Бактериальные полиоксиалканоаты — полиоксибутираты (полимеры β-оксимасляной кислоты) — класс полиэфиров, которые представляют собой внутриклеточные резервные соединения в гетероцистах у цианобактерий [90]. Полиоксиалканоаты различного химического состава имеют разнообразную структуру и отличаются физико-химическими свойствами. Наиболее часто исследуют гомогенный полиоксибутират и двухкомпонентные сополимеры оксибутирата и оксивалерата, оксибутирата и оксиоктаноата. Их физико-химические свойства сходны с полиэтиленом и полипропиленом, при этом они биосовместимы и биодеградируемы. Продукты разложения этих полиэфиров (углекислый газ и вода) нетоксичны. Они обладают устойчивостью к ультрафиолетовому излучению, высокими газобарьерными качествами, хорошей водостойкостью, теплоустойчивостью. В зависимости от состава сополимеров полиоксиалканоатов меняются их механические свойства [91]. В области тканевой инженерии полиоксибутираты используют, например, для изготовления пористых биорезорбируемых матриксов [92].

Альгиновая кислота представляет собой полисахарид, который получают из красных водорослей (Laminaria japonica Aresch). Альгиновая кислота — это вязкое вещество, не растворимое в большинстве органических растворителей; одна ее часть способна адсорбировать 300 массовых частей воды, поэтому она является хорошим загустителем [93]. Альгинат натрия, альгинат калия, альгинат кальция используют как пищевые добавки. В стоматологии альгинаты применяют в качестве эластичного слепочного материала. Неорганические наполнители (оксид цинка, тальк) составляют основную массу альгинатного порошка и влияют на вязкость материала и его прочность после затвердевания [87, 94]. Альгинаты используют в системах доставки биологически активных веществ [95], а также как инъекционные средства для доставки клеток и различных факторов, поскольку они позволяют формировать гидрогели при взаимодействии с двухвалентными и трехвалентными катионами (Mg²⁺, Ca²⁺, Ba²⁺, Sr²⁺, Al³⁺, Fe³⁺) [96, 97]. Альгинаты не содержат RGD-последовательность, поэтому адгезия клеток на их поверхность довольно низкая. Тем не менее пористые губки из альгината способствуют восстановлению нервной проводимости у крыс [96], а альгинатные матриксы — регенерации хрящевой ткани [98].

Каждый из полимеров далеко не универсален в применении. Например, полилактиды, полиамиды и полиуретаны хорошо подходят для изготовления протезов, медицинских принадлежностей; хитозан и коллаген наиболее пригодны в качестве дополнительных компонентов при формировании тканеинженерных конструкций; поликапролактон и полигликолевая кислота — для изготовления качественных шовных нитей.

Ценность фиброина шелка и спидроина заключа­ется в том, что они обладают свойствами, позволяющими им быть практически универсальными материалами для использования в тканевой инженерии, фармации, медицине независимо от вида конструкций (матриксы [99], пленки [100], шовные нити, микросферы, микроносители лекарственных препаратов). В отличие от большинства полимеров синтетического и природного происхождения изделия из фиброина шелка и спидроина имеют высокую нанопористость, столь важную для биологических свойств конечного изделия [101]. Они одновременно и биосовместимы, и биодеградируемы, обладают прочностью, оставаясь при этом относительно легкими в работе, не требуют добавления большого количества дополнительных материалов, чтобы создать изделие нужного формата. В отличие от полиоксибутирата и полигликолевой кислоты, которые в организме распадаются до углекислого газа и воды, продуктами распада фиброина шелка и спидроина являются аминокислоты, выступающие в качестве дополнительного строительного материала при регенерации ткани. Оба биополимера способствуют адгезии и пролиферации клеток на своей поверхности, чего не могут многие полимеры (например, альгинат). Модификация фиброина шелка и спидроина дополнительными химическими структурами усиливает эффективность их использования [102].

Технологии изготовления биополимерных конструкций

Существуют разные технологии изготовления трехмерных матриксов, каждая из которых имеет как достоинства, так и недостатки. Методика выбирается в зависимости от свойств материала, желаемых итоговых характеристик готовой конструкции и области ее применения.

Метод выщелачивания. В его основе лежит принцип выщелачивания, при котором из системы происходит вымывание одной из составляющих — поро­образователя, за счет чего и формируется пористая трехмерная структура матрикса. В качестве поро­образователя могут быть использованы как жидкие частицы, так и порошкообразные материалы: воск, соли (например, хлорид натрия, карбонат аммония) [103], сахар [8]; размер частиц порообразователя влияет на итоговый размер пор конструкции. К основным преимуществам метода можно отнести простоту, универсальность и удобство в контролировании размера и формы пор. Недостатком является ограниченность толщины конечной конструкции (до 3 мм), а также трудность формирования матриксов с гарантированной взаимосвязанностью пор [104].

Метод сублимации. Он заключается в том, что полимер растворяют в растворителе до образования требуемой концентрации, после чего раствор замораживают и удаляют растворитель путем лиофилизации под высоким вакуумом. При этом формируется высокопористый матрикс, обладающий внутренней взаимосвязанностью пор [105]. Размер пор можно регулировать скоростью замораживания и уровня pH; более быстрая скорость замораживания позволяет получать поры меньшего размера [106]. Одним из основных преимуществ метода является то, что он не требует ни высокой температуры, ни отдельного этапа выщелачивания. К его недостаткам следует отнести длительность процесса, а также получение пор только небольшого размера. Эта техника применима к различного рода полимерам, включая фиброин шелка, полигликолевую кислоту, полилактид [107].

Метод электроспиннинга. В его основе лежит процесс электроспиннинга, при котором происходит подача раствора полимера с одинаковой скоростью через иглу малого диаметра в пространство с электростатическим полем высокого напряжения, в результате чего на металлическом коллекторе формируются нити диаметром менее 1 мкм. К основным достоинствам метода относят возможность изготавливать матриксы с высоким соотношением поверхности и объема, ориентировать нити полимера, регулировать пористость матриксов и толщину волокон. Для данного метода подходит более двухсот полимеров, включая фиброин шелка [108], коллаген [109], хитозан [110], желатин [111].

Метод биопринтирования. В его основе лежит технология струйной печати, которая позволяет формировать 3D-структуры с заранее указанной морфологией. «Биочернилами» выступают живые клетки, белки, а в качестве «биобумаги» используют полимерную подложку, обеспечивающую существование сформированных структур и их стабилизацию [112]. В конце процесса применяется инкубатор, где при наличии определенных условий матрица фиксируется или происходит прорастание и пролиферация клеток, если было проведено биопринтирование клеточных структур. Метод биопринтирования не имеет недостатков в отличие от традиционных методов формирования матриксов, поскольку способен непосредственно задавать итоговую структуру изделия. Точность метода и его высокая воспроизводимость позволяют осуществлять послойную печать, а также наносить на получаемую конструкцию факторы роста и цитокины, которые нужны для адгезии клеток и их дифференцировки [113]. Таким образом, биопринтирование — наиболее современный, бесконтактный, недеструктивный метод, используемый для принтирования двухмерных и трехмерных структур послойно [114, 115].

Использование фиброина шелка и спидроина в тканевой инженерии и регенеративной медицине

Из регенерированного фиброина шелка Bombyx mori создают прочные и эластичные пленки, трехмерные матриксы и трубки. Исследования in vitro показали, что такие конструкции поддерживают адгезию и пролиферацию эукариотических клеток и их структура благоприятствует равномерному распределению пролиферирующих клеток как на поверхности, так и в толще матрикса. Эксперименты in vivo с подкожной имплантацией матриксов мышам продемонстрировали хорошую биодеградируемость конструкций из фиброина шелка и их способность подвергаться нео­васкуляризации [116]. Матриксы из рекомбинантного спидроина также показали свою совместимость с культурой клеток, обеспечили их адгезию и пролиферацию в течение долгого времени и обладали низкой иммуногенной активностью [117].

Регенерация костной ткани. Для устранения дефектов костной ткани A. Varkey с соавт. [118] изготовили три вида матриксов из фиброина шелка: с помощью электроспиннинга — нановолоконные матриксы, методом лиофилизации — губки и пористые пленки, которые изучались в качестве подложки для адгезии и пролиферации клеток остеокарциномы MG-63. Результаты исследований показали, что все три вида биоконструкций биосовместимы и способствуют прикреплению клеток.

S. Sangkert с соавт. [119] создали матриксы, модифицированные коллагеном и фрагментами децеллюляризованной ткани, методом замораживания–оттаивания. В ходе экспериментов выявлено, что такие матриксы являются перспективными для инженерии костной ткани и лечения расщелины неба («волчьей пасти»).

Матриксы из фиброина шелка с гидроксиапатитом применяли для адгезии и пролиферации остеокарциномы MG-63. W. Shao с соавт. [120] показали, что эти наноструктурированные конструкции обладают превосходными биомиметическими и механическими свойствами, поддерживают адгезию и пролиферацию клеток, функционально способствуют биоминерализации. Фиброиновые биомиметические матриксы с добавлением гидроксиапатита, состоящие из трех слоев: первого — хрящевого с продольно ориентированной структурой микротрубочек, второго — костного слоя с 3D-пористой структурой, промежуточного — с плотной структурой, могут эффективно поддерживать регенерацию хрящевой и костной ткани in vivo [121]. Эксперименты in vitro с композитными матриксами из фиброина шелка (40%) и хитозана (60%) с внутренней трехмерной пористостью более 90% показали, что такие конструкции поддерживают быструю адгезию, рост и пролиферацию клеток MG-63, обладают хорошей биосовместимостью и замедленной биоде­градацией, помогают клеткам выделять цитокины для построения внеклеточного матрикса [122]. При in vitro добавлении желатина и гидроксиапатита к матриксам из фиброина шелка увеличивается адгезия мышиных эмбриональных фибробластов и их пролиферация в 3D-культуре, поэтому многокомпонентные конструкции представляются перспективными в области регенеративной медицины, особенно при восстановлении костной ткани [123]. Матриксы из фиброина шелка и хитозана с добавлением сосудистого эндотелиального фактора роста способствуют пролиферации и активности эмбриональных человеческих остеобластов [124]. Волокнистые гидрогели из фиброина шелка и альгината натрия позволяют получить кристаллы гид­р­о­ксиапатита нужной морфологии для восстановления костной ткани [125].

Мембраны из биологически активного стекла и фиброина шелка способны поддерживать пролиферацию клеток и влиять на одонтобластическую дифференциацию зубных стволовых клеток пульпы человека. Такие мембраны могут использоваться в качестве тканеинженерного пленочного материала для регенерации пульпа–дентин комплекса [126].

Матриксы из стронций-легированного полифосфата кальция с добавлением допамина и фиброина шелка, имплантированные in vivo, эффективно ускоряют процесс минерализации и регенерации новой костной ткани у кроликов. Иммуногистохимическое исследование показало, что матриксы также усиливают секрецию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и главного фактора роста фибробластов (bFGF) [127].

Пористые матриксы из фиброина шелка формируют подходящую нишу, необходимую для поддержания длительного выживания и функционирования имплантированных стволовых клеток костного мозга крыс для регенерации костной ткани in vitro и in vivo [128].

Минерализованный фиброин шелка напоминает естественную костную структуру, клеточные и минеральные слои фиброина являются критически важными для регенерации костной ткани. В исследованиях отмечается, что способность содействовать спондилодезу усиливается, когда минерализованный фиброин шелка засевают стромальными клетками костного мозга [129].

Восстановление хрящевой ткани. Матриксы из фиброина шелка, содержащие механический фактор роста, трансформирующий фактор роста и стволовые клетки, способствуют регенерации суставного хряща in situ [130].

В исследовании V. Vishwanath с соавт. [131] показано, что наиболее подходящими для восста­новления ткани являются матриксы из фиброина шелка с добавлением хитозана в сочетании 4:1. Матриксы с таким соотношением компонентов в наибольшей степени способствуют адгезии, вы­жива­емости и пролиферации клеточных культур (на примере мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповинной крови), а оценка секреции гликозаминогликанов на матриксах свидетельствует об их способности ускорять регенерацию хрящевой ткани. Композитные матриксы из коллагена и фиброина шелка в соотношении 7:3 с добавлением микросфер из полилактида-ко-гликолида способствуют восстановлению суставного хряща и интеграции регенерирующей и окружающей ее хрящевой ткани. Эффективность этих конструкций подтверждена в экспериментах in vitro и in vivo при имплантации матриксов в искусственно созданный дефект суставного хряща у кроликов [132].

Ранозаживление. В экспериментах in vitro и in vivo с крысами продемонстрировано, что матриксы из фиброина шелка с добавлением желатиновых микросфер с инкапсулированным антибиотиком гентамицином обладают антимикробным действием, подавляют золотистый стафилококк, кишечную и синегнойную палочки. Такие конструкции способствуют постепенному высвобождению лекарственного вещества, хорошему ранозаживлению и потому эффективны для лечения глубоких инфицированных и тяжелых ожогов [133]. В экспериментах in vivo на крысах показано, что наноматриксы из фиброина шелка способствуют ускоренному заживлению ожоговой раны и быстрой эпителизации. Это подтверждено гистологическими исследованиями образцов ткани [134]. Патчи из фиброина шелка, полученные методом электроспиннинга и витализированные мезенхимальными стромальными клетками, взятыми из жировой ткани человека, использовали для регенерации кожи у мышей, больных диабетом. В invivo исследованиях установлено, что невитализированные патчи не менее эффективны для лечения диабетических ран, чем патчи с мезенхимальными клетками. Действие обоих патчей одинаково и включает главным образом стимулирование ангиогенеза и синтез коллагена. В то же время отмечается, что отсутствие клеток на фиброиновых патчах имеет значительные преимущества, так как снижает риск передачи мутантных клеток и стимуляцию иммунной системы. Кроме того, невитализированные патчи могут быть подготовлены заранее и длительно храниться. Это — важный шаг на пути успешного лечения язв у больных сахарным диабетом [135].

Мезенхимальные стволовые клетки человека, культивированные на гидрогеле из фиброина шелка с переменной жесткостью и фактором роста с целью их дифференциации в зрелые гладкомышечные клетки, доказали эффективность применения фиброина шелка для изготовления тканеспецифичных матриксов для клеток [136].

Высокопористые пленки из фиброина шелка, сформированные методом электроспиннинга, обеспечивают доставку кислорода к ране, поэтому их используют в качестве перевязочного материала. Средний диаметр нановолокон влияет на механические и биологические свойства изделий, что позволяет получать конструкции с необходимыми характеристиками [137].

Реконструкция связок. Матриксы из волокон регенерированного шелка с иерархической структурой, включающей нанофибриллы, микроволокна и пучки волокон, обладают механическими характеристиками, совпадающими со свойствами передней крестообразной связки. Тесты на биодеградацию показали, что матриксы теряют 8% массы после погружения в натрий-фосфатный буфер через 60 дней и 62% массы — при погружении в раствор протеазы актиномицетов на 48 ч. Авторы [138] сделали вывод, что благодаря иерархической структуре, механическим свойствам, высокой биосовместимости и биодеградируемости, матриксы из регенерированного шелка могут применяться для тканевой инженерии связок.

При покрытии искусственных связок из ПЭТФ фиброином шелка уменьшается их гидрофобность и повышается биосовместимость. Эксперименты in vitro показали, что на поверхности этих конструкций улучшается адгезия и пролиферация мышиных фибробластов по сравнению со связками, не модифицированными биополимером [139].

Матриксы, изготовленные из коллагеновых губок и фиброиновой вязаной сетки, способны имитировать компоненты связок. Эксперименты in vivo на кроликах показали, что данные матриксы подходят для реконструкции передней крестообразной связки у животных, в связи с чем обладают потенциалом для клинического применения [140].

Биодеградируемые гибридные нано- и микроматриксы, состоящие из скрученных нитей фиброина шелка, покрытых нановолокнами поли-3-гидроксибутирата или поликапролактона, способствуют адгезии и пролиферации мышиных фибробластов in vitro. Механические свойства гибридной структуры могут быть оптимизированы для регенерации различных естественных связок и сухожилий путем изменения количества крученых нитей фиброина [141].

Регенерация кровеносных сосудов. В экспериментах [142] показано, что фиброиновые матриксы с добавлением гепарина ингибируют пролиферацию гладкомышечных клеток человека, улучшают гемосовместимость, высвобождая гепарин в течение 7 дней, а также способствуют образованию новых сосудов при подкожной имплантации у крыс. Эти матриксы могут быть использованы в качестве потенциальных сосудистых имплантатов, поскольку обладают высокой степенью пористости (92%), хорошей совместимостью с кровью и легкостью изготовления.

Трубчатые матрицы из фиброина шелка, сформированные методом электроспиннинга, могут применяться для регенерации кровеносных сосудов малого диаметра. Эксперименты in vitro и in vivo на крысах показали, что эти матрицы имеют подходящие морфологические и механические свойства, они биодеградируемы и биосовместимы [143].

Сочетание пористых шелковых матриксов, содержащих в структуре каналы диаметром 254 мкм, и витализации эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVECs) способствует быстрой васкуляризации и интеграции в условиях in vivo. Полые каналы в матриксах улучшают пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека и формирование капилляроподобных трубок во время предварительной инкубации in vitro [144].

Мультифункциональный биоматериал из фиброина шелка с добавлением гепарина приводит к контролируемому высвобождению фактора роста эндотелия сосудов in vitro. Высвобожденный фактор функционально активен и способствует росту эндотелиальных клеток человека. Добавление низкомолекулярного гепарина к шелку повышает его гемосовместимость [145].

Двухслойные сосудистые матриксы малого диаметра из рекомбинантного паучьего шелка, поликапролактона, желатина и хитозана биосовместимы и биодеградируемы. Они имеют подходящую гидрофильность и гемосовместимость, способствуют адгезии и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток в условиях in vitro, а также при подкожной имплантации in vivo [146].

Искусственные протезы сосудов из фиброина шелка изучали в условиях in vitro и in vivo на крысах для оценки их острой и подострой гемосовместимости и сравнивали с коммерчески доступными трансплантатами из ПЭТФ. Результаты экспериментов подтвердили возможность использования фиброина шелка для регенерации сосудов [147].

Пленки и матриксы из фиброина шелка с добавлением N,N’-метиленбисакриламида не­раство­римы в воде и кислотах, обладают пористостью, обеспечивающей хорошие условия для культиви­рования клеток. Такие конструкции более совместимы с кровью по сравнению с пленками и матриксами из чистого фиброина. Они препятствуют свертыванию крови и адгезии тромбоцитов, поэтому являются идеальными кандидатами для применения в сосудистой хирургии [148].

Восстановление желудочно-кишечного и мочевыделительного трактов. Двухслойные матриксы из фиброина шелка поддерживают адгезию и пролиферацию эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта и гладкомышечных клеток человека, что подтверждено в экспериментах in vitro. Кроме того, матриксы способствуют дифференцировке первичных эпителиальных клеток пищевода человека в направлении супрабазального и поверхностного фенотипов. Планируется проведение экспериментов in vivo с применением этих матриксов для восстановления органов желудочно-кишечного тракта [149]. Покрытые фиброином шелка матриксы из полиэфир­уретана с наличием микроканалов в структуре и добавлением фактора роста эндотелия сосудов в значительной степени способствуют регенерации мышц пищевода, формируя нормальную гистологическую структуру [150].

Матриксы из фиброина шелка протестированы на экспериментальных моделях животных как средства для восстановления мочевого пузыря и уретры. Результаты показали высокую биосовместимость, биоразлагаемость и хорошую регенерацию гладких мышц и уротелия. Эти матриксы обладают необходимыми биомеханическими свойствами — прочностью и эластичностью [151].

Сетки из шелка паутины, полученные от Nephila edulis, поддерживают адгезию, выживаемость и рост первичных уротелиальных клеток человека без существенного изменения их свойств, что делает этот материал подходящим к испытанию его в доклинических исследованиях для реконструкции мочевого пузыря [152].

Пленки из фиброина шелка и кератина проявляют улучшенные механические свойства при добавлении к ним желатина. После смешивания с пероксидом кальция пленки создают высокий уровень кислорода на протяжении двух недель и способствуют усиленному клеточному росту. Такой биоматериал обладает антибактериальными свойствами. Эксперименты на животных показали целесообразность его применения для восстановления дефектов мочевыделительного тракта [153].

Регенерация нервной ткани. Волокна из регенерированного фиброина шелка с добавлением оксида графена являются биосовместимыми и обладают механическими свойствами, которые позволяют использовать их при изготовлении биоинженерных матриксов для восстановления костей, роста и регенерации нервной ткани. Такие матриксы могут служить электродным материалом для хранения энергии и быть биосовместимым субстратом для «электронной кожи» [154].

На основе матрикса из фиброина шелка и коллагена создан тканеинженерный нервный канал, на котором в качестве посевного клеточного материала совместно культивировали шванновские клетки и стволовые клетки жировой ткани. В экспериментах in vivo на крысах установлено, что такие конструкции улучшают регенеративную микросреду и ускоряют регенерацию периферических нервов [155].

Биоинженерная ткань из фиброина шелка и коллагена, представляющая собой пористую фиброиновую губку с предварительно посеянными на нее нейронами головного мозга крысы, погруженными в мягкую коллагеновую матрицу, способна имитировать нативную нервную ткань [156].

Биоинженерные нервные каналы из фиброина шелка и полилактида-ко-гликолида, полученные методом электроспиннинга, обладают высокой пористостью, гидрофильностью, жесткостью на растяжение и биосовместимостью. При in vitro и in vivo подкожной имплантации у кроликов происходит восстановление периферического нерва, что позволяет применять каналы в клинике [157].

Волокнистые мембраны из полилактида-ко-гликолида и фиброина шелка обладают высокой гидрофильностью. Натяжение нитей в таких конструкциях можно регулировать путем изменения процентного содержания белка. Лабораторные тесты показали, что при добавлении фиброина в изделие из полилактида-ко-гликолида повышается пролиферация нервных клеток. Мембраны, сформированные в нервный канал и имплантированные в дефект седалищного нерва мыши, способствовали более организованной и зрелой регенерации нерва [157].

Биодеградируемые носители клеточных культур и лекарственных веществ

Клеточные микроносители. Микроносители из рекомбинантного спидроина со сложной топографией поверхности обеспечивают эффективное культивирование первичных иммортализованных фибробластов. Эксперименты in vivo показали, что подкожные инъекции суспензии микрогеля в область кожной раны не приводят к развитию острого воспаления, при этом ускоряют регенерацию тканей у мышей, стимулируют нейрогенез и ангиогенез [158]. В целях повышения адгезии микроносители из водного раствора фиброина соединяют с желатином, гидрофильным биополимером с интегрин-распознающей RGD-последовательностью. Полученные биорезорбируемые микроносители поддерживают адгезию и пролиферацию 3T3-фибробластов мыши [159].

Композитные мембраны из фиброина шелка с добавлением ацетамида обладают хорошей совместимостью с клетками, необходимыми механическими свойствами, стабильной долговременной оптической прозрачностью и способствуют пролиферации роговичных стромальных клеток in vitro [160].

В условиях in vitro волокнистые сетки из рекомбинантного спидроина подходят для адгезии и роста кардиомиоцитов без дополнительного покрытия адгезивными факторами (например, фибронектином) [161].

Носители лекарственных веществ. Губки из фиброина шелка с добавлением желатина являются потенциальными носителями куркумина и докозагексаеновой кислоты, которые, высвобождаясь в организме, обеспечивают противоопухолевый эффект [162]. Биосовместимые и биодеградируемые микрокапсулы из фиброина шелка с добавлением поликапролактона, благодаря легко регулируемым размерам и проницаемости, представляют собой перспективные конструкции для использования в качестве интеллектуальных систем доставки лекарственных средств [163].

Микросферы из фиброина шелка — потенциальные объекты для доставки и высвобождения препаратов в организме [164]. Их морфология, размер и полидисперсность регулируются путем изменения молекулярной массы и концентрации фиброина шелка, а также ионной силы и pH буферного раствора. Многофункциональные микросферы из фиброина шелка с добавлением оксида железа эффективны в качестве носителей доксорубицина гидрохлорида (традиционного противоракового препарата) [165].

Монослойные и многослойные пленки из спидроина используют в фармацевтических и медицинских целях как матрицы для доставки лекарственных веществ с низкой и с высокой молекулярной массой, особенно в тех случаях, когда механическая прочность элюирующей матрицы имеет большое значение [166]. Биодеградируемые стержни из фиброина шелка являются перспективными биосовместимыми конструкциями для хранения и доставки анастрозола при лечении рака молочной железы. Эксперименты in vitro и in vivo показали, что они способствуют равномерному замедленному высвобождению препарата, при этом скорость зависит от размеров конструкции [167]. Наночастицы из фиброина шелка, в которые инкапсулирован антибактериальный препарат гентамицин, нанесенные на поверхность титана с целью достичь непрерывного высвобождения лекарственного препарата в условиях in vitro, повышают адгезию остеобластов, их пролиферацию и дифференцировку по сравнению с титановой поверхностью без покрытия. Такая технология обеспечивает более эффективный подход к лечению в области ортопедии и стоматологии [168]. Пористые матриксы из фиброина шелка и поливинилового спирта можно использовать в качестве раневого перевязочного материала благодаря низкой цитотоксичности и подходящему высвобождению загруженного в них потенциального лекарственного средства куркумина [169].

Микрочастицы фиброина шелка, сформированные распылением–высушиванием или распылением–лиофилизацией, подходят для направленной до­став­ки противоракового препарата Цисплатина путем ингаляции в легкие. Сшивание фиброина с генипином модифицирует высвобождение лекарст­венного средства, делая его более эффективным. Способность частиц образовывать аэрозоли позво­ляет проводить адекватную дисперсию и доставку вещества вплоть до нижних дыхательных путей [170].

Сферы из биоинженерного паучьего шелка используют в качестве средства для направленной противораковой терапии [171]. Они обеспечивают pH-зависимое высвобождение доксорубицина, не проявляют цитотоксического действия до загрузки лекарственного препарата.

В условиях in vivo при введении непосредственно в мембрану круглого окна уха морских свинок гидрогель из фиброина шелка и полиэтиленгликоля с загруженным в него дексаметазоном проявил себя как эффективное и безопасное средство для доставки и пролонгированного высвобождения глюкокортикоида во внутреннем ухе [172].

Раствор фиброина шелка с добавлением ри­бо­­фла­вина (в качестве фотоинициатора для ковалент­ного сшивания) образует прозрачный элас­тичный гидрогель, который может использоваться для изменения формы роговицы с целью восста­нов­ления остроты зрения [173].

Наносферы, состоящие из фиброина шелка и наноалмазов, применяют в качестве носителей лекарственных препаратов (например, доксорубицина). Высвобождение вещества контролируется с помощью измерения флюоресценции наноалмазов внутри сфер. Такие наносферы являются хорошими нанокомпозитными платформами для диагностических и терапевтических целей [174].

Заключение

Фиброин шелка и спидроин применяют в области биоинженерии и регенеративной медицины в качестве материалов для изготовления трехмерных матриксов, способствующих восстановлению поврежденных органов и тканей, для создания биодеградируемых носителей клеток и лекарственных препаратов. Они обладают уникальными свойствами, поэтому конструкции из этих двух биополимеров продолжают активно разрабатываться и изучаться.

Финансирование исследования. Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда (проект №15-15-00173).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.